생물공정 모니터링을 위한 광섬유 포도당 및 젖산 센서의 개발
정창환, 손옥재, 이종일*
Development of Optical Fiber Glucose and Lactate Biosensors for Bio- process Monitoring
Chang Hwan Jung, Ok-Jae Sohn, and Jong Il Rhee*
Received: 23 January 2017 / Revised: 16 March 2017 / Accepted: 23 March 2017
© 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
Abstract: In this work the optical fiber glucose and lactate biosensors were developed by using fluorescent dye and enz- yme immobilized on the end tip of an optical fiber. 3-Glycidy- loxypropyl)methyldiethoxysilane (GPTMS), (3-Aminopro- pyl) trimethoxysilane (APTMS) and Methyltrimethoxysilane (MTMS) were used to immobilize glucose oxidase (GOD), lactate oxidase (LOD) and ruthenium(II) complex (tris(4,7- diphenyl-1,10-phenanthroline) ruthenium(II), Ru(dpp)32+) as oxygen sensitive fluorescent dye. MTMS sol-gel was an excel- lent supporting material for the immobilization of Ru(dpp)32+, GOD, and LOD on the optical fiber. Storage stability of the optical fiber glucose sensor was kept constant over 20 days, while the optical fiber lactate sensor had constant storage sta- bility over 17 days. The optical fiber glucose and lactate bio- sensors also maintained good operational stability for 20 hours and 14 hours, respectively. The activities of the immobilized enzymes were most excellent at pH 7 and at 25oC. On-line mo- nitoring of glucose and lactate in a simulated process was per- formed with the optical fiber glucose and lactate biosensors.
On-line monitoring results were agreed with those of off-line data measured with high performance liquid chromatography (HPLC).
Keywords: Optical fiber biosensor, Glucose, Lactate, Fluores- cent dye, On-line monitoring, Enzyme immobilization
1. INTRODUCTION
효소, 항체 또는 세포 등과 같은 생물학적 인식요소 (biorec- ognition element)를 광섬유에 고정화하여 물질을 분석하는 광섬유 생물센서는 선택성과 특이성이 높아 환경 및 생물공 정 모니터링, 의료용 진단기기 등에서 많이 이용되고 있다 [1]. 즉, 분석물질을 신속하게 실시간으로 측정할 수 있을 뿐 만 아니라, 소형으로 제작이 용이하며 비침투 방식 (noninva- sive type)으로 생화학 물질을 검출할 수 있는 광섬유 생물센 서는 광섬유를 이용하여 검출신호를 빛의 형태로 전송함으 로써 분석환경 주위의 전자기적 영향을 받지 않고, 원거리 측 정이 가능하여 많은 분야에 응용할 수 있다 [2]. 또한, 생화학 반응에서 소모되는 산소농도를 측정하거나, 생성되는 이산 화탄소 또는 수소이온의 변화를 검출하는 광섬유 화학센서 를 기반으로 생체물질을 검출하기 위해 효소 또는 미생물을 고정화하여 광섬유 생물센서를 개발하는 연구가 Rosenzweig [3], Walt [4], Scheper [5] 등의 연구그룹에서 활발히 이루어지 고 있다. 특히, 루테늄 (ruthenium)이나 이리듐 (iridium)과 같은 전이금속 기반의 형광물질을 광섬유의 말단이나 고분자 지 지체에 고정화하여 용액내의 생화학 물질이 산화효소에 의 해 산화될 때 산소가 소모되는 반응 원리를 이용하여 물질을 분석하는 광섬유 생물센서에 대한 연구들이 수행되고 있다.
한편, 산소분압 측정에 의한 광학 센서가 1984년에 Uwira 에 의해 최초로 연구, 보고된 이후, 피하 조직에 직접 광섬유 포도당센서를 삽입하여 지속적으로 포도당 농도를 모니터링 하기 위해 소형화된 광섬유 포도당센서가 연구되었다 [6]. 그 리고 Li [7]와 Healey [8] 등은 산소와 포도당, 그리고 페니실 린의 농도를 모니터링 하는 광섬유 생물센서를 개발하기 위 해 고분자 매트릭스를 이용하기도 하였다. Alen [9] 등은 광 전남대학교 공과대학 화학공학부
School of Chemical Engineering, Research Center for Biophotonics, Chonnam National University, Gwangju 500-757, Korea
Tel: +82-62-530-1847, Fax: +82-62-530-0846 e-mail: [email protected]
Research Paper
섬유 말단에 형광검출 기반의 광학 산소센서막을 고정화한 후 그 표면 위에 포도당 산화효소 (glucose oxidase, GOD)를 고정화하였고, 그 위에 추가로 확산층을 고정화하여 피하조 직에서 지속적으로 포도당을 모니터링할 수 있는 소형화된 광학센서를 연구하였다.
젖산 검출용 생물센서는 젖산 산화효소 (lactate oxidase, LOD)에 의한 젖산의 산화반응으로부터 생성된 과산화수소 를 전류 검출 방식으로 측정한다. 전류 검출을 기반으로 만든 젖산 생물센서는 보조효소 (co-enzyme)와 안정한 지지체가 필요하며 고정화 효소의 안정성을 향상시키기 위해 광섬유 생물센서를 연구, 개발하였다. Sergei [10] 등은 산소검출용 형광염료 (루테늄 (II) 복합체)가 들어있는 실록산 필름과 지 방질 이중층으로 이루어진 세균성 세포막인 CPMs (cytopla- smic membranes)를 광섬유에 고정화하여 젖산을 검출하는 연구를 수행하였다. 또한, Stephen [11] 등은 혈액이나 뇌 그 리고 피부 중에 침체되어 있는 젖산을 감지하기 위해 광섬유 젖산센서를 사용하였다.
