三黃瀉心湯이 난황 알부민으로 유도된 알레르기 Mouse모델에서 항알레르기 효과
최종환⋅금선오⋅이세원⋅김일현⋅이하일⋅송용선
원광대학교 한의과대학 한방재활의학과교실
Anti-allergic Effects of Samhwangsasim-tang ( Sānhuángxièxīntāng ) on Ovalbumin-induced Allergic Model in Mice
Chong-hwan Choi, M.D., Seon-Oh Keum, Se-Won Lee, Il-Hyun Kim, K.M.D., Ha-Il Lee, K.M.D., Yung-Sun Song, K.M.D.
Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Won-Kwang University
본 연구는 2013년 원광대학교 교내연구비 지원의 결과입니다.
RECEIVED June 18, 2014 REVISED July 2, 2014 ACCEPTED July 5, 2014
CORRESPONDING TO Yung-Sun Song, Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Won-Kwang University, 99, Garyeonsan-ro, Deokjin-gu, Jeonju 561-851, Korea
TEL (063) 270-1070 FAX (063) 270-1594 E-mail [email protected]
Copyright © 2014 The Society of Korean Medicine Rehabilitation
Objectives In this study, we investigated the inhibitory effects of Samhwangsasim-tang (S.H) on the allergic response caused by ovalbumin(OVA) sensitization and challenge in BALB/c mice.
Methods The experimental animals were divided into five groups; 1) normal as negative control, 2) OVA-sensitized mice, 3) OVA-sensitized mice treated with 200 mg/kg of S.H 200, 4) OVA-sensitized mice treated with 400 mg/kg of S.H 400, and 5) OVA-sensitized mice treated with 5 mg/kg of Dexamethasone (Dex). Antigen sensitization for allergic mouse model was performed with twice injection of OVA for 2 weeks. After secondary in- jection, S.H was administrated orally into mice every day for 13 days and the inhibitory ef- fect of S.H on allergic responses was evaluated.
Results Treatment of S.H into allergic mice reduced significantly ear edema and infiltra- tion of immune cells in ear tissues induced with OVA challenge in a dose-dependent manner. S.H reduced significantly the serum levels of Total Immunoglobulin(Ig)G and IgE, and particularly inhibited the production of OVA-specific IgE, but not OVA-specific IgG. The serum level of proinflammatory cytokine TNF-α and Th2-associated cytokine IL-4 also were significantly decreased by S.H adminstration in a dose denpendent manner. S.H atte- nuated OVA-induced secretion of IFN-γ, but not IL-12 which is a cytokine inducing the de- velopment of Th1 cells. It also reduced significantly the secretion of IL-4, which is a cytokine inducing the development of Th2 cells, after splenocytes were stimulated with OVA.
However the secretion of IL-5 and IL-13 was influenced weakly or a little.
Conclusions These results indicate that S.H could reduce the allergic response through inhibition of antigen-specific IgE and Th2-inducing cytokines. It suggest that S.H may be available clinically for the treatment of allergic patients. (J Korean Med Rehab 2014;24(3):
71-85)
Key words Samhwangsasim-tang (S.H), Allergic disease, Ovalbumin, Immunoglobulin,
proinflammatory cytokine, Interleukin-4
서론»»»
알레르기 반응은 시간적으로 초기에 주요양상이 나타 나는 면역 질환으로 분류되며, 일정한 항원에 대하여 이 미 감작된 개체에 부착되어 있는 IgE 항체에 항원이 결합 한 후 수분 내에 일어나는 즉시형 면역반응이다1). 흡인성 항원과 접촉성 항원들이 주된 원인으로 유전적 소인, 생 활방식, 온도나 습도 등의 기후변화, 비강 내의 해부학적 구조 및 스트레스 등이 중요한 유발인자로 작용한다고 알 려져 있다2).
알레르기 반응에서 피부, 호흡기, 림프관 주위, 혈관주 위, 위장관의 점막, 뇌 등 전신의 장기에 분포하고 있는 비만세포(mast cell)가 이를 매개하는 중요한 세포로 작용 한다. 비만세포가 활성화되면 비만세포는 탈과립 되고 또 한 아라키돈산 대사물질과 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1 (IL-1)과 IL-6 등 염증성 cytokine 은 염증반응을 더욱 촉진시키는 동시에 가려움증을 더욱 촉진시켜 피부를 손상시키는 원인이 된다3).
알레르기성 피부염에는 두드러기, 혈관 부종, 알레르기 접촉 피부염, 아토피 피부염 등이 있으며 홍반, 부종, 소 양증 등을 특징으로 하는데, 한의학에서는 胎熱, 奶癬, 小 兒濕疹, 胎斂瘡, 四彎風 등이 이에 속한다4). 급성기에는 瘙痒感, 紅斑, 焮痛, 丘疹, 水泡 등의 증상이 나타나는데 한의학적 辨證은 그 증상과 정도에 따라 風熱, 濕熱, 熱毒 으로 나누며, 만성기에는 瘙痒感, 皮膚肥厚, 苔癬化의 증 상이 나타나는데 津液이 손상된 血燥로 辨證된다5). 알레 르기 질환의 치료수단으로써 한약은 체내에서 여러 가지 기능이 서로 협동하여 表裏, 寒熱, 虛實, 陰陽을 조절함으 로써 생체리듬의 항상성을 유지하기 위한 것으로 前漢時 代의 內經에서부터 임상적으로 널리 활용되어 왔다4).
三黃瀉心湯은 張仲景의 저서 金匱要略6)에 처음 기 재되었으며 大黃, 黃芩, 黃連의 약재로 구성되어 淸熱瀉 火, 解毒, 淸熱化濕, 瀉下, 止血 등의 효능이 있어 血熱에 의한 상부 출혈, 心下痞, 口乾, 不眠, 發斑 등에 처방되고 현대에서는 위장염, 위출혈, 위궤양, 고혈압 등의 질환에 응용된다고 알려져 있다7,8). 단일 한약재의 최근 실험적 연구에서는 黃連 추출물이 항산화효과9), 세포조직의 염증 과 사멸에 대한 연구10), 염증매개인자 IL-6, IL-16, GM- CSF 등의 발현을 억제하는 항염작용 연구11,12) 등이 보고 되었다. 黃芩 추출물의 경우 iNOS, COX-2, PGE2, IL-1,
IL-2, IL-6, IL-12, TNF-α 등의 발현을 억제하는 강력한 항염증 효과가 있는 것으로 알려졌으며13-15), Th2 cyto- kine 및 chemokine을 효과적으로 억제하여 항염증뿐만 아니라 항알레르기 효과가 있음이 보고되었고16,17), 大黃 에서도 항암18), 항산화19), 항염효과20-22) 등이 보고되었다.
