Analysis of Microbial Community During the Anaerobic Dechlorination of Tetrachloroethylene (PCE) in Stream of Gimpo and Inchon Areas

The Korean Journal of Microbiology, Vol. 45, No. 2, June 2009, p. 140-147 Copyright ⓒ 2009, The Microbiological Society of Korea

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경기도 김포, 인천 서구지역 소하천의 PCE 탈염소화 군집의 선별 및 다양성 분석

김병혁^1,3·백경화¹·조대현¹·성열붕²·안치용¹·오희목¹·고성철³·김희식¹*

1한국생명공학연구원 환경바이오센터, ²포항산업과학연구원 광양환경연구실, ³한국해양대학교 건설·환경공학부

경기도 김포 지역과 인천 서구 지역공단 주변에 위치한 소하천의 저니 (sediment) 에서 난분해성 염소화합물인

PCE (tetrachloroethylene) 의 혐기성 탈염소화 능력이 있는 군집을 선별하고 , 탈염소화에 관여하는 미생물을 탐

색하였다 . 혐기성 탈염소화 능력을 조사하기 위해 전자공여체로 lactate 를 사용하여 혐기성 회분식 실험을 실시 하였으며 , 탈염소화 능력을 가진 군집을 선별하였다 . 선발된 미생물군집은 분자생물학적 기법인 16S rRNA gene

의 Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) 기법과 탈염소화 미생물을 선 택적으로 탐색할 수 있는 species-specific primer 를 이용하여 분석하였다 . 총 16 개의 시료 중에서 접종 8 주 만에 3

개의 시료에서 ethene 까지 탈염소화시켰으며 , 4 개의 시료에서 cis-1,2-dichloroethene ( cis -DCE) 까지 탈염소화시 켰다 . 또한 , 16S rRNA gene 을 이용한 PCR-DGGE 와 탈염소화 species-specific primer 를 이용하여 분석한 결과 , PCE 탈염소화 시료 내에는 Dehalococcoides sp. 와 Geobacter sp. 가 주로 존재하였으며 , Dehalobacter sp. 도 일부 시 료에서 검출되었다 .

Key words □ Dehalococcoides sp., Geobacter sp., PCR-DGGE, reductive dechlorination

산업화에 따라 수많은 유기성 유해폐기물이 대량으로 생산·이 용되어 토양 및 지하수를 오염시키고 있다 . ^{이들 중} tetrachlo- roethylene (PCE) 와 trichloroethylene (TCE) 는 염소계 유기화합물 로서 고도의 탈지능력과 안정된 세정력을 가지고 있어 , ^드라이클

리닝 , 금속산업의 세정용매 등으로 널리 사용되어 왔고 , 사용 후 자연계에 방출되어 지하수와 지표수를 오염시키고 있다 . ^염소계

유기화합물은 휘발성이 매우 강하고 , 발암성을 가지고 있으며 ,

분자 구조가 매우 안정한 난분해성 물질로써 그 처리에 있어 상 당한 시간과 비용이 요구된다 . 따라서 염소계 유기화합물의 오염 에 따른 광범위한 수질오염과 이들이 인체에 미치는 영향에 대 한 심각성이 제기되어 국내에서도 1993 년부터 PCE 및 TCE 를 폐수 배출기준에 포함시켰으며 , 현재 먹는 물 수질기준의 경우

PCE 와 TCE 는 각각 0.01 mg/L 와 0.03 mg/L 로 규제되고 있다 .

이러한 염소계 유기화합물의 처리는 유지관리 비용이 많이 드 는 물리·화학적 방법보다 생물학적 처리법이 경제적이고 친환경 적인 방법으로 보고되고 있다 . 생물학적 처리에 있어서 PCE 나

TCE ^{는 호기성 조건에서는 분해되기 어려우나 혐기성 조건에서} hydrogenolysis 에 의해 PCE 의 염소이온이 수소이온과 치환되는 환원반응에 의해 단계적으로 PCE, TCE, cis -1,2-dichloroethene ( cis -DCE), vinyl chloride (VC), ethene 으로 탈염소화되며 , 치환된 염소수가 많을수록 환원전위가 증가하여 환원적 탈염소화 반응 이 더 잘 일어난다고 알려져 있다 (16).

자연계에는 다양한 미생물이 존재하지만 미생물 탐색 및 분리 의 어려움으로 지금까지 순수하게 밝혀진 혐기성 탈염소화 미생 물종은 매우 적으며 , 혐기성 상호대사에 의한 탈염소화가 미생물 이 염소화합물을 분해하는 주된 기작으로 여겨지고 있다 (13).