포도당 또는 젖산을 동시에 검출하는 광섬유 센서는 Chris- tophe [12] 등에 의해 광섬유 표면에 GOD와 LOD를 고정화하 였는데 형광 특성을 가지는 루미놀을 사용하여 포도당과 젖 산을 온라인 검출하는 연구를 하였다. Sohn [13] 등은 600 µm 의 광섬유 말단에 루테늄 (II) 복합체 (Ru(dpp)32+)와 투명한 실리콘을 톨루엔에 녹인 후 광섬유 말단에 피막을 형성하여 광섬유 산소센서를 제작한 후, 아크릴아마이드 레진접착제 또는 APTMS (3-aminopropyl-trimethoxysilane)로 처리하여 GOD 또는 LOD를 고정화하였다.
그러나 보건의료, 환경, 식품 등 다양한 산업 공정의 최적화 분야에 광섬유 포도당과 젖산 센서를 이용하기 위해 센서의 안정성 및 감도 향상을 위한 다양한 효소 고정화 방법과 검출 특성에 대한 체계적인 연구가 아직 이루어지지 않고 있다. 즉, 미량의 시료로도 정확한 분석이 가능한 광섬유 포도당 및 젖 산 센서를 생물공정 모니터링에 적용하는 연구는 아직 이루 어지지 않았다.
따라서 본 연구에서는 각종 실란계 물질을 이용하여 산소 검출용 형광염료 (루테늄 (II) 복합체, Ru(dpp)32+)와 GOD 또 는 LOD를 광섬유 말단에 안정하게 고정화한 방법 및 특성을 연구하고 포도당과 젖산 검출용 광섬유 센서를 개발하고자 한다. 즉, 실란계 졸-겔 용액으로 GOD 또는 LOD를 광섬유 말단에 고정화하는 최적의 방법과 개발된 광섬유 센서를 이 용하여 포도당과 젖산을 검출하는 연구를 하고자 한다. 그리 고 모사 생물공정에서 포도당과 젖산의 농도를 실시간 모니 터링하는 연구를 수행하고자 한다.
2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 시약 및 재료
본 연구에서 사용된 시료 및 완충용액 제조용 시약 등은 시그 마회사 (Sigma Co., USA)에서 구입하였다. 또한, 포도당 산화
효소 (glucose oxidase, GOD, from Aspergillus niger, 26.82 units/mg solid)와 젖산 산화효소 (lactate oxidase, LOD, from Pediococcus sp., 20 units/mg solid)는 시그마회사 (Sigma Co., USA)에서 구입하여 사용하였고, 산화효소를 고정화하기 위 해 사용된 실란류는 Methyltrimethoxysilane (MTMS)과 (3-Gly- cidyloxypropyl)methyldiethoxysilane (GPTMS), 그리고 (3-Ami- nopropyl)trimethoxysilane (APTMS)을 알드리치회사 (Aldrich Co., USA)에서 구입하여 사용하였다. 완충용액 제조용 시약 으로 인산염 (sodium phosphate, monobasic/dibasic, Duksan Co., Korea)을 사용하였고, 산소 검출용 형광염료로 루테늄 (II) 복합체 (tris(4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline) ruthenium (II), Ru(dpp)32+)는 Alfa aeser 회사 (Ward Hill, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
2.2. 광섬유 센서의 제작
포도당과 젖산 검출용 광섬유 센서를 제작하기 위해 먼저 다 양한 졸-겔을 제조한다. 졸-겔을 형성하기 위해 MTMS, GPTMS, APTMS, GA(GPTMS & APTMS) 용액을 제조하였 으며, 용매로는 99% 에탄올, 산 촉매로는 35% HCl을 사용하 였다. 우선, MTMS 졸-겔 용액의 혼합비율은 MTMS: 에탄올:
물: HCl = 7.94 mL: 3.68 mL: 4.32 mL: 0.04 mL이며, 혼합 후 실온에서 3시간 동안 교반하여 제조하였고, GPTMS 졸-겔 용 액의 혼합비율은 GPTMS: 에탄올: 물: HCl = 1.875 mL: 2.708 mL: 5.44 mL: 0.4 mL이며 혼합한 후 실온에서 2시간 동안 교 반하여 제조하였다. 그리고 APTMS 졸-겔 용액의 혼합비율 은 GPTMS 졸-겔 용액의 혼합비율과 같고 GA 졸-겔 용액의 혼합비율은 GPTMS: APTMS: 에탄올: 물: HCl = 1.25 mL:
0.625 mL: 2.708 mL: 5.44 mL: 0.4 mL로 혼합한 후 실온에서 2시간 동안 교반하여 형광염료 (Rudpp), GOD와 LOD를 고정 화하는데 사용하였다.