최근 국내의 실험적 연구로써 三黃瀉心湯 추출물이 lipopolysaccharide 유도에 의한 대식세포 활성을 억제하 여 항염 효과를 보이며23), 혈압을 낮추거나 혈관벽을 이 완하는 효과가 있음이 보고되었다24,25). 또한 국외연구로 써 lipopolysaccharides로 유도한 저혈압 동물모델에서 三 黃瀉心湯을 정맥투여를 했을 때 저혈압 개선효과를 보였 고26), 三黃瀉心湯 물추출물을 경구투여한 경우 throm- boxane A2 analogue로 유도한 고혈압모델에서는 혈압을 낮추는 효과를 보였으며27), 또한 human aortic smooth muscle cell의 염증성 반응을 조절하는 것으로 보고되었 다28).
이와 같은 단일 약재들의 항염효과와 三黃瀉心湯이 갖 는 항염효과를 감안할 때, 혼합처방으로써 三黃瀉心湯은 알레르기성 염증반응을 억제하는 효과를 기대해볼 수 있 다. 그러나 현재까지 三黃瀉心湯의 알레르기 개선효과에 대한 연구는 아직 미미한 실정이다.
이에 저자는 본 연구에서 三黃瀉心湯의 항알레르기 효 과를 확인하기 위해 알부민(ovalbumin, OVA)을 항원으 로 하여 알레르기 반응이 유발되는 알레르기 mouse 모델 을 만들었다. 이미 OVA로 감작된 mouse에 三黃瀉心湯을 경구투여하고 알레르기 피부반응, 염증성 cytokine 및 면 역글로불린 분비량 등을 측정함으로써 알레르기 반응과 림프구에 의해 야기되는 병리학적 요소들에 미치는 영향 을 분석하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
재료 및 방법»»»
1. 재료
1) 약재
본 실험에 사용한 약재는 원광대학교 전주한방병원에 서 처방하여 정선하여 사용하였다. 본 실험에 사용한 三 黃瀉心湯 (
Samhwangsasim-tang
(Sānhuángxièxīntāng
), 이하 S.H)는 金匱要略6)에 준하였고, S.H에 들어가는Herbal names Pharmacognostic names Weight (g) 黃芩 Scutellaria baicalensi (Huángqín) 4 黃連 Coptis chinensis (Huánglián) 8 大黃 Rheum palmatum (Dàhuáng) 8
Total amount 20
Table 1. Prescription of S.H
약재는 Table I과 같다.
2) 시약
세포배양을 위해 Dulbecco's Modified Eagle's Medi- um (DMEM), Bovine calf serum (BCS), Fetal bovine se- rum (FBS) 등을 Hyclone사(Logan, UT, USA)에서 구입 하였고, 알레르기 유발물질로써 난황알부민(OVA; Grade V)는 sigma-Aldrich사(St Louis, MO)에서, aluminum hy- droxide(Alum)는 Thermo Scientific사(Cramlington, UK) 에서 구입하였다. 한편 세포활성에 의해 합성되는 TNF- alpha, Th1 cytokine인 IFN-gamma, IL-12와 Th2 cyto- kine인 IL-4, IL-5, IL-13 등을 정량하는 ELISA kits는 BD Biosciences사(San Jose, CA, USA)에서 제조한 제품을 사 용하였다. RNA를 분석하기 위해 Trizol reagent와 super scriptTMIII First synthesis system for RT-PCR kit는 in- vitrogen (Grand Island, NY)에서 구입하였다. 한편 본 실험에 사용한 기타 시약들은 Sigma사(St Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
3) 검체 조제
S.H 5첩 분량(100 g)을 취하여 증류수 1,800 ml를 담 은 용기에 넣고 2시간 동안 환류 냉각 하에서 열탕하고 그 열수추출물을 Whatmann paper filter로 여과한 후 ro- tary evaporator (EYELA사)에서 감압 농축하고 완전히 건 조하여 S.H 추출물 34.6 g을 얻었다. 실험동물에 S.H 추 출물의 투여량은 성인 표준체중에 준하여 건조물의 중량 (34.6 g)으로부터 mouse 체중당 적정 1일 투여량(200 mg/kg)을 산출하였다. 농도 의존적인 실험을 위해 S.H 200 mg/kg과 400 mg/kg이 되도록 검체를 조제하였다.
4) 실험동물
체중 17~18 g의 BALB/c계 암컷 mouse 6주령을 (주) 샘타코(오산, 경기도)에서 구입하여 사용하였다. 실험 당
일까지 고형사료와 물을 충분히 공급하고 사육실 내를 실 온 20±2oC, 습도 40~60%로 유지하면서 낮과 밤의 주기 는 각각 12시간으로 하였다. 2주일간 실험실 환경에 적응 시킨 후 실험에 사용하였다. 동물실험은 동물실험 윤리준 칙(승인번호 CBU2014-00052)에 따라 수행되었다.
2. 방법
1) 알레르기 동물모델
알레르기 질환을 갖는 실험동물모델은 Park29) 등의 방 법을 참조하였으며, OVA 의존적인 알레르기 mouse 모델 을 만들어 본 실험에 사용하였다. 알레르기를 유발하기 위해서 BALB/c mouse가 8주령이 되었을 때, 18 g 내외 의 mouse를 그룹당 8마리로 총 5그룹으로 분류하여 실험 을 실시하였다. OVA 20 μg과 보조제로써 alum 1 mg을 혼합하여 100 μl의 용량으로 phosphate buffered saline (pH 7.4)에 녹인 뒤 복강주사 하여 1차 감작시켰다. 2주 후에 같은 비율의 OVA와 alum을 다시 복강주사 하여 2 차 감작시켜 알레르기 mouse 모델을 만들었다. 실험군은 정상 대조군(Normal), 알레르기 유발 대조군(OVA-sensi- tized), 알레르기 유발＋S.H 200 mg/kg (S.H 200), 알레 르기 유발＋S.H 400 mg/kg (S.H 400), 알레르기 유발＋
Dexamethasone 5 mg/kg (Dex)의 5개군(n=8)으로 나누 고 무작위 추출법에 준하여 mouse를 분리하여 사육하였 다. 검체는 2번째 감작시킨 날로부터 13일간 1% CMC (carboxymethyl cellulose)용액에 혼합하여 하루 1회 동 일한 시간에 경구투여 하였다. 이후 mouse를 희생시켜 알레르기의 병리적 지표들을 분석하였다.
2) 피부 부종반응 측정
시료를 경구투여한지 11일 후 OVA를 1 mg/ml의 농도 로 phosphate buffered saline (pH 7.4)에 녹인 뒤 mouse의 귀에 20 μl를 주사기를 사용하여 피내주사로 OVA 항원을 주입시켰다. 시간에 따른 알레르기 증세로써 귀의 부종상태를 알아보기 위하여 OVA를 주사한지 6시 간 및 24시간 후에 Thickness gage (Mitutoyo, Tokyo, Japan)를 이용하여 각 그룹의 귀 두께를 측정하였다.