Chlorinated-ethene-dehalorespiring 미생물들은 전통적인 분리방법 에 의해 분리되었으며 , chlorinated-ethene-dehalorespiring ^미생물

은 두 개 그룹의 category 로 나누어진다 . PCE 나 TCE 를 cis -DCE

까지 탈염소화시키는 그룹으로 proteobacteria 의 δ와 ε 그룹 또는

Firmicutes 가 있으며 , cis -DCE 를 VC 또는 ethene 으로 탈염소화 능력을 가지는 Dehalococcoides sp. 와 Chloroflexi 유사그룹으로 나누어진다 (25). D. ethenogenes strain 195 와 FL2 는 각각 PCE 와

TCE 를 ethene 으로 완벽하게 탈염소화시키는 능력을 가지고 있다

(15, 24). 그러나 D. ethenogenes strain 195 와 FL2 는 알려지지 않은 성장요인에 의하여 일반적으로 분리 및 배양이 매우 어렵 다 .

자연 환경 내에서 미생물들은 독자적으로 존재하는 경우는 극 히 드물며 , ^{다른 미생물과 주변 환경과 상호관계를 이루는 미생}

물 군집을 형성한다 . 미생물이 군집을 이룰 때 발현 특성은 개별 적으로 존재하는 경우와는 완전히 다르기 때문에 미생물군집의 이해가 필요하다 . 미생물군집의 구조와 다양성을 조사하는 방법 으로 DGGE 와 denaturing and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE), single strand conformation polymor- phism (SSCP), amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA), terminal restriction fragment length polymorphism (T- RFLP), DNA microarrays, DNA hybridization 등 여러 분자생물

*To whom correspondence should be addressed.

Tel: 82-42-860-4326, Fax: 82-42-879-8103

E-mail: [email protected]

학적 방법들이 개발되어 , 생태학적인 관계를 규명하기 위해 사용 되고 있다 (18).

환경부의 환경통계연보와 지하수 수질측정망 운영결과 보고서 따르면 , 인천을 제외한 시·도에서는 PCE 및 TCE 의 초과율이

0%~6.9% 를 보이며 , 인천지역의 경우 초과율이 17% 로 매우 높

다고 보고되었다 (3, 4, 5). ^{특히 혐기성조건의 하천의 저질 등에}

많이 존재한다고 알려져 있다 . PCE 분해 균주들은 PCE 등으로 오염된 지역의 저질에 분포할 가능성이 높기 때문에 인천지역과 인접지역인 경기도 김포지역의 하천 저니를 대상으로 염소계 유 기화합물인 PCE ^{혐기성 탈염소화에 관련하는 미생물을}

enrichment 하여 DGGE 방법과 탈염소화 미생물을 선택적으로 탐

색할 수 있는 species-specific primer 를 이용하여 미생물 군집 분 석을 수행하였다 .

재료 및 방법

경기도 김포시과 인천시 서구일대는 소규모 공장과 주거지역 ,

농경지역이 함께 존재하고 있다 . ^{소규모 공장의 종류는 화학제품}

생산 공장 , 철강 , 기계 등의 다양한 업종이 산재하고 있는 실정 이며 , ^{점오염원형태로 존재하기 때문에 하수처리 등이 미비한 상}

태로 현존하고 있는 실정이다 . 따라서 본 연구에서는 경기도 김 포시 일대와 인천시 서구 일대의 소하천을 대상으로 시료채취를 하였으며 , 인천시 서구에서 4 곳 , 경기도 김포지역에서 12 곳으로 모두 16 곳에서 시료를 채취하였다 (Fig. 1). 시료 채취는 라이너 토양채취기 (SJD-1600, 50 × 300 mm) 와 PVC pipe 를 이용하여 약

30~40 cm 정도의 깊이에서 채취하였다 . 채취한 토양은 기밀용기

(Wheaton, USA) 에 넣은 다음 N

flushing 을 약 3 분간 실시하여 토양의 산소를 제거하고 외부공기와 접촉을 차단시킨 후 , ice box 를 이용하여 0

C~4

C 에서 시료를 운반하였다 .