광섬유 센서에 GOD를 고정화하기 위해 본 연구에서는 두 가지 효소 고정화 방법을 적용하였다. 즉, 1) MTMS 졸-겔 용 액에 Ru(dpp)32+를 혼합하여 광섬유에 고정화한 후 GPTMS, APTMS 또는 GA(GPTMS+APTMS) 졸-겔 용액을 각각 코팅 하여 건조시킨 후 공유결합에 의해 GOD를 고정화하는 방법, 2) MTMS 졸-겔 용액에 Ru(dpp)32+와 GOD를 같이 혼합하여 광섬유 말단에 효소를 포괄하여 고정화하였다. 각각의 효소 고정화 방법에 사용된 형광염료인 Ru(dpp)32+는 졸-겔 용액 1 mL 당 10 mg으로 하였고, 사용된 GOD는 100-2,000 unit으로 하여 포도당 검출 특성을 조사하였다. 효소 GOD의 공유결합 에 의한 광섬유 포도당센서를 제작하기 위해 직경 2 mm의 플 라스틱 광섬유 말단 부분에서 클래드 (clad)층은 남겨놓고 피 복을 30 mm 정도를 벗겨낸 후 말단을 투명하게 연마하고 연 마된 광섬유 말단에 MTMS 졸-겔 용액에 혼합된 Ru(dpp)32+
를 코팅한 후 실온에서 24시간 동안 건조하였다. 한편, Ru (dpp)32+가 코팅된 MTMS 졸-겔막 위에 GPTMS 졸-겔 용액, APTMS 졸-겔 용액 또는 GA 졸-겔 용액을 코팅하여 광섬유 말단에 에폭시기 또는 아미노기가 형성되도록 하였다. 즉, 에 폭시기 또는 아미노기, 그리고 에폭시와 아미노 기능기를 동
시에 가지는 광섬유 말단에 GOD를 공유결합하여 광섬유 포 도당센서를 제작하였다. 효소 GOD의 고정화 조건은 일정한 농도의 GOD를 인산완충용액 (0.1 M, pH 5.5)에 용해한 후, 광섬유 말단을 효소용액에 담궈 실온 또는 4oC에 24시간 동 안 반응시켰다. 또한, MTMS 졸-겔 용액을 이용하여 Ru(dpp)32+
와 GOD를 함께 포괄하여 고정화 제작한 광섬유 포도당센서 의 경우에는 연마된 플라스틱 광섬유 말단 부분에 MTMS 졸- 겔 용액, Ru(dpp)32+와 일정량의 GOD를 혼합한 후 코팅하여 실온과 4oC에서 24시간 동안 건조하여 제작하였다. 두 가지 방법으로 제작된 광섬유 포도당센서는 인산완충용액 (0.1 M, pH 7.0)에 넣어 4oC에 냉장 보관하여 사용하였다.
또한, 광섬유 젖산센서의 경우에도 광섬유 포도당센서와 같이 두 가지 방법으로 LOD를 고정화하여 제작하였다. 효소 의 고정화량에 따른 광섬유 젖산센서의 검출특성을 조사하 기 위해, 효소 LOD의 고정화량을 50, 100, 200 unit으로 하여 광섬유 말단에 고정화하였다. 효소를 제외한 다른 고정화 방 법은 광섬유 포도당센서와 같이 하였고 실험방법도 동일한 방식으로 하였다.
2.3. 고정화 효소의 특성
광섬유 포도당센서와 젖산센서의 성능은 고정화 효소의 활 성도와 검출기의 검출한계에 크게 의존한다. 즉, MTMS 졸- 겔 용액에 Ru(dpp)32+를 혼합하여 광섬유에 고정화한 후 GPTMS, APTMS, GA 졸-겔 용액에 공유결합에 의해 고정화 된 GOD 또는 LOD, 그리고 MTMS 졸-겔 용액에 의해 포괄 고정화된 Ru(dpp)32+와 GOD 또는 LOD의 활성도는 시료의 고정화량, 용액 온도 및 pH 등에 따라 변화할 수 있다 [14]. 따 라서 본 연구에서는 광섬유 포도당센서 와 젖산센서에 사용 된 효소의 고정화 방법에 따른 고정화 효소의 특성을 조사하 였다. 두 가지 효소 고정화 방법으로 제작된 광섬유 포도당센 서와 젖산센서의 성능을 조사하기 위해 포도당 농도 (0~1.0 g/L)와 젖산 농도 (0~1.0 g/L)에서 포도당 및 젖산의 검출 시
험을 실시하였다. 본 실험에 사용된 GOD와 LOD의 양은 1,000 unit와 100 unit으로 각각의 고정화 방법에 동일하게 적 용하였으며, 효소는 인산완충용액 (0.1 M, pH 5.5)에 용해하 여 사용하였다.
광섬유 포도당센서 및 젖산센서의 표면특성을 확인하기 위 해 광섬유 말단이 연마된 표면, 연마된 광섬유 말단에 MTMS 졸-겔 용액을 코팅한 표면, 연마된 광섬유 말단에 MTMS 졸- 겔 용액과 Ru(dpp)32+를 혼합하여 코팅한 표면, 그리고 연마 된 광섬유 말단에 MTMS 졸-겔 용액과 Ru(dpp)32+, GOD 또는 LOD를 혼합하여 코팅한 표면을 전자현미경 (FE-SEM, Field Emission Scanning Electronic Microscope, JEOL., Co, Japan) 을 이용하여 관찰하였다.
2.4. 광섬유 포도당센서 및 젖산센서 시스템 및 특성 본 연구에서 사용된 광섬유 포도당센서와 젖산센서의 시스 템 구성은 광원과 광 검출기 (M-FOS, B&P Tech Co., Korea), GOD 또는 LOD가 고정화된 광섬유 센서부 그리고 광섬유 연 결부로 구성하였다 (Fig. 1). 한편, 광섬유 말단에 사용한 형광 물질인 루테늄 복합체 (Ru(dpp)32+)는 470 nm의 여기파장 (ex- citation wavelength)과 590 nm의 발광파장 (emission wave- length)에서 형광을 발생하며 산소농도가 증가함에 따라 형광 세기가 감소한다. 따라서 포도당 (젖산) 산화효소에 의한 반 응에서 포도당 (젖산) 농도가 증가하면 산소의 소비량도 증가 하므로 Ru(dpp)32+의 형광세기는 감소하여 이를 검출하여 포 도당 농도를 측정한다. 또한 광섬유 포도당센서 및 젖산센서 로부터 얻어지는 데이터를 저장하기 위해 광섬유 센서 시스 템과 PC를 연결하여 사용하였다. 광섬유 센서의 여기광원으 로 사용된 LED는 470 nm의 빛을 방출하는 고휘도 청색 LED 이며, 광 검출기는 실리콘 포토다이오드로 구성되었다. 또한, 광원과 광 검출부로 각각 연결되어 있는 직경 2 mm의 두 가 닥 광섬유를 광섬유 연결부와 같이 직경 3 mm 광섬유에 모아 서 접합시키고 반대쪽에는 광학 센서막을 지닌 한 가닥의 직경
Fig. 1. Schematic setup for optical fiber glucose and lactate biosensors with GOD(or LOD)-immobilized fiber tips.