3) 조직염색 및 현미경 관찰
귀 조직에 항원을 노출시킨지 24시간 후에 mouse 귀
조직을 떼어내 10% 포르말린으로 고정시켰다. 24시간 동 안 고정시킨 조직을 절취하여 카세트에 넣고 흐르는 물에 세척한 뒤 70% ethanol부터 100% ethanol 용액까지 단계 적으로 탈수시키고, 투명제로 xylene을 사용하였다. 파라 핀 침투과정을 거쳐 포매하여 파라핀 블록을 제작한 뒤 microtome을 이용하여 4 μm의 두께로 박절하여 조직절 편을 만들었다. 각 조직절편들은 xylene으로 탈파라핀화 과정을 거쳐 100% ethanol부터 50% ethanol로 함수하여 물에 수세한 후 hematoxylin 시액을 1분간 처리하고 eo- sin 시액은 3분간 처리하여 염색하였다. 염색된 슬라이드 를 광학현미경(CX21, Olympus, Tokyo, Japan)으로 각각
×100, ×400의 배율로 관찰하였다.
4) 혈청 분리
실험이 종료된 후 mouse를 에테르 마취하에 경추탈골 법으로 희생시키고 개복하여 혈액을 복부대정맥으로부터 23 G의 주사기를 이용하여 채취하였다. 채취한 혈액을 상온에서 30분 방치한 뒤 3000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 혈청을 분리하였다.
5) 혈청 중 면역글로불린 함량 측정
실험종료일에 실험동물로부터 분리한 혈청에서 면역글 로불린 총 IgE, 총 IgG1, OVA-specific IgE, 및 OVA-spe- cific IgG1의 함량을 분석하였다. 이들을 분석하기 위하여 Mouse IgE ELISA kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), Mouse IgG1 ELISA kit (eBioscience, San Diego, CA, USA), Mouse Anti-OVA IgE, 그리고 Mouse Anti- OVA IgG1 ELISA kit (Shibayagi, Gunma, Japan)를 사용 하였으며 회사에서 제공한 실험 방법에 따라 각 면역글로 불린의 함량을 측정하였다.
6) 혈청 중 cytokine 함량 측정
혈청 내에서의 염증성 cytokine인 TNF-α와 Th2 활성 화의 대표적 인자인 IL-4를 측정하기 위하여 Mouse TNF-a, IL-4 ELISA kit (BD Biosciences)를 사용하였다.
Capture antibody를 96 well plate에 코팅하고, 비특이적 인 결합방지를 위해 200 μl의 assay buffer를 각 well에 분주하여 1시간 동안 반응시켰다. Plate를 4회 세척하고 standard와 1/5로 희석한 혈청을 각 well에 100 μl씩 분 주하고 2시간 동안 반응시킨 뒤 4회 세척하였다. 희석된
detection antibody와 streptavidin-HRP를 각 well에 100 μl씩 넣어 1시간 동안 반응시키고 5회 세척한 뒤 TMB 기질을 100 μl씩 분주 후 빛을 차단한 상태에서 30분간 반응시켰다. 반응을 중지시키기 위해 2N H2SO4를 각 well에 50 μl씩 넣어준 뒤 microplate reader (zeniyth 200rt, Anthos, Austria)를 이용하여 450 nm에서 흡광도 를 측정해 각 cytokine의 분비량을 산출하였다.
7) 비장세포 분리
OVA로 알레르기가 유도된 mouse에서 비장을 적출한 뒤, 비장을 100 μm cell strainer로 걸러낸 다음 파이펫 을 이용하여 단일 부유세포로 배지에 풀어주었다. 적혈구 를 제거하기 위해서 HistopaqueⓇ 1119 (sigma-Aldrich Co.)와 단일세포 부유액을 1:2의 비율로 섞어 2000 rpm 에서 30 min동안 상온에서 원심분리를 하여 상등액에 포 함된 비장세포를 분리해 PBS로 세척하였다. 세척된 세포 는 trypan blue로 염색하여 생존율을 측정하고 살아있는 세포를 기준으로 세포수를 계산하였다. 세포는 10%의 fe- tal bovine serum과 1% penicillin-sterptomycin(100units
& 100 μg/ml)이 포함된 RPMI1640 (Thermo Scientific Hyclone Co.) 배지를 사용하여 37oC, CO2 5%의 세포배 양기에서 배양하였으며, 안정화시킨 뒤 각 실험에 사용하 였다.
8) 비장세포에서 Total RNA 추출
분리된 비장세포를 6 well plate에 5×106 cells/ml로 배양하여 S.H 검체를 농도별(1, 10, 100 μg/ml)로 전처 리하고 OVA항원 100 μg/ml으로 자극하였다. 양성대조 군으로 Dexamethasone 1 μM을 처리하였다. 24시간동 안 배양한 후 well당 1 ml의 Trizol reagent (Ambion, Austin, TX, USA)로 세포막을 파괴하고, 200 μl의 chloro- form을 가하여 15초 동안 잘 혼합하고 얼음에서 3분 간 방치하였다. 12000 rpm, 4oC에서 15분간 원심분리 한 뒤, 상층액을 취하여 500 μl의 Isopropyl alcohol을 넣고 10 분간 방치한 후 다시 12000 rpm, 4oC, 10분간 원심 분리 하여 pellet을 제외한 상층액을 제거하였다. 75% 에탄올 로 세척하고 상온에서 건조한 뒤, 20 μl의 RNAse free water에 각 RNA pellet을 녹였다. 추출된 Total RNA의 양은 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 260 nm와 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 정량하였으
Gene Sense (5'-3') Anti-sense (5'-3') Product size (bp)
IFN-γ CTTCTTCAGCAACAGCAAGGCGAAAA CCCCCAGATACAACCCCGCAATCA 456
IL-12 (p40) AACCTCACCTGTGACACGCC CAAGTCCATGTTTCTTTGCACC 309
IL-4 GAGATCATCGGCATTTTGAAC CTTGGACTCATTCATGGTGCA 267
IL-5 GAAAGAGACCTTGACACAGCTG GAACTCTTGCAGGTAATCCAGG 277
IL-13 ATGAGTCTGCAGTATCCCG CCGTGGCAGACAGGAGTGTT 194
Table II. Sequences and Product Size of Primers for RT-PCR
며, 총 2 μg의 RNA를 cDNA를 합성하는데 사용하였다.9) Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)은 Super scriptTMIII First synthesis system kit (Invitrogen, Grand Island, NY)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 2 μg의 RNA와 Oligo(dT)20, dNTP와 혼합 후 65oC에서 5분 동안 반응시 킨 후 반응완충용액과 MgCl2, DTT, RNAse inhibitor, RTase를 혼합하여 50oC에서 50분간 반응시키고, 85oC 5 분 동안 방치시켜 반응을 종결시켜 cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA로부터 유전자를 증폭시키기 위하여 Tem- plate와 taq polymerase, dNTP, 10X buffer, primer를 포 함한 20 μl의 시료를 Thermal cycler (Eppendorf, Ger- many)를 이용하여 증폭시켰다. 증폭된 유전자산물은 ethidium bromide으로 염색하여 1.5%의 agarose gel에 전기영동 하였다. 각 유전자의 RNA발현 수준은 GelQuant NET software를 사용하여 밴드의 밀도를 비교하였으며, endogenous control gene인 GAPDH mRNA발현량으로 표준화하였다. PCR은 95oC 30초, 60oC 30초, 72oC 1분의 조건으로 하였고, 본 연구에서 사용된 IFN-γ, IL-12 (p40), IL-4, IL-5, IL-13의 primer 염기서열들은 Table II 에 나타내었다.
