쥐에서 자가 골격근 이식술 후 좌골 신경 재생에 대한 형태학적 연구

Volume 11, Number 2, October, 2008

쥐에서 자가 골격근 이식술 후 좌골 신경 재생에 대한 형태학적 연구

전북대학교 의학전문대학원 정형외과학교실, 해부학교실*, 전북대학교 임상의학연구소

김학지∙박종혁∙송창호*∙이준모

= Abstract =

A Morphologic Study on the Regeneration of Sciatic Nerve Replaced with Autogenous Skeletal Muscle in Rat

Hak-Ji Kim, M.D., Jong-Hyuk Park, M.D., Chang Ho Song, M.D.*, Jun-Mo Lee, M.D.

Departments of Orthopedic Surgery and Anatomy*, Chonbuk National University Medical School and Research Institute of Clinical Medicine, Chonbuk National University, Jeonju, Korea

Purpose: To investigate the morphological features of nerve regeneration in the rat sciatic nerve defect filled with autogenous skeletal muscle.

Materials and Methods: We used thirty Sprague-Dawley rats with weight of 300g. Nerve segment of 1 cm was resected from the right sciatic nerve in the study group. After filling the defect with autogenous skeletal muscle, we sutured epineurium of the resected sicatic nerve. At twelve months after surgery, examination with light and transmission electron microscopies were performed on the specimens and left normal sciatic nerves.

Resutls: Many regenerating nerve fibers were detected along the muscle graft. The number of myelinated nerve fibers was significantly greater in regenerated nerves than in normal nerves, but the size of myelinated nerve fibers was smaller in regenerated nerves. Ultrastructural observations showed nerve fibers and Schwann cells between muscle fibers.

Conclusion: The light and transmission electron microscopy showed that a good morphological pattern of nerve regeneration in gap filled with skeletal muscle.

Key Words: Sciatic nerve, Skeletal muscle, Nerve regeneration

※ 통신저자: 이 준 모

전라북도 전주시 덕진구 금암동 산 2-20 전북대학교 의학전문대학원 정형외과학교실

TEL: 063) 250-1769 FAX: 063) 271-6538 E-mail: [email protected]

서 론

신경 결손시 시행 할 수 있는 자가 신경 이식술 은 공여부 신경의 손상을 초래하고 크기가 부적합 한 경우가 많으며 이식하기에 충분한 양을 얻기가 어려우며, 공여 신경 분포 부위에 필연적으로 감각 장애가 초래되는데 이는 피할 수 없는 단점으로 지 적되어왔다⁸⁾. 이런 문제점을 근본적으로 해결할 목적으로 연구되고 있는 대치물로 자가근육4,14,15,18)

, 정맥¹⁷⁾, 합성 도관(synthetic tube)¹⁰⁾이 있으며, 배양된 슈반 세포(Schwann cell) 이식⁶⁾도 시도되 고 있다.

DeFranzo 등⁴⁾은 신경 절손 부위에 자가 근육 을 충진한 다음 봉합하므로써 점진적인 신경 재생 이 가능하고, 근위부로부터 재생되는 축색돌기가 원위부로 향할 수 있도록 올바르게 안내하는 역할 을 한다고 보고하였다.

신경에 양성 종양이 긴거리에 걸쳐 발생하여 자 가 이식수술이 불가능할 때 수술적 치료 방법으로 는, 양성 종양을 적출하고 신경외막을 보존한 후 적출된 신경 섬유위치에 자가 골격근을 대치시켜 근위부로 부터 원위부로 신경재생을 유도할 수 있 다. 자가 신경이식이 불가능한 임상에서 선택할 수 있는 단 1가지의 수술적 치료 방법으로써 신경 외막을 최대한 온전하게 보존하므로써 성공률을 높일 수 있다. 저자는 신경 결손 부위에서 신경외 막을 최대한 보존하고 그 안에 자가 근육을 충진 하면 신경 재생이 더욱 잘 될 것으로 추정하고 이 를 실험적으로 확인할 수 있다면 신경의 모양이나 크기에 관계없이 신경 재건을 시행할 수 있을 것 으로 판단하였다. 또한 대부분 연구자들은 술 후 수일에서 수 개월 정도의 단기간 실험을 보고하였 다4,13-15,18)

.

이에 저자는 쥐의 좌골 신경(sciatic nerve)을 노출시킨 후 좌골 신경 외막을 1 cm 박리한 후 신경 섬유를 완전히 적출하고 자가 대퇴 골격근으 로 충진하였다. 자가 골격근으로 충진한 다음 신 경외막 봉합술(epineurial neurorrhaphy)을 시 행하고 술 후 1년이 경과한 다음 광학 및 전자 현 미경으로 신경재생 여부와 미세구조의 변화를 관 찰하였다.