2 mm인 단일모드 광섬유를 접합시켜 시스템을 구성하였다.
광섬유 포도당센서와 젖산센서의 저장 안정성 및 조작 안 정성을 연구하였다. 우선, 광섬유 센서의 저장 안정성을 조 사하기 위해 제작된 센서는 4oC의 인산완충용액 (0.1 M, pH 7.0) 내에 보관하여 사용하였는데, 포도당 및 젖산 시료를 30 일 동안 매일 1회씩 반복 측정하여 광섬유 산소센서 말단에 고정화된 GOD와 LOD의 활성을 초기 효소활성 (센서 신호 값)과 비교하였다.
또한, 광섬유 포도당센서와 젖산센서의 연속 측정 가능성 (조작 가능성)을 고찰하기 위해 0.5 g/L의 포도당 및 젖산 시 료를 24시간 동안 연속적으로 측정하는 실험을 실시하였다.
실험용기 내의 시료인 포도당 과 젖산이 고르게 혼합되도록 잘 교반하면서 측정하였고 센서의 신호 (즉, 고정화 GOD 와 LOD의 활성)를 초기 센서 신호 값 (초기 효소활성)과 비교하 였다.
2.5. 포도당과 젖산의 온라인 모니터링 및 오프라인 분석 본 연구에서 제작된 광섬유 센서의 생물공정 모니터링에의 적용 가능성을 연구하기 위해 실시간으로 변화하는 포도당 및 젖산의 농도를 연속적으로 모니터링하는 모사공정 실험 을 실시하였다. 초기 공정에 200 mL의 인산완충용액 (0.1 M, pH 7.0)을 주입하여 모니터링 실험을 시작하였다. 모니터링 실험과 함께 연동펌프를 이용하여 1 mL/min의 유속으로 2 g/
L의 포도당 용액 또는 젖산 용액을 공정에 각각 주입하고, 동 시에 같은 유속으로 시료를 외부로 배출하면서 시료내의 포 도당 또는 젖산을 광섬유 센서로 연속 모니터링하였다 (Fig.
2). 포도당 또는 젖산의 온라인 모니터링 결과를 오프라인 결 과와 비교하기 위해 30분마다 공정에서 시료를 채취하였다.
광섬유 포도당센서에 의한 모사공정내 포도당의 온라인 모 니터링 결과와 비교하기 위해 오프라인 시료를 HPLC (High Performance Liquid Chromatography: Shimadzu SPD-10A RID detector, Sugar pack: Shodex KS-801 series Column at 60oC, a
carrier solution of pure water with 0.5 mL/min, sample injection volume of 20 µL)로 분석하여 비교하였다. 그리고 젖산의 온 라인 모니터링 결과를 오프라인 시료와 비교하기 위해 HPLC (Shimadzu SPD-10Avp UV detector at 210 nm, C18: Aminex HPX-87H ion-exclusion column at Room temperature, a carrier solution of 20 mM NaH2PO4 (pH 2.7) with 1 mL/min, sample injection volume of 20 µL)를 사용하였다.
3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 고정화 효소의 특성
3.1.1. 효소의 고정화 방법에 따른 특성
실란계 물질인 GPTMS, APTMS, GA 그리고 MTMS 졸-겔 용 액을 이용해 공유결합과 포괄법으로 포도당 산화효소 (GOD) 를 고정화하여 제작된 광섬유 포도당센서의 포도당 검출특 성을 조사하였다 (Fig. 3(a)). 센서말단에 MTMS 졸-겔 용액에 의해 Ru(dpp)32+를 우선 고정화한 후 추가로 GPTMS 졸-겔막 을 형성하여 GOD를 공유결합시킨 센서의 경우, 0~1.0 g/L의 포도당 농도에서 보정곡선 (calibration curve)의 선형성은 회 귀계수 (regression coefficient, R2)값이 0.945로 낮은 값을 나타 냈다. 센서말단에 Ru(dpp)32+를 MTMS 졸-겔 용액으로 코팅한 후 추가로 GA 졸-겔막을 형성한 경우, 0~0.3 g/L의 포도당 농 도까지는 농도에 대한 센서 신호의 기울기인 감도 (sensitivity) 가 높았지만 0.3 g/L 이상의 포도당 농도에서는 농도에 따른 센서 신호의 변화가 거의 없었다. 또한, 센서 말단에 Ru(dpp)32+
를 MTMS 졸-겔 용액으로 코팅한 후 추가로 아미노기를 가진 APTMS 졸-겔막에 GOD를 공유결합 시킨 경우에는 0~1.0 g/
L의 포도당 농도에서 선형 보정곡선의 R2 값은 0.990으로 매 우 높았지만 센서의 감도는 0.078로 낮았다. 한편, MTMS 졸- 겔 용액에 형광염료 (Ru(dpp)32+)와 GOD를 함께 포괄하는 방 법으로 고정화한 광섬유 포도당센서의 경우에는 0.989의 회
Fig. 2. Simulated process for on-line monitoring of glucose or lactate with optical fiber glucose and lactate biosensors.