10) 비장세포 배양액의 Th1 cytokine 측정
OVA-sensitized mice의 비장세포에서 OVA 반응에 의 해 분비되는 Th1 cytokine으로 알려진 IFN-γ, IL-12의 함량을 분석하였다. 분리된 비장세포를 48 well plate에 5×105 cells/ml로 분주하고, 2시간 동안 안정화 시킨 뒤 S.H 검액을 농도 별(1, 10, 100 μg/ml)로 처리하고 양성 대조군으로 Dexamethasone 1 μM을 처리하였다. 세포 를 48시간 동안 배양한 후 배양액을 수집하여 Th1 cyto-
kine인 IFN-γ, IL-12를 ELISA kit (BD Biosciences)를 사 용하여 450 nm의 흡광도를 측정하였다.
11) 비장세포 배양액의 Th2 cytokine 측정
Th2 세포의 분화 및 관련면역반응을 조절하는 IL-4, IL-5, IL-13를 분석하고자 OVA-sensitized mice의 비장세 포를 분리하여 OVA 의존적인 반응으로 분비되는 그들의 함량을 측정하였다. 분리된 비장세포를 48 well plate에 5×105 cells/ml로 분주하고, 2시간 동안 안정화 시킨 뒤 S.H 검액을 농도 별(1, 10, 100 μg/ml)로 처리하고 양성 대조군으로 Dexamethasone 1 μM을 처리하였다. 세포 를 48시간 동안 배양한 후 배양액을 수집하여 Th2 cyto- kine인 IL-4, IL-5, IL-13을 ELISA kit (BD Biosciences)를 이용하여 450 nm의 흡광도를 측정하였다.
12) 통계분석
실험을 수행하여 얻은 모든 값은 mean±SD 값으로 표 시하였다. 대조군과 실험군의 차이를 검증하기 위하여 t-test를 하였으며, GraphPad Prism software (version 5.0)를 이용하여 분석하였다. p 값은 0.05이하인 값을 유 의성이 있다고 판정하였다.
결과»»»
1. 피부 알레르기 반응에 미치는 영향
S.H를 투여했을 때 IgE 매개의 피부 부종에 미치는 효 과를 알아보기 위해 실험 시작 후 25일 째 되는 날, 12일 동안 하루 1회 S.H를 투여한 mouse와 대조군의 mouse 모델의 귀에 OVA를 주입하여 그 두께를 측정하였다. 시 간에 따른 변화를 알아보기 위해 주입한지 6시간, 24시간
Fig. 1. The effect of S.H on ear swelling responses in OVA- sensitized mice. Mice were divided into five groups; 1) normal as negative control, 2) OVA-sensitized group, 3) OVA-sensi- tized group treated with 200 mg/kg of S.H (S.H 200), 4) OVA-sensitized mice treated with 400 mg/kg of S.H (S.H 400), and 5) OVA-sensitized mice treated with 5 mg/kg of Dexame- thasone (Dex). Data are shown as mean±SD of eight mice per group.
*p＜0.05,
†p＜0.01 versus OVA-sensitized group.
Fig. 2. The effect of S.H on his- tological features of ear skin in OVA-sensitized mice. Histology of ear skin was examined at 24 hours after challenge with OVA.
Hematoxylin and eosin (H&E) staining was performed. Original magnification (A) ×100 (B)
×400.
째 각각 측정하였다(Fig. 1). 6시간 째 정상 대조군의 경 우 귀 두께 0.25 mm로 측정되었으나 OVA에 의한 알레 르기 유발 실험군에서는 정상 대조군과 비교하여 귀 두께 가 약 2.4배 증가한 0.61 mm를 나타내었다. 200 mg/kg 를 투여한 그룹은 0.54 mm로 알레르기 유발 대조군과 비슷한 수준을 나타내었으나, 400 mg/kg를 투여한 그룹 에서는 귀 두께가 0.47 mm으로 알레르기 유발 실험군과 비교하여 피부 부종이 약 23% 감소하였다. 24시간 후에 측정한 피부 부종 또한 S.H를 투여한 실험군에서 농도 의존적으로 부종반응을 억제하였으며, 알레르기 유발 대 조군의 귀 두께가 0.45 mm로 측정되었으나 400 mg/kg
투여군에서 0.30 mm로 피부부종을 유의적으로(p＜0.01) 감소시키는 것으로 나타났다. 특히 400 mg/kg 투여군은 Dexamethasone 투여군(0.32 mm)과 유사한 수준으로 피 부 부종을 억제하는 것으로 나타났다. 본 실험 결과로부 터 S.H가 농도 의존적으로 항원 노출로 야기된 알레르기 성 피부 반응을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
2. 피부 조직의 병리학적 형태에 미치는 영향
알레르기성 염증질환의 발병기전은 어떤 항원에 의해 감작되고, 동일 항원에 피부와 기관지/소화기 점막조직에 재차 노출되었을 때 주변조직에서 비만세포가 활성화하 여 염증 매개인자들을 분비하고, 염증세포의 침윤이 심화 되어 병리상태를 악화시킨다. S.H가 이러한 알레르기성 염증반응에 미치는 영향을 조직학적으로 분석하기 위하 여 OVA를 귀에 피하 주사하고 24시간 후 조직을 취하여 절편을 제작하고 hematoxylin & eosin 염색을 수행하였 다(Fig. 2).
정상 대조군에 비해 알레르기 유발 대조군이 OVA 항 원 노출에 의한 염증반응으로 부종이 현저하게 증가하였 으며 염증세포 침윤 등 병리적 소견이 심화되었다. 그에 반하여 S.H 투여그룹에서는 농도 의존적으로 부종 감소 와 침윤된 염증세포가 감소하는 것을 확인하였으며, 특히 S.H 400 mg/kg 투여군에서 대조약물 Dexamethasone 투여군과 비슷한 조직학적 형태를 나타내었다. 이 결과로 부터 S.H가 알레르기 반응에서 나타나는 피부 염증반응 과 조직으로 염증세포 침윤을 효과적으로 억제하였으며 고농도 투여시 정상 조직 수준으로 개선하는 것을 확인하 였다.
Groups Total IgE (μg/ml)
1)Total IgG1 (μg/ml)
1)Normal 0.90±0.44 847.18±181.42
OVA-sensitized 6.02±1.03 2389.45±206.82 S.H 200 mg/kg 4.75±0.40* 2244.45±49.04 S.H 400 mg/kg 4.33±0.73* 2027.64±44.18
†DEX 0.5 mg/kg 4.12±1.28* 1594.45±222.29
†1)
Data are shown as mean±SD of eight mice per group.
2)
Values *p＜0.05,
†p＜0.01 versus OVA-sensitized group (Student’s t-test).