혐기성 배양 조건

탈염소화능을 가지고 있는 혐기성 미생물을 탐색하기 위해 회 분식 실험을 실시하였다 . 실험에 사용된 배지는 Sung 등 (29) 이

Desulfuromonas michiganensis 를 분리할 때 사용한 무기염 배지 를 사용하였으며 , PCE 를 electron accepter 로 하고 , lactate 를

electron donor ^{로 사용하여 배양 하였다} . ^{무기염 배지의 조성은} MgSO

6H

O, 0.5 g; NH

SO

, 0.3 g; K

SO

, 0.3 g; CaSO

H

O, 0.015 g; resazurin, 0.0025 g; Na

S9H

O, 0.048 g; L -cysteine, 0.035 g; NaHCO

, 2.52 g; trace element solution (A), 1 ml, trace element solution (B), 1 ml; yeast extract 0.2 g 와 같다 . 무기염 배 지는 질소 치환 (N

:CO

=80:20) 을 통해서 산소를 제거하였으며 ,

모든 과정은 혐기성 chamber (Coy lab, USA) 에서 수행하였다 .

회분식 실험을 위해 총용량 160 ml ^의 serum bottle ^{에 채취한}

시료 1 g 과 무기염 배지 50 ml, electron donor 로는 2 mM lactate

를 주입하였고 , 1.94 µmole ^의 PCE ^를 electron acceptor ^{로 주입한}

다음 , 테프론 재질의 Gray Butyl Septa (Wheaton) 를 사용하여 완전히 밀폐시켰다 . ^밀폐된 serum bottle ^{은 암조건의} 28

C ^에서

정치배양 하였으며 , 3 반복 혐기배양을 실시하였다 . 8 주마다 안정 화된 시료 10% 를 새로운 배지에 접종해 주었고 , 3 회에 걸쳐 계 대하여 안정화된 시료를 본 연구에 사용하였다 .

염소화합물 분석

염소 화합물 분석을 위한 표준물질 PCE, TCE, cis -DCE, 1-1-

Fig. 1. Schematics of the sampling stations. Dechlorination site ( ○ ), Non-dechlorination site ( ● )

142 Byung-Hyuk Kim et al. Kor. J. Microbiol

DCE, trans -DCE, VC 는 Aldrich (USA) 에서 구입하였으며 , ethylene 은 Supleco (USA) 에서 구입하였다 . 염소 화합물의 농도 는 GC-FID (Varian3400CX, USA) 로 분석하였으며 , DB-624 capillary column (30 m ^× 0.32 mm ^× 1.8 ^µ m, J&W, USA) ^{을 이용하}

여 headspace 부분에 생성된 염소 화합물을 분석하였다 . 염소화

합물 분석 조건은 40

C ^에서 8 ^{분간 머문 후} 6

C/min ^{으로 승온시}

켜 최종온도 100

C 에서 2 분간 정지하였다 . 이때 , 주입기와 검출 기의 온도는 각각 225

C ^와 250

C ^{로 설정하였다} . ^{이상의 조건에}

서 ethene, VC, 1,1-DCE, cis -DCE, trans -DCE, TCE, PCE 각각 의 retention time 은 각각 1.12, 1.5, 2.21, 4.9, 3.2, 8.4, 14.6 min

이었다 . 그리고 , VC, cis -DCE, TCE, PCE 의 검출한계는 각각

0.35, 0.48, 0.056, 0.12 µmole/bottle 이었다 . DNA

PCR

8 ^주간 PCE ^{를 첨가하여 혐기 배양한} enrichment 1.5 ml ^로부터 FastDNA Spin kit for Soil (Bio101, USA) 을 이용하여 total DNA ^{를 추출하였으며} , ^{미생물 다양성을 확인하기 위하여 시료로}

부터 얻은 DNA 를 주형으로 nested-PCR 반응을 수행하였다 . 1 차

PCR ^은 27F ^와 1541R ^{을 이용하여} 50 ^µ l ^안에 1 ^× PCR buffer, 20 mM MgCl

, 40 mM dNTP mixture, 각 primer (1 µ M), template DNA 와 0.5 U Taq polymerase 를 첨가하여 PCR 을 수행 하였다 (Table 1). 반응조건은 우선 94

C 에서 5 min 동안 DNA 를 변성시킨 후 , 94

C 에서 45 sec denaturation, 56

C 에서 45 sec annealing, 72

C 에서 45 sec extension 을 30 cycles 을 수행한 후

72

C 에서 7 min 동안 final extension 을 수행하였다 . 각각의 PCR

products 는 ethidium bromide 염색 후 1% agarose gel 에서 확인 하였다 . 1 차 PCR 의 증폭산물을 주형으로 2 차 PCR 을 수행하였 으며 , 이때 사용된 primer 는 40 개의 GC-clamp 가 붙은 341F-GC

와 786R ^{을 이용하였다} (Table 1). 2 ^차 PCR ^{을 위한} PCR mixture

는 1 차 PCR 에 사용된 것과 동일하며 , 사용된 PCR 반응조건은

94

C ^에서 5 min ^동안 DNA ^{를 변성시켜} , 94

C ^에서 45 sec denaturation, 60

C 에서 45 sec annealing, 72

C 에서 45 sec exten- sion ^하고 72

C ^에서 7 min ^동안 final extension ^{을 수행하였다} . Annealing 온도는 초기에는 60

C 에서 시작해서 1 cycle 당 0.5

C

감소하게 20 cycles 수행하였고 , 그 후 50

C 에서 15 cycles 을 수 행하여 touch-down PCR 을 완료하였다 . 얻어진 2 차 PCR 의 산물

을 이용하여 DGGE 를 수행하였다 .