귀계수값과 0.225의 감도값을 보여 우수한 성능을 보였다. 따 라서 이후의 실험에서는 MTMS 졸-겔 용액을 이용하여 GOD 를 포괄하는 방법으로 고정화하여 광섬유 포도당센서를 제 작하여 사용하였다.
광섬유 젖산센서에 대해서도 마찬가지로 센서말단에 Ru (dpp)32+를 MTMS 졸-겔 용액으로 코팅한 후 추가로 GPTMS, APTMS, GA 졸-겔 용액을 사용하여 LOD를 공유결합법으로 고정화하거나, 센서말단에 MTMS 졸-겔 용액을 사용하여 Ru (dpp)32+와 LOD를 포괄법으로 고정화하여 제작하였고 젖산 검출특성을 조사하였다 (Fig. 3(b)). GPTMS 졸-겔막 위에 LOD 를 공유결합시킨 광섬유 젖산센서의 경우, 보정곡선의 선형 구간이 0~0.6 g/L으로 선형성은 0.968의 낮은 회귀계수값을 나타냈다. GA 또는 APTMS 졸-겔막을 사용한 경우에는 센서 이용시 고정화한 효소가 쉽게 분리되어 젖산의 측정이 이루 어지지 않음을 볼 수 있었다. 그러나 MTMS 졸-겔 용액에 Ru (dpp)32+와 LOD를 함께 포괄하는 방법으로 고정화한 광섬유 젖산센서는 0~1.0 g/L의 젖산농도에서 0.996의 회귀계수값을 가진 보정곡선을 얻을 수 있었고 0.236의 감도값을 보여 센서 로 사용하기에 적합하였다. 따라서 광섬유 젖산센서도 MTMS 졸-겔 용액에 Ru(dpp)32+와 LOD를 포괄하는 방법으로 고정화 하여 제작하였다.
3.1.2. 효소의 고정화 조건에 따른 특성
효소를 이용한 생물센서의 개발에서 사용하는 효소의 활성 을 안정적으로 높게 유지시키는 것이 매우 중요하다. 광섬유 포도당센서를 제작하기 위해 GOD를 광섬유 말단에 고정화 할 때 사용되는 효소용액의 최적 pH를 조사하였다. 인산완 충용액을 1 M HCl 또는 2 N NaOH 용액으로 pH 5.5에서 pH 9.0으로 조절한 후 적절한 양의 GOD를 용해하여 센서 말단 에 고정화하였다. Fig. 4(a)에서 보는 바와 같이 GOD를 고정 화할 때 효소용액의 pH는 5.5에서 보정곡선의 높은 선형 회
귀계수 (R2=0.985)값과 감도를 나타냈다. 따라서 이후의 실 험에서 광섬유 포도당센서에 GOD를 고정화할 때 효소용액 을 pH 5.5로 조절하여 사용하였다. 광섬유 젖산센서를 개발 하기 위해 LOD를 고정화하는 경우에도 인산완충용액의 pH 를 pH 5.5에서 pH 9.0로 제조한 후 적절한 양의 LOD를 용해 하여 고정화 실험에 사용하였다. Fig.4b에서 LOD를 고정화 할 때 효소용액의 pH는 7.0에서 보정곡선의 높은 선형 회귀 계수 (0.982)값 과 감도를 나타냈다. 따라서 이후의 실험에서 광섬유 젖산센서에 LOD를 고정화할 때 효소용액을 pH 7.0 으로 제조하여 사용하였다.
한편, 효소반응에서 사용하는 효소의 양에 따라 검출범위 와 검출감도가 다르므로 고정화에 사용되는 효소의 최적량 (농도)을 조사하였다. 광섬유 포도당센서를 제작하기 위해 GOD를 100 unit에서 2,000 unit까지 변화하여 고정화 실험을 하였는데 센서의 감도 (기울기), 선형검출구간 및 선형곡선 의 회귀계수값 (R2)을 Table 1에 나타냈다. 선형검출구간에서 의 보정곡선식 (calibration curve)은 포도당 또는 젖산의 농도 에 따른 센서의 전기적 신호값 (voltage)을 이용하여 기울기 와 회귀계수값을 계산하였다. 우선, 200 unit의 GOD를 고정 화하였을 때 가장 높은 감도를 보였으나 선형구간이 0.1~0.3 g/L로 낮게 나타났으며 R2값이 0.873으로서 매우 낮았다. 반 면, GOD의 고정화량이 1,000 unit인 경우, 0.273의 감도와 0~
1 g/L의 선형구간 그리고 0.985의 R2값을 보였으므로 광섬유 포도당센서의 제작에는 1,000 unit의 GOD를 고정화에 사용 하였다. 광섬유 젖산센서의 제작을 위해 사용되는 LOD의 고 정화량을 50, 100, 200 unit으로 달리하여 센서의 감도(기울 기), 선형검출구간 및 선형곡선의 회귀계수값 (R2)을 조사하 였다. Table 2에서 50 unit의 LOD를 고정화한 광섬유 젖산센 서는 측정이 어려웠으며, 100 unit의 LOD를 고정화한 경우에 는 선형구간이 0~1.0 g/L이며, 특히 R2값이 0.993으로 매우 높 았다. 반면, LOD의 고정화량이 200 unit인 경우, 0~0.5 g/L의 Fig. 3. Response of the optical fiber glucose and lactate biosensor with GOD or LOD immobilized on different sol-gel matrix (M-G(GOD/
LOD): MTMS(Ru(dpp)32+)+GPTMS+GOD/LOD, M-A(GOD/LOD): MTMS(Ru(dpp)32+) +APTMS+GOD/LOD, M-GA(GOD/LOD):
MTMS(Ru(dpp)32+)+GA+GOD/LOD, M(GOD/LOD): MTMS(Ru(dpp)32++GOD/LOD)).