Table III. The Effect of S.H on Serum Level of Total IgE and IgG1 in OVA-sensitized Mice
Groups OVA-specific IgE (μg/ml)
2)OVA-specific IgG1 (μg/ml)
2)Normal ND
1)ND
OVA-sensitized 105.74±14.68 4741.24±1185.42 S.H 200 mg/kg 72.29±8.91* 4561.93±842.18 S.H 400 mg/kg 60.12±6.48
†4624.39±1048.01 DEX 0.5 mg/kg 63.48±10.22* 3432.45±793.27*
1)
ND: Not detectable.
2)
Data are shown as mean±SD of eight mice per group.
3)
Values *p＜0.05,
†p＜0.01 versus OVA-sensitized group (Student’s t-test).
Table IV. The Effect of S.H on Serum Level of OVA-specific IgE and IgG1 in OVA-sensitized Mice
Fig. 3. The effect of S.H on serum level of TNF-α in OVA-sensitized mice. Data are shown as mean±SD of eight mice per group.
*p＜0.05,
†p＜0.01 versus OVA-sensitized group.
3. 혈중 면역글로불린 함량에 미치는 영향
알레르기 면역반응에 동반하여 IgE 수용체를 발현하는 비만세포 및 호염기구의 활성화와 밀접한 관련이 있는 항 원 특이적인 IgE와 IgG1의 증가에 대하여 S.H의 억제효 과를 확인하기 위하여 실험동물의 혈청에서 총 IgE와 IgG1 및 OVA 특이적인 IgE와 IgG1 양을 측정하였다.
OVA로 BALB/c mouse를 감작시킨 결과 총 IgE는 정 상 대조군과 비교하여 6.6배 증가해 6.02±1.03 μg/ml 를 나타내었고, IgG1 또한 정상 대조군에 비해 약 2.8배 증가함으로써 2389.45±206.82 μg/ml를 나타내어 유의 성 있게 증가하였다. OVA로 감작시킨 뒤 S.H를 200 mg/kg로 경구 투여한 그룹에서는 대조군과 비교하였을 때 총 IgE가 4.75±0.40 μg/ml으로 21%가 유의성있게(p
＜0.05) 감소하였으며, 400 mg/kg로 투여한 그룹에서는 4.33±0.73 μg/ml으로 28%가 유의성있게(p＜0.05) 감 소하였다. 이는 양성대조군인 Dexamethasone을 투여한
군과 비슷한 수준을 보임으로써 효과적으로 총 IgE를 억 제하는 것으로 나타났다. 총 IgG1 또한 S.H를 400 mg/kg 로 투여 하였을 때 15%가 유의성있게(p＜0.01) 감소함으 로써 억제효과를 나타내었다(Table III).
또 OVA-specific IgE 양을 분석한 결과, 정상 대조군에 서는 검출되지 않았으나 OVA를 면역시킨 알레르기 유발 대조군에서는 105.74±14.68 μg/ml로 현저하게 증가하 였고, 200 mg/kg 그룹은 32%, 400 mg/kg 그룹은 43%가 감소하여 농도 의존적으로 저해시키는 것으로 나타났다.
또 OVA 특이 IgG1의 양은 S.H를 투여한 군과 대조군이 비슷한 수준을 나타내어 영향을 미치지 않는 것으로 나타 났다(Table IV).
4. 혈청중 염증성 cytokine TNF-α 함량에 미치 는 영향
알레르기가 유도된 mouse에서 혈청중의 염증성 cyto- kine TNF-α의 증가에 대하여 S.H의 억제효과를 알아보 고자 OVA를 주사하고 분비된 혈청중의 TNF-α 함량을 분석하였다. TNF-α는 정상 대조군에 비하여 알레르기 유발 대조군의 혈청 내 TNF-α의 농도가 41.22±0.99 pg/ml로 유의적으로 증가하였으며, S.H 400 mg/kg 투여 군에서는 37.35±1.75 pg/ml의 수치로 나타내었다. 결과 적으로 S.H는 알레르기 유발 대조군에 비하여 혈청중의 TNF-α를 농도 의존적으로 유의하게(p＜0.01) 감소시키
Fig. 4. The effect of S.H on serum level of IL-4 in OVA-sensi- tized mice. Data are shown as mean±SD of eight mice per group.
*p＜0.05,
†p＜0.01 versus OVA-sensitized group.
는 효과를 보였으며 400 mg/kg 투여군에서는 TNF-α 수 준이 정상대조군 수준으로 감소된 것을 확인하였다(Fig.
3).
5. 혈청중 Th2 cytokine IL-4 함량에 미치는 영향
알레르기가 유도된 mouse에서 혈청중의 Th2 cytokine IL-4의 증가에 대하여 S.H의 억제효과를 알아보고자 OVA 로 알레르기를 유도하고 분비된 혈청중의 IL-4 함량을 분 석하였다. 알레르기 유발 대조군의 IL-4 cytokine의 수치 는 639.29±179.66 pg/ml로 정상 대조군에 비하여 약 2.7배 증가 하였으며, S.H 200 mg/kg 투여군에서는 350.71±89.01 pg/ml, 400 mg/kg 투여군에서는 280.36
±29.38 pg/ml을 나타내었다. 결과적으로 S.H는 알레르 기 유발 대조군에 비하여 혈청중의 IL-4를 농도 의존적으 로 유의하게(p＜0.01) 감소시키는 효과를 보였으며 400 mg/kg 투여군에서는 IL-4 수준은 정상대조군과 유사한 수준을 보였다(Fig. 4).
6. OVA 감작된 비장세포에서 Th1 cytokine 분비 에 미치는 영향
OVA에 의해 면역반응이 유도된 mouse에서 비장세포 를 분리하여 S.H가 T helper 세포의 Th1 subset으로의 분화 및 활성에 미치는 영향을 알아보고자 Th1 cytokine
의 mRNA의 발현량과 단백질 분비량을 각각 측정하였다.
비장세포에 OVA를 처리한 대조군에서 IFN-γ와 IL-12의 mRNA level이 모두 무처리군에 비해 현저하게 증가하였 고, IL-12는 S.H를 처리한 실험군에서 비슷한 수준으로 유의한 차이가 없었던 반면, IFN-γ의 mRNA의 발현은 S.H 농도 의존적으로 감소시키는 것으로 나타났다(Fig.
5A).
배양액에서의 각 cytokine의 단백질 양을 분석한 결과, IFN-γ는 무처리군에서는 검출되지 않았으나, 비장세포에 100 μg/ml의 농도로 OVA를 처리한 대조군에서는 57.10
±6.22 pg/ml로 증가되었다. S.H를 처리했을 때 농도 의 존적으로 감소되었으며, 특히 100 μg/ml의 농도에서는 87%가 유의성있게(p＜0.01) 감소하였다. 또한 IL-12는 무 처리군에서 81.03±10.78 pg/ml으로 나타났고, 대조군에 서는 388.97±17.14 pg/ml로 약 4.8배 증가하였다. 그러 나 추출물을 농도별로 처리하였을 때 비슷한 농도를 나타 내어 IL-12 분비에 별다른 영향을 받지 않는 것으로 나타 났다(Fig. 5B). 결과적으로 mRNA 수준과 배양액 내에서 의 단백질의 양은 서로 비슷한 경향을 나타내었으며, S.H 에 의해 IFN-γ는 감소되었으나 IL-12에서는 S.H의 처리 에 의해 유의한 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다.