또한 , 탈염소화미생물로 알려진 Dehalococcoides sp., Geobacter sp., Dehalobacter sp., Desulfitobacterium spp., Sulfurospirillum sp., Desulfuromonas sp. ^{가 선별된 탈염소화 배양액 내에 존재하}

는지에 대한 탐색은 PCR 기법을 이용하였다 . PCR 은 Table 1 의

species-specific primer ^{를 이용하였으며} , 50 ^µ l ^안에 1 × PCR buffer, 20 mM MgCl

, 40 mM dNTP mixture, 각 primer (1 µ M), template DNA ^와 0.5 U Taq polymerase ^{를 첨가하여 수행하였다} .

반응조건은 우선 94

C 에서 5 min 동안 DNA 를 변성시켜 , 94

C

에서 45 sec denaturation, 56

C 에서 45 sec annealing, 72

C 에서

45 sec extension 을 30 cycles 을 수행한 후 72

C 에서 10 min 동안

final extension 을 수행하였다 . 각각의 PCR products 는 ethidium bromide 염색 후 1% agarose gel 에서 확인하였다 .

Table 1. List of primer used in this study

Target species Primer name Size Primer sequence References

Dehalococcoides sp. DHC-F 434 bp AAG GCG GTT TTC TAG GTT GTC AC (19)

DHC-R CGT TTC GCG GGG CAG TCT

Geobacter sp. Geo 73f 413 bp CTT GCT CTT TCA TTT AGT GG (8)

Geo 485r AAG AAA ACC GGG TAT TAA CC

Dehalobacter sp . Dehalro-477F 171 bp GAT TGA CGG TAC CTA ACG AGG (12)

Dehalro-647R TAC AGT TTC CAA TGC TTT ACG G

Desulfitobacterium spp. Dd1 1,199 bp AAT ACC GNA TAA GCT TAT CCC (10)

Dd2 TAG CGA TTC CGA CTT CAT GTT C

Sulfurospirillum sp. Sulfuro-114F 308 bp GCT AAC CTG CCC TTT AGT GG (8)

Sulfuro-421R GTT TAC ACA CCG AAA TGC GT

Desulfuromonas sp. DSUL-F 835 bp AAC CTT CGG GTC CTA CTG TC (19)

DSUL-R GCC GAA CTG ACC CCT ATG TT

Bacterial 16S rRNA gene E27F 1514 bp AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG (20)

E1541R AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA

E341F 486 bp CCT ACG GGA GGC AGC AG

786R CTA CCA GGG TAT CTA ATC (27)

GC-clamp CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG

GGG GCA CGG GGG G (26)

DGGE

PCR 산물은 Dcode

System (Bio-Rad, USA) 을 이용하여

DGGE 를 수행하였다 . Denaturing gradient gel 은 10% polyacryla- mide (37.5:1=acrylamide:bisacrylamide) 에 urea 와 formamide 변성

제를 40%~70% 까지 농도구배가 형성되도록 첨가하여 제작하였

다 . 이와 같이 제작된 gel 에 PCR 증폭산물을 30 µ l 씩 loading 하 여 1

TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, pH 8.0) 에서 60

C, 85 V 로 20 시간 동안 전기영동하였다 .

전기영동이 끝난 gel ^은 ethidium bromide ^{에서 염색한 후} , UV ^로

확인하였다 .

염기서열분석

Denaturing gradient gel 상에서 다른 위치에 존재하는 DNA

단편들을 회수하기 위하여 각각의 band 를 선택한 후 , 잘라내어

3 차 DW 50 µ l 를 첨가하고 4

C 에서 하룻밤 동안 방치하여 상등 액을 취하였다 . Band 에서 회수한 DNA 를 주형으로 341F-GC 와

786R primer 를 이용하여 재증폭을 수행했으며 , PCR 산물은

PCR purification kit (QIAGEN, Germany) 로 정제한 후 염기서열 을 결정하였다 . 결정된 염기서열은 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)

의 GenBank database ^{를 이용하여} BLAST search ^{를 통해 분석하}

였다 .