선형구간과 0.047의 낮은 감도, 그리고 0.991의 R2값을 나타 냈다. 따라서 광섬유 젖산센서의 제작에는 100 unit의 LOD를 고정화하여 사용하였다.
또한, 광섬유 말단에 효소를 고정화할 때 고정화 온도의 영 향을 연구하였는데, GOD와 LOD를 고정화한 후 실온 (약 20
oC 정도)과 4oC에 저장한 후 고정화된 효소의 특성을 조사하 였다 (Fig. 5). 먼저, MTMS 졸-겔 용액, Ru(dpp)32+와 1,000 unit 의 GOD를 혼합한 용액을 광섬유 말단에 코팅한 후 4oC와 실 온에 24시간 동안 건조하였는데, 실온에 건조한 광섬유 포도 당센서가 안정성 및 검출성능에서 높았다. 그러나 MTMS 졸- 겔 용액, Ru(dpp)32+와 100 unit의 LOD를 혼합한 용액을 광섬 유 말단에 코팅한 광섬유 젖산센서는 4oC와 실온에 24시간 동안 건조하였을 때 4oC에서 건조한 센서가 안정성과 검출성 능이 높았다.
3.1.3. 고정화 효소막의 표면 특성
매끄럽게 연마된 광섬유 말단을 MTMS 졸-겔 용액으로 코팅
하면 매끄러운 면이 형성된다 (Fig. 6(a)). MTMS 졸-겔 용액 에 10 mg/L의 Ru(dpp)32+를 혼합한 후 광섬유 말단에 코팅한 경우에도 Ru(dpp)32+가 광섬유 말단에 고르게 분포하여 표면 이 평평하게 코팅된 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 6(b)). 또한, MTMS 졸-겔 용액, Ru(dpp)32+와 GOD 또는 LOD를 혼합하여 연마된 광섬유 말단에 코팅한 표면을 Fig. 6(c)와 6(d)에 나타 냈다. GOD와 LOD가 고정화된 광섬유 말단의 이미지 (Fig.
6(c), 6(d))는 효소가 고정화되지 않은 이미지 (Fig. 6(a), 6(b)) 와 다르게 표면 상태가 원형 돌기의 굴곡이 관찰되었으며 평 평하지 못하였다. Fig. 6(c)와 6(d)의 광섬유 말단의 이미지에 서 표면에 볼록한 현상이 나타나는 것은 효소의 재결정화가 MTMS 졸-겔 용액내에서 일어난 것으로 보이며 특히, 흰색으 로 보이는 부분이 고정화된 GOD 및 LOD로 생각된다 [17].
3.1.4. 효소의 반응속도 상수
제작된 광섬유 포도당센서와 젖산센서에 고정화된 효소의 최대 반응속도 (Vmax)값과 Michaelis-Menten 상수 (Km)값을 Fig. 4. Effects of buffer pH on the immobilization of GOD and LOD onto the end tip of an optical fiber.
Table 1. Characteristics of the optical fiber glucose biosensor with respect to amounts of immobilized GOD (sensitivity, linear detection range and regression coefficient of linear calibration curve (R2))
Immobilized GOD (unit) Sensitivity (slope) Linear detection range Regression coefficient (R2)
100 0.22782 0.1~0.5 0.85672
200 0.29973 0~0.3 0.87382
500 0.20445 0~0.7 0.96921
1000 0.273 0~1 0.98547
1500 0.07891 0~0.6 0.99068
2000 0.16073 0~0.3 0.86325
Table 2. Characteristics of the optical fiber lactate biosensor with respect to amounts of immobilized LOD (sensitivity, linear detection range and regression coefficient of linear calibration curve (R2))
Immobilized LOD (unit) Sensitivity (slope) Linear detection range Regression coefficient (R2)
50 -0.00791 - -0.49081
100 0.08545 0~1 0.9935
200 0.04745 0~0.5 0.99171
Lineweaver-burk plot을 이용하여 계산하였다 (Table 3). 또한, 0~1 g/L 농도의 포도당 및 젖산 시료를 사용해 고정화되지 않 은 1,000 unit의 GOD와 100 unit의 LOD의 Vmax값과 Km값
을 계산하였다. Table 3에서 고정화된 GOD와 LOD의 Km값 은 고정화하지 않은 GOD 및 LOD의 Km값에 비해 높은데, 이는 효소의 기질에 대한 친화도 (affinity)가 낮아져 더 많은 Fig. 5. Effects of buffer temperature on the immobilization of GOD and LOD onto the end tip of an optical fiber.
Fig. 6. Images of Scanning Electron Microscope(SEM) (a) Surface of the end tip of the optical fiber coated with MTMS sol-gel (b) Surface of the end tip of the optical fiber coated with MTMS sol-gel and Ru(dpp)32+, (c) Surface of the end tip of the optical fiber immobilized with MTMS sol-gel, Rudpp and GOD, (d) Surface of the end tip of the optical fiber immobilized with MTMS sol-gel, Ru(dpp)32+ and LOD.
Table 3. Kinetic parameters for immobilized GOD and LOD
GOD Immob. GOD LOD Immob. LOD
Km (mM) 20.40 31.25 35.7 40
Vmax (mM/min/mg protein) 1.0257 0.015 34.24 0.416
포도당 또는 젖산을 필요로 한다는 것을 의미한다. 최대 반응 속도 (Vmax)는 광섬유 표면에 효소를 고정화하였을 경우가 고정화하지 않았을 때보다 매우 낮은데 이는 광섬유 말단에 고정화된 효소의 양이 매우 적고 고정화된 효소의 반응에서 물질전달 저항이 크다는 것을 의미한다.