7. OVA 감작된 비장세포에서 Th2 cytokine 분비 에 미치는 영향
알레르기 질환의 특징적인 T helper 세포의 Th2 편향 적인 분화에 S.H가 억제하는 효과를 알아보기 위해 OVA 에 의해 알레르기가 유도된 mouse에서 비장세포를 분리 하여 Th2 cytokine의 RNA의 발현량과 단백질 분비량을 각각 측정하였다.
먼저 IL-4, IL-5, IL-13 모두 무처리군에 비하여 대조군 의 mRNA발현량이 증가하였으며, IL-4는 S.H를 처리했을 때 농도 의존적으로 감소되는 경향을 나타내었으나, IL-5 와 IL-13은 유의성 있는 차이를 보이지 않았다(Fig. 6A).
배양액 내의 cytokine을 분석한 결과, IL-4는 무처리 군에 비하여 Ovalbumin을 처리했을 때 4배 증가하여 49.29±16.48 pg/ml로 나타났고, S.H를 1 μg/ml를 처리 하였을 때 53%, 10 μg/ml에서는 73%가 감소하여 유의 하게(p＜0.01) 억제효과를 나타내었다. IL-5는 유의성 있 는 감소효과가 나타나지 않았고, IL-13은 100 μg/ml에서
(A) (B)
Fig. 5. (A) The effect of S.H on mRNA expression of Th1 cytokines in splenocytes isolated from OVA-sensitized mice. The spleno- cytes obtained from OVA-sensitized mice were stimulated with or without OVA in vitro. The mRNA expression of Th1 cytokines IFN-γ and IL-12 was assessed by RT-PCR. Levels of each mRNAs were quantified by densitomeric analysis and shown as relative values normalized with that of GAPDH. (B) The effect of S.H on the secretion of Th1 cytokines in splenocytes isolated from OVA-sensitized mice. All splenocyte were obtained from OVA-sensitized mice and were stimulated again with or without OVA in vitro. Secretion of Th1 cytokines IFN-γ and IL-12 was measured using ELISA kit.
Data are shown as mean±SD of indipendent three experiment.
*p＜0.05,
†p＜0.01 versus control (t-test).
19% 감소하여 유의성있게(p＜0.05) 억제하는 것으로 확 인하였다(Fig. 6B).
고찰»»»
알레르기 질환은 환경오염, 식생활의 변화와 유전적 요 인 등의 복합적인 작용으로 연령을 불문하고 발병하며, 생활수준이 개선된 현재에도 유병률이 지속적으로 증가 하고 있으며, 아토피성 피부염의 경우 우리나라 유병률은 6세 이하에서 10%, 6~12세에서 6% 정도의 유병률이 있
는 것으로 보고되어 있고, 20세 후에도 대개 2%가 발병 하는 것으로 알려져 있다. 또한 아토피성 피부염 환자에 게서 알레르기성 결막염이나 천식을 동반하는 경우가 약 60%이고, 혈중 면역글로불린(총IgE) 함량이 현저히 증가 되어 있다고 보고되었다. 특히 우리나라를 포함하여 전 세계적으로 계속 증가되는 추세이다30,31).
알레르기 질환은 진단에 따라서 아토피 피부염, 알레르 기 비염, 기관지 천식 그리고 두드러기로 분류한다32,33). 알레르기 반응은 외부에서 침입해온 항원과 체내에 이미 존재하는 항체와 결합하여 면역학적인 항원-항체 반응을 야기하고, 여러 가지 화학적 염증유발 매개물질를 유리하
(A) (B)
Fig. 6. (A) The effect of S.H on mRNA expression of Th2 cytokines in splenocytes isolated from OVA-sensitized mice. All spleno- cyte were obtained from spleens of OVA-sensitized mice and were stimulated again with or without OVA in vitro. The mRNA ex- pression of IL-4, Il-5, and IL-13 was assessed by RT-PCR. Levels of each mRNAs were quantified by densitomeric analysis and shown as relative values normalized with that of GAPDH. (B) The effect of S.H on the secretion of Th2 cytokines in splenocytes isolated from OVA-sensitized mice. All splenocyte were obtained from spleens of OVA-sensitized mice and were stimulated again with or without OVA in vitro. Secretions of Th2 cytokines IL-4, Il-5, and IL-13 was measured using ELISA kit.
Data are shown as mean±SD of indipendent three experiment.
*p＜0.05,
†p＜0.01 versus control (t-test).
게 되며 주변 조직 및 세포를 자극하여 염증반응을 발생 시킨다고 알려져 있다1).
IgE는 알레르기 질환에 관여하는 주요한 면역글로불린
의 한 종류로서 면역반응에 의해 활성화된 B세포에서 생 성되며, 국소의 점막 조직과 분비물 내에 결합되지 않은 상태로 존재하거나 또는 비만 세포에 결합된 상태로 존재
하며 전신 혈관을 통해 몸 전체의 비만 세포 또는 호염기 구 세포들에게로 전달된다34,35). IgE에 의해 매개되는 반 응을 즉시형 과민반응, 제1형 과민반응이라고 하며 비만 세포와 호염기구의 표면수용체 FcεRI과 결합하여 알레 르기 반응이 발생하게 된다. 따라서 혈청 총 IgE의 농도 는 아토피 피부염, 알레르기 비염 그리고 기관지 천식 등 의 알레르기 환자에서 높게 나타나는 경향을 보이므로 일 반적으로 알레르기 질환을 진단하기 위해서 가장 우선적 인 방법으로 혈청 총 IgE를 측정하며 또한 환자에서 질환 을 유발할 수 있는 직접적인 원인을 확인하는 방법으로 혈청 알레르기 유발 특이 IgE를 측정하게 된다36).
아토피 피부염의 특징 중의 하나는 피부에 존재하는 비만세포의 IgE 수용체이다. 피부를 통과한 항원은 IgE 수용체와 결합하고 비만세포는 활성화되며, 활성화된 세 포는 탈과립 과정을 거친다. 탈과립 과정에서 염증과 관 련된 다양한 물질이 방출된다. 초기에 방출되는 물질은 헤파린(heparin), 히스타민(histamine), 세로토닌(serotonin), 미즙분해효소(chymase), 트립신분해효소(tryptase), 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)가 있다.
또한 류코트리엔(leukotrienes), 프로스타글란딘(prosta- glandin), cytokine, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, GM-SCF를 합 성하여 방출한다. 이러한 생물학적 활성 물질은 염증 반 응을 촉진시키고 피부로 더 많은 염증세포가 유입되도록
한다37,38). 한편 항원의 인식은 항원전달 세포에 의해서 T
세포에 전달된다. 아토피 피부염의 급성기에는 주로 2형 보조 T세포(Th2)에 의해 cytokine IL-4, IL-5, IL-13이 생 성된다. 만성기의 병변은 Th2세포 보다는 1형 보조 T세 포(Th1)에서 cytokine IFN-γ의 발현이 증가된다39).