결과 및 고찰

GC

PCE

탈염소화에 관여하는 미생물들은 석유화학공업지역의 저니에서 발견된다고 보고되고 있으며 , 혐기성 조건의 하천 , 해양의 저질 에 존재한다고 알려져 있다 (16). 따라서 본 연구에서는 소규모 공장이 위치해 있는 지역의 소하천 저질에 분포할 가능성이 크 기 때문에 이를 근거로 하여 경기도 김포시와 인천시 서구 일부 지역 소하천의 저니를 이용하여 혐기성 회분식 실험을 실시한 후 탈염소화능을 조사하였다 . PCE 를 분해하는 미생물 군집 확보 를 위하여 탈염소화 생성물을 측정하였으며 , ^{생성된 염소화 화합}

물의 농도는 정량하지 않고 , 최종 생성 산물만을 확인하여 평가 하였다 (Table 2). 16 ^{곳의 시료 중} PCE ^{를 탈염소화하는 시료는}

모두 7 개로 , PCE 의 최종산물인 ethene 까지 탈염소화하는 시료는

3, 11, 12 번 시료로 3 개 시료이며 , cis -DCE 까지 탈염소화하는 시 료는 4, 10, 13, 14 번 시료로 확인되었다 .

PCE 의 탈염소화 과정은 TCE, DCEs (1-1-DCE, trans -DCE, cis -DCE), VC 를 거쳐 최종생성물인 ethene 을 생성한다 . 탈염소화 과정 중 중간생성물에서의 탈염소화 반응속도는 치환된 염소수 가 작은 화합물일수록 탈염소화 반응속도는 줄어들며 , ^{이는 염화}

화합물에 치환된 염소수가 감소할수록 미생물의 탈염소화 속도 가 감소하여 중간생성물인 DCEs, VC ^{가 축적된다} (31). ^하지만 ,

VC 역시 발암성이 매우 강한 물질로 미국에서 지정한 독성이

매우 강한 물질 중 하나이다 (9). ^따라서 PCE ^{의 완전한 처리를}

위해서는 마지막 중간생성물질인 VC 의 ethene 으로의 전환은 매 우 중요하다 . 선별된 3, 11, 12 번 시료는 PCE 를 무해한 ethene 으

로 전환시키는 탈염소화능을 보유한 것으로 확인되었다 . ^{이를 지}

역별로 보면 , 인천시 서구 일대에서 채취한 4 개의 시료 중 3 개에 서 탈염소화 활성을 보이고 있으며 , ^{경기도 김포 일대에서 채취}

한 12 개의 시료 중 4 개에서 탈염소 활성을 보이고 있다 (Fig. 1 and Table 2). ^{인천 서구 지역의 시료} 75%, ^{경기도 김포지역의}

시료 30% 에서 PCE 를 탈염소화하는 미생물 군집이 존재하는 것 으로 나타났다 .

PCE 의 탈염소화 활성을 보이는 집적배양된 7 개의 시료에서 중간대사산물인 cis -DCE 와 최종산물인 ethene 이 관찰되었지만 ,

모든 시료에서 PCE 가 100% cis -DCE 와 ethene 으로 전환되지 않 고 중간 생성물질인 TCE, cis -DCE, VC 가 관찰되었으며 , 이는

GC ^{분석 시점에 염화화합물의 탈염소화가 종료되지 않음을 나}

타낸다 . 또한 , 각 시료에 첨가한 PCE 의 감소된 양과 최종산물인

cis -DCE ^와 ethene ^{의 양도 차이를 보였다} ( ^{자료 미제시} ). ^{이와 같}

은 결과는 각 시료마다 PCE 의 탈염소에 관련된 혐기성 미생물 들이 존재하기는 하나 , ^{각 시료별로 탈염소 미생물의 존재하는}

양과 미생물종에 따라 차이를 보이는 것으로 판단된다 . 또한 , PCE 를 중간대사물질인 cis -DCE 로만 전환하며 , 1-1-DCE 와 trans -

DCE 로의 전환은 관찰되지 않았다 ( 자료 미제시 ).

PCE 의 탈염소화능을 증대시키기 위해서는 집적배양을 통해 탈 염소화 미생물의 우점화를 이루어야 한다 . 탈염소화 미생물이 우 점화된 군집은 같은 농도와 같은 배양기간 동안에 탈염소화 활

Table 2. The final product through PCE dechlorination in anaerobic batch test

Sample No. Final product

1 ND

2 ND

3 ethene

4 cis -DCE

5 ND

6 ND

7 ND

8 ND

9 ND

10 cis -DCE

11 ethene

12 ethene

13 cis -DCE

14 cis -DCE

15 ND

16 ND

Lactate (2 mM) was added as the electron donor and carbon source, and PCE (1.96 ^µ mole) was added as the electron acceptor. Cultures were incubated without shaking at 28

C in the dark during 8 weeks.