3.2. 광섬유 포도당센서와 젖산센서의 특성 3.2.1. 센서의 저장 안정성
개발된 광섬유 센서의 저장 안정성을 확인하기 위해 30일 동 안 매일 1회씩 포도당 또는 젖산 검출 실험을 하였다 (Fig. 7).
광섬유 포도당센서에서 GOD를 고정화한 후, 초기 측정한 센 서 신호값을 100%로 하였을 때 약 20일까지는 초기값을 거 의 유지하였다. 그러나 20일 이후부터는 고정화 GOD의 활성 이 조금씩 저하하여 30일에는 광섬유 산소센서 말단에 고정 화된 GOD의 활성은 초기 센서신호값의 약 90%를 유지하였 다. 이와 같이 센서에 고정화된 GOD의 활성이 시간이 경과 함에 따라 낮아지는 이유는 센서를 반복적으로 사용함에 따 라 MTMS 졸-겔막 표면에 부착되어 있던 GOD가 떨어져 나 간 것으로 생각된다. 광섬유 젖산센서에서도 약 17일까지는 고정화된 LOD의 초기 활성을 유지하였고 17일 이후부터는 LOD의 활성이 조금씩 저하하여 30일에는 센서 말단에 고정 화된 LOD의 활성은 초기 센서신호값의 90%를 유지하였다.
3.2.2. 센서의 조작 안정성
광섬유 포도당센서의 조작 안정성을 확인하기 위해 0.5 g/L 의 포도당 시료를 24시간 연속적으로 측정하였다 (Fig. 8). 초 기 (0시간)에 측정한 센서의 신호값을 100%로 하였을 때 약 14시간까지는 초기값의 98% 이상을 유지하였다. 그러나 14 시간 이후부터는 광섬유 센서의 말단에 고정화된 GOD의 활 성이 저하하여 24시간에 이르러서는 초기 센서값의 87%까 지 낮아지는 것을 확인하였다. 이러한 감소는 광섬유 말단에
고정화된 형광염료 (Ru(dpp)32+)의 형광세기 감소 때문에 의 한 것이라기보다는 고정화된 GOD의 활성이 시간이 지남에 따라 낮아졌기 때문인 것으로 생각된다.마찬가지로 광섬유 젖산센서는 0.5 g/L의 젖산 시료를 이용하여 24시간 측정하 였고, 초기에 측정한 센서의 신호값을 100%로 하였다. Fig. 8 에서 약 20시간까지는 초기 센서값의 99% 이상을 유지하였 으나 20시간 이후부터는 센서의 말단에 고정화된 LOD의 활 성이 서서히 저하하여 24시간 후 초기 센서값의 97%를 유지 하였다. 시료를 측정하는 시간이 경과할수록 광섬유 센서 말 단에 고정화된 효소의 활성이 낮아지는 것은 교반에 의해 난 류 흐름으로 고정화 효소와 시료와의 격렬한 접촉이 이루어 져 고정화되었던 효소가 점차 분리되기 때문인 것으로 생각 된다.
3.2.3. 센서의 pH 영향성
효소 GOD는 pH 5.5에서 최대 활성을 갖는 반면 [14], LOD는 pH 4.5에서 최대 활성을 갖는 것으로 알려져 있다 [15]. 본 연 구에서 광섬유 말단에 MTMS 졸-겔 용액에 의해 고정화된 GOD와 LOD의 최대 활성을 나타내는 분석 시료의 pH를 pH 3에서 pH 10의 범위에서 조사하였다. 각 pH 용액에 첨가된 0.5 g/L의 포도당 및 젖산 시료를 광섬유 센서와 광섬유 젖산 센서로 측정하였을 때 pH 7에서 가장 높은 센서 신호를 얻어 낼 수 있었다 (Fig. 9). 즉, 고정화된 GOD와 LOD의 최적 pH 는 산성영역 (pH 4.5~5.5)에서 중성영역 (pH 7.0)으로 이동함 을 알 수 있었다. 산소전극 생물센서를 이용하여 포도당, 젖 산 및 에탄올을 동시에 검출하는 이전의 연구에서 고정화된 GOD와 LOD의 최적 pH는 각각 pH 5.1과 pH 6.5를 나타냈다 [14]. 그리고 나일론 막 (nylon membrane)를 이용하여 글루타 르알데히드로 GOD와 LOD를 고정화한 센서막에서 최적 pH 는 각각 pH 5.5 와 pH 7.0 정도였다 [16]. 그러나 본 연구에서 효소 (GOD와 LOD)를 고정화함으로써 효소의 최적 pH가 중 Fig. 7. Storage stability of the optical fiber glucose and lactate bio-
sensors.
Fig. 8. Operational stability of the optical fiber glucose and lactate biosensors.
성 영역으로 변화하였지만, 젖산의 검출성능은 pH 4.0와 pH 7.0에서 큰 차이가 나지 않음을 볼 수 있었다 (대략 5 % 정도).