양방에서 주로 사용되는 치료는 보습, 국소 스테로이드 제, 항히스타민제 등을 기본치료로 하여 광선치료나 면역 반응 조절제, 면역 억제제, COX-2억제제, 류코트리엔 길 항제 등의 선택적 보조치료가 이루어지고 있다40). 그러나 히스타민 수용체에 히스타민과 길항적으로 결합함으로써 말초 신경으로부터의 신호 전달을 저해하는 항히스타민 제, 화학적 매개자 생산 세포의 활성을 약화시켜서 증상 의 경감을 시도하는 항알레르기제, 면역 응답성을 약화시 켜서 염증을 경감시키는 스테로이드제는 어느 것이나 부 작용이 문제시되어 있고, 효과에 대해서도 결정적인 것이 없다. 따라서 최근에도 효과적인 약리 활성 및 부작용을 극소화 시킬 수 있는 약물에 대한 연구가 지속적으로 이
루어지고 있다41,42). 한의학계에서도 최근 한약과 처방을 중심으로 동물 실험을 통한 항아토피 효능 검색이 계속 이루어지고 있으며, 임상에서도 한의학적 특색을 갖는 치 료 방법을 시도하고 있다43-45).
알레르기에 대한 최초의 기록은 神農氏가 말고기를 먹 고 皮膚惡瘡을 앓은 사람에 대한 기록이 전해지며46), 巢 元方의 諸病源候論47)에서 “漆有毒, 人有稟性畏漆, 但見 漆便中其毒, 喜面痒然後胸臂脛腨皆悉瘙...若火燒漆, 其 毒氣則癘, 著人急重, 亦有性自耐者, 終日淺煮, 竟不爲害 也”, “人無問男女大小, 有稟性不耐漆者, 見漆及新漆者, 便 著漆毒”라 하여 옻이 사람의 체질에 따라 과민증상의 발 생여부에 차이가 있다고 기술하여 일찍이 알레르기 질환 에 대해 인식하고 있다고 볼 수 있다. 알레르기 피부염은 한의학의 乳癬, 奶癬, 胎癬, 胎斂瘡, 濕瘡, 胎熱症, 胎毒, 胎瘡, 浸淫瘡, 血風瘡, 四彎風 등에 속하는데48,49) 그 증상 은 홍반, 부종, 소양증 등을 특징으로 한다.
치료에 있어 시대적으로 관찰해보면 淸代까지의 문헌 들에는 外治法을 위주로 기술하고 있으며 현대에 와서 內 治法이 병용되고 있다. 內治法의 경우 급성기의 경우에는 淸熱解毒, 祛風, 利濕, 凉血이 위주가 되며, 만성기에는 祛風, 養血을 위주로 하여 증상의 발현 부위나 표현 형태 에 따라 治法의 偏重과 약물의 加減을 하게 된다. 外治法 을 살펴보면 급성기에는 淸熱燥濕하는 약물들이, 만성기 에는 活血養血하는 약물들이 사용되었다5).
본 연구에서 사용된 三黃瀉心湯은 金匱要略6)에 기 재된 처방으로, 주로 고혈압, 동맥경화, 뇌출혈, 불면증, 구내염 등의 치료에 쓰이는 처방중 대표적인 것이다. 특 히 淸熱瀉火·解毒, 淸熱化濕·瀉下·止血 등의 효능이 있어, 心火上炎으로 인한 實熱을 치료하는 기본 처방이 다16). 최근 연구로써 三黃瀉心湯은 국내연구에서 항산화 효과50)와, 대식세포 활성을 억제하는 항염 효과23)와, 혈압 을 낮추거나 혈관벽을 이완하는 효과가 있음이 보고되었
다24,25). 국외연구에서는 三黃瀉心湯을 정맥투여를 했을
때 저혈압 개선 효과를 보였고26), 고혈압 모델에서 혈압 을 낮추는 효과를 보였으며27). human aortic smooth muscle cell에서의 항염증 효과 등이 보고되었다28). 그러 나 현재까지 三黃瀉心湯이 알레르기질환에 효과가 있는 지 여부는 전혀 보고된바가 없다.
단일 한약재의 최근 실험적 연구에서는 黃連 추출물이 항산화 효과9), 세포조직의 염증과 사멸에 대한 연구10),
염증매개인자 IL-6, IL-16, GM-CSF등의 발현을 억제하는 항염작용 연구11,12), 항균작용과 관련한 연구51), 뇌신경세 포에 있어서의 염증매개물질의 억제작용52) 등이 보고되었 다. 한편 黃連은 염증관련 질환, 소화기 궤양, 심혈관질환 등에 효과가 있다고 알려져 있으며, 최근 黃連이 LPS에 의해 유도된 급성염증반응을 억제한다고 보고되었다53-55). 이런 약리효과들은 黃連에 함유된 alkaloid 성분, palma- tine, anisoquinoline 등이 관여한다고 보고되었다56,57). 黃 芩 추출물의 경우 iNOS, COX-2, PGE2, IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, TNF-α 등의 발현을 억제하는 강력한 항염증 효과 가 있는 것으로 알려졌으며13-15), Th2 cytokine 및 che- mokine을 효과적으로 억제하여 항염증뿐만 아니라 항알 레르기 효과가 있음이 보고되었다16,17). 이러한 약리효과 는 黃芩에 함유된 aicalin, baicalein, wogonin, and wo- gonoside 등이 관여한다고 보고되었다58). 大黃에서도 항 암18), 항산화19), 항염효과20-22) 등이 보고되었으며, 大黃의 함유성분들로 emodin, quercitrin, resveratrol 등이 약리 효과에 관여한다고 알려져 있다59). 이와 같은 단일 약재 들이 갖는 항염효과를 감안할 때, 혼합처방으로써 三黃瀉 心湯은 알레르기질환에서 나타나는 염증반응을 억제하는 효과를 기대해볼 수 있다.
이에 본 연구에서 BALB/c 암컷 mouse에 OVA항원을 감작시켜 알레르기질환 모델을 유도하였으며, 三黃瀉心湯 을 두 번째 감작일부터 경구로 투여하여 알레르기 반응에 관여하는 요인들을 조사한 결과 양방에서 주로 사용하는 면역억제제 Dexamethasone과 유사한 치료효과를 얻었 다. OVA를 항원으로 하는 알레르기질환 유도기법은 아토 피피부염, 천식, 알레르기성 비염 등에서도 사용되는 방 법이며, 일반적으로 알레르기성 피부염의 임상적 특징은 심한 가려움으로 인한 피부 장벽의 붕괴, 염증, 혈청 내 IgE의 증가, 염증부위에 호산구(eosinophil)의 침윤 및 Th2 세포의 편향된 발달을 들 수 있다29,60,61). 본 실험에 서는 알레르기성 피부염과 관련된 접근법으로 실험을 수 행하였다. 그림 1과 2에서 나타난 바와 같이 약 2주간 三 黃瀉心湯을 경구투여 하였을 경우 OVA에 야기되는 피부 부종 및 염증세포 침윤이 현저히 억제되었고, 피부병변의 억제 효과가 대조약물 Dexamethasone의 수준으로 억제 하는 결과를 얻었다. 이러한 결과는 三黃瀉心湯이 임상적 으로 알레르기성 피부염을 크게 개선시킬 수 있을 것으로 생각된다. 한편 혈청 중 염증성 cytokine TNF-α 농도가
三黃瀉心湯 투여에 의해 감소된 결과를 얻었으며, 이미 보고된 대식세포의 활성을 억제하는 항염증작용23)과 연관 성이 있을 것으로 사료된다.