ND, not dechlorinated

Detection limit: PCE, 0.12 µ mole/bottle; TCE, 0.056 µ mole/bottle;

cis -DCEs, 0.48 ^µ mole/bottle; VC, 0.35 ^µ mole/bottle

144 Byung-Hyuk Kim et al. Kor. J. Microbiol

성이 증대된다고 보고하고 있다 . 집적배양을 수행하면 탈염소화 효율에 큰 변화는 없지만 , ^{탈염소화 활성이 증대되어 진다고 알}

려져 있다 (21).

Species-specific primer

집적배양시료에서 전체 DNA 를 획득하여 탈염소화 관여 미 생물을 탐색할 수 있는 specific primer 사용하여 PCR 을 수행 하였으며 (Table 1), 탐색한 탈염소화 미생물은 Dehalococcoides sp., Geobacter sp., Dehalobacter sp., Desulfitobacterium spp., Sulfurospirillum sp., Desulfuromonas sp. 로 Fig. 2 와 같은 결과 를 보였다 .

선별된 시료 내에 Dehalococcoides -specific primer 를 이용하여

Dehalococcoides sp. ^{의 존재를 탐색한 결과} , 4 ^번과 13 ^{번 시료를}

제외한 모든 시료에서 PCR 증폭산물을 확인할 수 있었다 (Fig.

2A). PCR ^{증폭산물을 확인할 수 없는} 4 ^번과 13 ^{번 시료는} PCE ^를 cis -DCE 까지 탈염소화시키는 배양액이다 (Table 2). Dehalococcoides

strains 들은 혐기적인 조건에서 탈염소화시키는 배양액에서 자주

발견되며 , PCE 를 ethene 으로 전환하는 D. ethenogenes strain 195, TCE 를 ethene 으로 전환하는 FL2 와 GT, cis -DCE 를 ethene

으로 전환하는 BAV1 과 VS 등이 순수 분리되었다 (14, 15, 22, 24, 30).

Geobacter -specific primer 를 이용한 PCR 탐색은 선별된 7 개의 시료 모두에서 PCR 증폭산물을 보였다 (Fig. 2B). Geobacter group ^{은 지표부근의} anoxic ^{한 환경에서} iron geochemistry ^{에 영향}

을 주고 , 독성을 가진 금속과 radionuclides 를 감소시키며 , 다양한 유기체의 산화에 관련한다는 것이 알져지면서 최근 들어 관심을 받고 있다 (6, 22). 이중에 G. lovleyi SZ 는 PCE 에서 cis -DCE 까지 탈염소화하는 미생물로 분리되었다 (28).

Dehalobacter -specific primer 를 이용해 시료 내 Dehalobacter

sp. 를 탐색한 결과 12 번과 14 번 시료에 존재하는 것을 확인하였

다 (Uncultured Dehalobacter sp. 16S rRNA gene EU214535 와

100% 상동 )(Fig. 2C). Dehalobacter sp. 는 PCE 를 cis -DCE 까지 탈염소화한다고 알려져 있으며 , D. restrictus PER-K23 와 TEA 가 순수 분리되었다 (17, 32). D. restrictus PER-K23 은 H

만을

electron donor ^{로 성장할 수 있으며} , electron acceptor ^로 Fe(III), Fig. 2. PCR profile based on specific primer of dechlorinating bacteria

from anaerobic batch test. Panel (A) Dehalococcoides sp., (B) Geobacter sp., (C) Dehalobacter sp., (D) Desulfitobacterium spp., (E) Sulfurospirillum sp., (F) Desulfuromonas sp. M, 1 kb size marker.