3.2.4. 센서의 온도 영향성
미생물 유래 효소의 활성은 온도에 크게 의존하며 미생물의 최적 배양온도에서 최대 활성을 나타내는 것으로 알려져 왔 다. 전극 생물센서를 이용하여 포도당, 젖산 및 에탄올을 분 석할 수 있는 효소센서의 최적온도를 알아보기 위해 15oC에 서 45oC까지 5oC 간격으로 용존산소 변화량을 비교하였는데, 40oC에서 효소활성이 가장 뛰어남을 보였다 [16]. 따라서 본 연구에서도 고정화된 GOD와 LOD에 영향을 미치는 인자 중 의 하나인 시료의 온도에 따른 효소의 활성변화를 조사하였 다. 광섬유 포도당센서 와 젖산센서를 이용하여 0.5 g/L의 포
도당과 젖산 시료를 4oC에서 40oC까지 변화시키면서 측정하 고 센서의 신호값을 비교하였다 (Fig. 10). 광섬유 포도당센서 는 시료의 온도가 25oC가 되었을 때 가장 큰 센서 신호값을 얻어낼 수 있었으며, 4oC에서 약 20oC까지 온도가 증가하더 라도 신호의 변화는 크게 변하지 않는 것을 알 수 있었다. 그 러나 25oC 이상에서는 온도가 증가함에 따라 센서신호가 급 격하게 감소되었다. 또한, 광섬유 젖산센서도 4oC에서 25oC 까지 온도가 증가하는 동안 센서의 신호값이 증가하였지만, 25oC 이상에서는 센서 신호값이 급격히 감소함을 보였다.
Kim 등 [17]의 연구에서 고정화된 LOD의 최적온도는 40oC 였는데, 고온에서는 효소막의 안정성에 문제가 있고, 낮은 온 도에서는 포화 용존산소량이 증가하여 시료 측정에 한계가 있으므로 35oC에서 젖산 시료를 측정하였다. 본 연구에서 개 Fig. 9. Effects of sample pH on the performance of the optical fiber
glucose and lactate biosensors during measurement of 0.5 g/L glu- cose and lactate (100 % = pH 7.0).
Fig. 10. Effects of sample temperature on the performance of the optical fiber glucose and lactate biosensors during measurement of 0.5 g/L glucose and lactate.
Fig. 11. On-line monitoring of glucose and lactate in simulated processes and comparison of the results with HPLC off-line data.
발된 광섬유 포도당센서와 광섬유 젖산센서는 25oC에서 활 성이 가장 뛰어남을 보였으며 시료측정에 있어 안정성과 감 도가 뛰어나 25oC에서 포도당 및 젖산 시료를 측정하는 것이 바람직하다.
3.3. 모사공정에서 포도당 및 젖산의 온라인 모니터링 각종 산업공정에서 포도당 과 젖산을 검출하기 위한 광섬유 센서를 개발하기 위해 효소의 고정화 조건등을 연구하였는 바, MTMS 졸-겔 용액에 효소를 포괄적으로 고정하는 것이 우수한 감도를 나타냈다. 또한, 효소는 pH 7.0의 완충용액으 로 용해하여 광섬유 말단에 고정화한 후 실온 (포도당)과 4oC (젖산)에 저장하는 것이 센서의 안정성과 검출성능을 높일 수 있었다. 이러한 조건으로 1000 unit의 GOD와 100 unit의 LOD 를 광섬유에 고정화하였을 때 표 1과 2에서 포도당과 젖산센 서는 0~1.0 g/L에서 보정곡선의 선형성이 높고 (회귀계수값, 0.98547과 0.9935) 감도도 높았다. 이와같은 조건 하에서 개 발된 광섬유 포도당센서나 광섬유 젖산센서를 실제 생물공 정 또는 혈액 중의 포도당이나 젖산의 농도를 온라인 모니터 링하는데 적용하기 위해, 포도당이나 젖산의 농도가 변화하 는 모사공정에서 포도당과 젖산을 온라인 모니터링하는 실 험을 하였다. Fig. 11에 광섬유 포도당센서 와 젖산센서에 의 한 온라인 모니터링 데이터와 HPLC에 의한 오프라인 분석값 을 비교하였는데 두 값이 잘 일치함을 볼 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 광섬유 포도당센서와 젖산센서는 실제 생물공정에 잘 적용할 수 있을 것이다.
4. CONCLUSION
본 연구에서는 산소검출용 형광염료로 사용되는 루테늄 (II) 복합체인 Ru(dpp)32+, 포도당 산화효소 (GOD) 또는 젖산 산화 효소 (LOD)를 MTMS 졸-겔 용액에 혼합하여 광섬유 말단에 포괄법으로 고정화한 광섬유 포도당센서와 광섬유 젖산센서 를 개발하였다. 광섬유 말단에 고정화하기 위한 GOD와 LOD 는 각각 pH 5.5와 pH 7.0에서 활성이 가장 높았으며, 1,000 unit의 GOD 또는 100 unit의 LOD를 고정화하여 제작한 광섬 유 센서는 0~1.0 g/L의 농도 범위에서 선형성과 민감도가 가 장 우수하였다. 광섬유 포도당센서는 GOD를 고정화한 후 실 온에서 24시간 건조하였을 때 안정성과 검출성능이 뛰어났 으나, 광섬유 젖산센서는 LOD를 고정화한 후 4oC에서 건조 하였을 때 안정성과 검출성능이 뛰어났다. 또한, 광섬유 포도 당센서와 젖산센서는 분석시료가 pH 7.0와 25oC에서 가장 높 은 센서 신호값을 얻었다. 광섬유 포도당센서와 젖산센서의 저장 안정성은 30일 동안 초기 활성을 잘 유지하였다. 그리고 광섬유 포도당 또는 젖산의 연속 모니터링 가능성 (조작 가능 성)은 0.5 g/L의 포도당 및 젖산을 측정하였을 때 24시간 동안 매우 안정적이었다. 광섬유 포도당센서와 젖산센서를 이용 하여 모사공정에서 포도당과 젖산의 온라인 모니터링 결과 와 HPLC에 의한 오프라인 분석 값이 잘 일치함을 보였다.
Acknowledgements
본 연구는 환경부 “글로벌탑 환경기술개발사업”으로 일부 지 원받은 과제임 (과제번호: 2016002210007).
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