실험재료 및 방법

체중이 약 300 g 정도의 성숙한 숫컷 쥐(Spra- gue-Dawley rat, 8~10주) 30마리를 사용하였 다. 실험군은 우측의 좌골 신경(sciatic nerve)에 대하여 실험을 시행하였고 대조군은 실험을 시행 하지 않았던 반대측 신경을 사용하였다.

실험군은 좌골 신경을 1 cm 적출한 후 대퇴부의 자가 골격근을 충진시킨 후 신경외막(epineuri- um) 봉합술을 시행하였다. 실험군은 술 후 12개 월에 희생시켜 신경재생 정도를 형태학적으로 관찰 하였다.

마취는 실험동물을 밀폐된 용기내에서 에테르로 마취를 유도한 후 케타민(ketamine)과 럼픈 (rompun)을 5:1로 섞은 용액을 체중 kg당 1 ml 기준으로 좌측 둔부에 근육 주사하였다. 수술 방법은, 마취 상태에서 쥐의 좌외측 와위(left lateral decubitus)로 위치시킨 후, 우측 하지 전 부위를 탈모시키고 포비돈 소독액으로 처리한 후 소독포를 덮었다. 둔부에서 대퇴부를 지나 슬 관절 후방 상부까지 피부를 절개하여 대둔근 하방 에서 좌골신경을 찾아 원위로 내려오면서 각각 다 른 초막(sheath)을 형성하여 주행하는 경골신경과 총비골신경을 확인하였다. 수술 현미경하 (Zeiss^�, Germany)에서 경골 신경과 총 비골 신경으로 나 뉘는 지점에서 약 0.5 cm 상부의 좌골 신경 외막 을 1 cm 정도 박리한 후 신경섬유를 완전히 적출 하였다. 이때 신경외막은 최대한 보존하고 손상이 없도록 조심하였다.

동일한 절개 하에서 노출된 대둔근을 근섬유의 방향을 따라 대략 10~12 mm×5 mm 정도의 근육 절편을 채취한 후 신경섬유가 제거된 신경 상막 안에 충진하였다. 10.0 Ethilon^� 나이론 봉 합사를 이용하여 수술현미경 하에서 신경외막을 봉합하였다. 신경외막 봉합 후, 절개 부위를 지혈 시켰다. 근육은 3.0 흡수사로 봉합하였고 피부는 3.0 나이론사로 봉합하였으며, 수술 후 감염을 방 지하기 위하여 항생제(cephalosporin^� 2세대) 100 mg을 근육 주사하였다. 술 후 12개월에 희 생시켜 광학 및 주사 전자현미경으로 조직학적 변 화를 관찰하였다.

1. 육안적 관찰

술 후 1년이 경과된 다음, 각각의 검체는 마취 하에서 처음 수술 수기와 동일하게 노출하여 수술 부위를 박리하여 채취하였으며, 반흔조직으로 유 착된 부위는 조심스럽게 제거한 후 관찰하였다.

2. 광학 및 전자현미경적 관찰

절취한 좌골 신경을 수술 현미경을 이용하여 봉 합 부위를 중심으로 1×1×1 mm 크기로 잘라 0.1 M cacodylate 완충액(pH 7.4)으로 만든 2.5% glutaraldehyde에 2시간 동안 4℃에서 전고정하였고 같은 완충액으로 수세한 후 1%

osmium tetroxide (OsO4)로 2시간 동안 후고 정하였다. 탈수는 에탄올 상승순으로 실시하였고 propylene oxide로 치환한 다음 Epon혼합액으 로 포매하였다. 초박절기를 이용하여 1 μm 절편 을 만들어 0.1% toluidine blue 용액(pH 6.8) 으로 40℃ 가열판 위에서 염색하여 광학 현미경 으로 관찰하였다. 또한 초박절기로 60 mm 두께 의 절편을 만들어 uranyl acetate와 lead cit- rate로 이중염색을 시행한 다음 투과 전자 현미경 (JEOL, Model 1200 EM)으로 관찰하였다.

결 과 1. 육안적 관찰 결과

술 후 1년이 경과된 다음, 실험군에서 하지의

관절 운동범위는 정상적인 대조군 보다 현저하게 감소되었으나, 피부 괴사 등의 합병증은 발생되지 않았다. 수술 부위에서 반흔 조직의 유착이 있어 박리가 어려웠으나, 봉합사를 이정표로 하여 비교 적 원활하게 좌골 신경을 박리할 수 있었다. 실험 군의 좌골 신경은 정상 대조군의 약 1/3~1/2 굵 기이었다.

2. 광학 현미경 관찰 결과

정상 대조군에서 좌골 신경의 절단면을 광학 현 미경으로 관찰한 소견은 다음과 같다(Fig. 1).