Table 3. Sequence similarity between DGGE bands and those of the closest relative in the GenBank database

Band No. Accession No. Closet organisms or clone name Similarity (%)

e1 CP001089 Geobacter lovleyi SZ 87

e2 CP001089 Geobacter lovleyi SZ 87

e3 FJ372576 Uncultured bacterium isolate DGGE gel band GA5 16S rRNA gene 91

e4 EU826734 Uncultured bacterium clone PTA-14 16S rRNA gene 100

e5 FJ393733 Uncultured bacterium clone PSsurf27 16S rRNA gene 100

e6 FJ229013 Uncultured bacterium clone Bio3ae11 16S rRNA gene 100

e7 EF562566 Uncultured deltaproteobacterium clone CF 05 16S rRNA gene 93

e8 EU864472 Uncultured bacterium clone E48 16S rRNA gene 87

e9 EU679419 Chlorobi bacterium BL-DC-9 16S rRNA gene 100

e10 EU826734 Uncultured bacterium clone PTA-14 16S rRNA gene 99

e11 FJ157998 Acetobacterium sp. enrichment culture clone WL 16S rRNA gene 99

e12 U68528 Desulfitobacterium chlororespirans 16S rRNA gene 85

e13 CP001089 Geobacter lovleyi SZ 100

Mn(IV), N

O 는 이용하지 못하며 , 오직 PCE 와 TCE 만을 electron acceptor 로 이용해 성장할 수 있다 (17). 탄소원과 electron donor

로 넣어준 lactate 는 acetogenesis, methanogenesis, sulfidogenesis, dehalorespiration, iron reduction 등에 관여하는 미생물에 의해

H

가 생성되며 , 이렇게 생성된 H

를 Dehalobacter sp. 가 이용하 여 성장한 것으로 판단된다 . 12 번과 14 번 시료 내의

Dehalobacter sp. 는 lactate 를 이용하는 수소생성미생물이 생성한

H

를 이용하여 PCE 와 TCE 를 탈염소화한다고 추론할 수 있다 .

따라서 Dehalobacter sp. ^{가 존재하는} 12 ^번과 14 ^{번 시료는 탈염소}

화 과정에 Dehalococcoides sp., Geobacter sp. 와 함께

Dehalobacter sp. ^도 PCE ^{의 탈염소화과정에 관여할 것으로 판단}

된다 .

Panel D, E, F 의 Desulfitobacterium -, Sulfurospirillum -, Desulfuromonas- specific primer 를 이용한 PCR 탐색 결과 , 집적배 양한 7 개의 시료 내에서 Desulfitobacterium spp., Sulfurospirillum sp. 와 Desulfuromonas sp. 는 탐색되지 않았다 (Fig. 2D, E, and F).

PCE 를 TCE 까지 탈염소화하는 미생물은 Desulfitobacterium sp. strains PCE1 과 KBC1 이며 , PCE 를 cis -DCE 까지 탈염소화하 는 미생물은 Desulfitobacterium hafniense strains PCE-S, TCE1

과 Y51, Sulfurospirillum halorespirans strain PCE-M2 ^{등이 분리}

되었다 . 지금까지 분리된 PCE 와 TCE 의 탈염소화 미생물 대부분 은 cis -DCE ^{까지 전환하며} , Dehalococcoides sp. ^만이 cis -DCE ^를 ethene 으로 전환한다고 보고되었다 (11). 따라서 Dehalococcoides sp. ^는 PCE ^{의 완전한 탈염소화를 이루기 위해서 필수적인 미생물}

로 인식되어지고 있다 . 선별된 7 개의 시료 내에 탈염소화 미생물 은 Dehalococcoides sp., Geobacter sp., Dehalobacter sp. 가 존재 하며 , 이들 탈염소화 미생물이 공존하면서 PCE 의 탈염소화에 관 여하는 것으로 판단된다 .

PCR-DGGE

PCE ^를 cis -DCE ^와 ethene ^{까지 탈염소화시키는 배양액의 미생물}

군집 다양성을 분석하기 위해 유용한 기법인 DGGE 를 이용하여

미생물 군집의 다양성을 조사해본 결과 , Fig. 3 ^{에서 보는 바와}

같이 gel 상에서 각 시료에 따른 bands 를 확인할 수 있었다 .

DGGE gel ^{에 나타난} bands ^중 13 ^개 bands ^{를 선별하였으며} , ^선별

된 bands 로부터 추출된 DNA 를 통해 각 bands 의 염기서열을 결 정하였다 . 13 개의 bands 를 분석한 결과 , 세 개의 bands (e1, e2.

e13) 가 G. lovleyi SZ 와 유사한 것으로 분석되었다 . e9, e11 번

bands 는 각각 Chlorobi bacterium 와 Acetobacterium sp. 로 분석되 었다 . 그리고 e12 번 band 는 Desulfitobacterium chlororespirans 로

homology 가 85% 로 매우 낮게 분석되었다 . 그 외의 bands (e3, e4, e5, e6, e7, e8, e10) ^는 uncultured bacterium ^{으로 분석되었다} . DGGE 분석 결과 , 3 번 시료와 14 번 시료에서 G. lovleyi SZ 가 우점 하고 있으며 , ^{탈염소화에 직접관여하고 있음을 확인할 수 있었다} .