일반적으로 알레르기질환 환자의 판정에 가장 중요한 지표는 혈중 면역글로불린 총 IgE 농도가 현저하게 증가 하는 것으로 잘 알려져 있다34). 본 연구의 결과에서도 OVA 항원감작으로 증가된 혈청 중 총 IgE와 OVA 특이 적 IgE 농도가 三黃瀉心湯 투여에 의해 유의적으로 감소 한다는 것을 확인하였다. 하지만 혈청 중 총 IgG 및 OVA 특이적 IgG 농도는 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타 났다. 이러한 결과는 三黃瀉心湯의 항 알레르기 작용이 Dexa와 마찬가지로 B세포의 항체생산 시스템에 작용하 여 IgG보다는 IgE 합성을 억제함으로 알레르기성 면역반 응을 억제하는 것으로 사료된다.
알레르기성 질환을 유발시키는 항원이 체내에 침투하 면 수지상 세포(dendritic cell)를 자극하여 Th1/Th2 임파 구들의 분화 및 증식을 자극하여 알레르기성 질환을 유발 및 악화시킨다고 알려져 있다62). 항원이 유입되면 Th1 면 역반응을 위한 IFN-γ 생산을 촉진하고63), 다른 작용기전 이 Th2 면역반응을 유발하는 Th-2 cytokine 생산을 촉진 시킨다. 이런 과정에서 Th2 분화(differentiation)를 유발 시키는 cytokine IL-4는 IgE 생산에 중요하게 관여한다고 알려져 있다64). 본 연구 결과에서도 OVA로 감작된 mouse 에서 혈청 IL-4 농도가 현저히 증가하였으며, OVA로 감 작된 mouse에서 분리한 비장세포를 이용하여 OVA를 처 리한 경우 IFN-γ와 IL-4 분비가 유의적으로 증가함을 확 인하였다. 이러한 알레르기 반응 조절인자 IFN-γ와 IL-4 들의 생산은 三黃瀉心湯 투여 및 처리에 의해 유의적으로 감소함을 확인하였다. 이러한 결과는 三黃瀉心湯이 Th1/
Th2 임파구에 직접 작용하여 IFN-γ와 IL-4 등의 알레르 기 반응 조절인자의 생산을 억제함으로써 염증세포인 비 만세포 및 호염기구를 자극하는 IgE 생산을 차단하게 되 고 결과적으로 알레르기 반응에 대한 억제 효과를 나타내 는 것으로 판단된다.
이상의 결과를 종합해볼 때, 三黃瀉心湯은 아토피 피부 염뿐만 아니라 음식 알레르기, 알레르기 결막염 등의 알 레르기 질환의 임상적 치료에 적용 가능할 것으로 예측할 수 있다. 알레르기질환의 관리와 치료의 경우 화장품 및 연고 등 피부적용제제로써 사용되는 경우가 많다. 최근 연구에서 三黃瀉心湯을 피부자극시험, 안점막자극시험 등
을 통해 피부 적용에 안전하다고 보고하였다65). 따라서 三黃瀉心湯은 알레르기 치료를 위해 경구복용뿐만 아니 라 화장품 등으로도 적용할 수 있을 것이다. 하지만 三黃 瀉心湯을 임상에 활용하기 위해서는 치료기간, 치료일정 및 적절한 항원용량에 대해서는 추가적인 연구가 필요하 며, 추가적인 치료기전에 대한 연구도 필요할 것으로 사 료된다.
결론»»»
난황 알부민으로 유도된 알레르기 mouse모델에서 三 黃瀉心湯의 투여가 알레르기 피부반응, 염증성 cytokine 및 면역글로불린 분비량 등에 미치는 영향을 실험적으로 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. OVA항원에 의해 유발되는 피부 부종반응에서 三黃 瀉心湯이 항원 노출로 야기된 알레르기 부종 반응을 농도 의존적으로 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
2. 부종이 유발된 조직을 염색하여 현미경으로 관찰한 결과 三黃瀉心湯 200 mg/kg에서도 억제하였으며 특히 400 mg/kg 투여군에서 양성대조군인 Dexamethasone그 룹과 유사하게 피부병변 및 염증세포 침윤을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.
3. OVA 감작으로 증가된 혈청내의 면역글로불린 IgE 와 OVA특이적 IgE 함량은 三黃瀉心湯의 투여시 농도 의 존적으로 감소하였으며 특히 대조약물 Dexamethasone 투여군과 비슷한 수준으로 억제효과를 보이는 것으로 나 타났다.
4. OVA로 유발된 알레르기 대조군에 비하여 三黃瀉心 湯의 투여군에서 혈중 염증성 cytokine TNF-α 농도가 유의적으로 감소함을 확인하였으며, 한편 면역글로불린 IgE 생산에 관여하는 IL-4 생산을 유의적으로 억제시키는 효과를 확인하였다.
5. OVA로 비장세포를 자극 할 때 Th1 cytokine의 경 우 모든 실험군에서 mRNA수준과 배양액 내에서의 단백 질의 양은 서로 비슷한 경향을 나타내었으며, 三黃瀉心湯 의 처리에 의해 농도 의존적으로 IFN-γ 분비는 감소시 켰다. 그러나 IL-12 분비는 三黃瀉心湯의 처리에 의해 유 의한 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다.
6. OVA로 비장세포를 자극 할 때 Th2 cytokine의 경
우 mRNA 발현에서 三黃瀉心湯를 처리할 때 농도 의존적 으로 IL-4 발현이 억제되었으나, IL-5와 IL-13은 유의성 있 는 차이를 보이지 않았다. 한편 OVA로 자극된 세포로부 터 분비된 cytokine 중 IL-4는 三黃瀉心湯를 처리할 때 현 저히 억제되었으며, IL-13은 고농도에서 19% 감소하였다.
그러나 IL-5는 유의적인 감소효과가 나타나지 않음을 확 인하였다.
이상의 실험결과를 종합하면 三黃瀉心湯은 OVA항원으 로 감작된 mouse에서 IL-4 생산을 억제하여 항원특이적 인 면역글로불린의 혈중 농도를 낮추게 되고, 결과적으로 항원에 재차 노출되어 나타나는 알레르기 반응을 차단하 는 효과가 있는 것으로 판단된다. 따라서 三黃瀉心湯의 항알레르기 효과는 IgE 의존적 알레르기 질환의 치료에 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