PCE 와 TCE 에 오염된 지역의 bioremediation site 에서는 탈염소 화 미생물의 co-factor ^{로 인식되는} sulphate-reducing bacteria ^인 Desulfovibrio spp. 와 같은 미생물들이 발견되고는 하였다 (7). 하지 만 , 선별된 시료의 DGGE 분석은 탈염소화 미생물의 co-factor 로

인식되는 Desulfovibrio spp. ^{와 같은 미생물들은 탐색되지 않았다} .

현재까지 국내에서 PCE 탈염소화능에 관한 연구는 PCE 의 제

거가 주 관심사이었으며 , ^{탈염소화 과정에 관여하는 미생물 군집}

분석에 관한 연구는 매우 부족하다 (21). 본 연구에서 경기도 김

포일대와 인천시 서구일대의 소하천의 저니에서 혐기성 회분식 실험을 통해 PCE 를 탈염소화 할 수 있는 혐기성 미생물들의 존 재를 간접적으로 확인할 수 있었다 . 선별된 시료에서 16S rRNA gene 을 이용한 PCR-DGGE 와 탈염소화 species-specific primer 를 이용하여 분석한 결과 , 탈염소화 능력을 가진 군집은

Dehalococcoides sp., Geobacter sp. 와 Dehalobacter sp. 가 주로 존재함을 확인하였다 . 해외의 연구사례에서 탈염소화 미생물인

Dehalococcoides sp., Geobacter sp., Dehalobacter sp. ^등은 PCE

탈염소화 과정에서 자주 발견되며 , 자연환경에서는 하천의 저니 ,

토양 , ^{하천수 등에 존재한다고 보고되었다} (17, 24, 28).

그동안 국내에서도 분자생물학적 방법으로 탈염소화 미생물군 집에 대한 연구는 시도된 적이 있으나 (1, 2, 21), Dehalococcoides sp., Geobacter sp., Dehalobacter sp. 가 국내 환경에 존재한다는 연구결과는 본 논문에서 처음으로 제시하고 있다 . 국내의 향후

PCE 탈염소화 연구에서 이들 미생물의 분리 및 유전자 탐색 등

의 다양한 시도를 할 수 있을 것으로 기대된다 . 또한 , 탈염소화 미생물 군집을 연구하여 다양성 및 기능연구 등의 복합적인 분 석이 필요하며 , 미생물 상호관계의 분석을 통한 효과적인 오염

Fig. 3. DGGE profile based on 16S rRNA gene generated from anaerobic batch test. The PCR fragments were separated on a 10%

polyacrylamide-bisacrylamide gel using a denaturant gradient of

40~60%. Gels were run at 85 V for 20 h.

146 Byung-Hyuk Kim et al. Kor. J. Microbiol

환경의 정화를 이루어 낼 수 있을 것이다 . 이에 본 연구는 소하 천 오염환경 정화를 이해하는데 기여할 것으로 기대된다 .

감사의 말

본 연구는 환경부의 차세대 핵심환경기술개발사업 (Eco- technopia 21 project) 에 의해 지원된 연구비로 수행되었으며 , 연 구비 지원에 감사드립니다 .

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ABSTRACT: Analysis of Microbial Community During the Anaerobic Dechlorination of Tetrachlo- roethylene (PCE) in Stream of Gimpo and Inchon Areas

Byung-Hyuk Kim

, Kyung-Hwa Baek

, Dea-Hyun Cho

, Youlboong Sung

, Chi-Yong Ahn

, Hee-Mock Oh

, Sung-Cheol Koh

, and Hee-Sik Kim

* (

Environmental Bio Research Center, KRIBB, Daejeon 305-806, Republic of Korea,

Research Institute of Industrial Science

& Technology, Gwangyang 545-090, Republic of Korea,

Division of Civil & Environmental Engineering, Korea Maritime University, Busan 606-791, Republic of Korea)

In this study, anaerobic enrichment cultivation was performed with the sediments from the Gimpo and Inchon

areas. Lactate as an electron donor and PCE as an electron acceptor was injected into the serum bottle with an

anaerobic medium. After the incubation of 8 weeks, the reductive dechlorination of PCE was observed in 7 sites

among 16 sites (43%). Three enrichment cultures showed completely dechlorination of PCE to ethene, while

four enrichment culture showed transformation of PCE to

-DCE. The bacterial community structure was ana-

lyzed by PCR-DGGE. Dechlorinating bacteria were detected by species-specific primers. The dominant species

in seven anaerobic enrichments were found to belong to the genus of

sp. and

sp.,

and

sp.