굵은 좌골 신경의 신경섬유(nerve fiber)들과 신 경섬유속(nerve fiber bundle)들은 결합조직으 로 둘러싸여 있었다. 신경 전체는 결합조직으로 이루어진 신경외막(epineurium)에 의해 둘러싸 여 있었으며, 그 내부의 작은 신경속들은 신경주 막(perineurium)으로 둘러 싸여 있었다. 신경속 내부에 존재하는 신경섬유들은 얇은 결합조직막인 신경내막(endoneurium)으로 둘러싸여 있었다 (Fig. 1A). 신경섬유 사이의 결합조직에서 혈관 벽 횡절단면의 길이가 100 ㎛ 정도인 큰 혈관들 과 모세혈관들이 위치해 있었고 직경이 약 10~15 ㎛인 비만세포(mast cell)들도 관찰되었 다(Fig. 1A, 1B). 신경섬유들은 횡절단면 직경 이 10 ㎛ 정도인 큰 섬유들과 그 사이 사이에 끼 어 있는 약 1~5 ㎛ 정도의 작은 섬유들로 구성되 어 있었다(Fig. 1B). 큰 신경 섬유들은 대부분 원형이나 타원형이었으며 일부에서 불규칙한 모양 도 관찰되었으며, 굵은 수초(myelin sheath)가

Fig. 1. Light microscopic findings of the transverse section of normal rat sciatic nerve. (B) is the magnification of the rectangle in (A). (V; blood vessel, arrow ; mast cell, 1A; bar = 100 ㎛, 1B; bar = 10 ㎛)

A B

중심에 위치한 축삭(axon)을 둘러싸고 있는 유수 신경섬유들(myelinated nerve fibers)이었다.

술 후 1년이 경과한 다음 자가 근육으로 충진된 부위의 구조를 toluidine blue로 염색하여 광학 현미경으로 관찰한 결과는 다음과 같다(Fig. 2, 3). 좌골 신경의 횡절단면에서 근육섬유다발 사이 사이에 신경섬유들이 위치해 있었다(Fig. 2A, B). 신경의 바깥을 둘러싸고 있는 신경외막으로 부터 신경 안쪽으로 파고드는 모양의 결합조직들 이 근유섬유다발과 신경섬유다발 사이에 위치하고 있었다. 근육섬유와 신경섬유들 사이에 위치한 굵 은 띠모양의 결합조직들은 섬유들이 많은 치밀 불 규칙 결합조직(dense irregularconnective tis- sue)이었으며 일부에서 비만세포들이 관찰되었다 (Fig. 2). 신경섬유의 주위를 싸고 있는 결합조 직의 세포들과 섬유조직, 작은 혈관들은 정상 대 조군에 비하여 증가되었다. 근육섬유다발들은 횡

절단면의 직경이 약 50~100 ㎛ 정도로 대부분 타원형이었다. 특히, 신경 내막은 정상 대조군에 비하여 두꺼워져 있었고 그 사이에 위치한 유수신 경섬유들의 수와 크기는 감소되었다. 유수신경섬 유들은 그 모양이 원형이나 불규칙하였으며 대부 분 직경이 5 ㎛ 이하로 가는 선모양의 수초가 가 운데 축삭을 둘러싸고 있었다. 또한 1~2 ㎛ 정도 의 작은 무수신경섬유는 작은 유수신경섬유들 사 이에서 관찰되었으나, 직경이 10 ㎛ 이상의 큰 유 수신경섬유들의 수는 정상대조군에 비하여 감소되 었다(Fig. 2B). 특히 유수신경섬유들에서 축삭 (axon)을 둘러싸고 있는 수초(myelin sheath) 의 두께도 정상대조군에 비하여 얇았다(Fig.

2B). 근육으로 충진된 좌골 신경의 종절단면에서 는 긴 근육섬유다발 사이에 신경섬유들이 위치해 있었다(Fig. 3). 이들 근유섬유다발과 신경섬유 다발 사이에 결합조직들로 채워져 있었고 일부에 Fig. 2. Light microscopic findings of the transverse sections from the rat sciatic nerve 12 months after surgical opera- tion. (B) is the magnification of the rectangle in (A). (C; collagen fiber, ★; skeletal muscular fiber, arrow;

mast cell, 2A; bar = 100 ㎛, 2B; bar = 10 ㎛)

A B

Fig. 3. Light microscopic findings of the longitudinal sections from the rat sciatic nerves 12 months after surgical operation. (B) is the magnification of the rectangle in (A). (★; skeletal muscular fiber, arrow; mast cell, 3A;

bar = 100 ㎛, 3B; bar = 10 ㎛)

A B

서 비만세포들이 관찰되었다. 신경섬유의 주위를 싸고 있는 결합조직의 세포들과 섬유조직, 작은 혈관들은 정상 대조군에 비하여 증가되었다. 근육 섬유다발 사이에 위치한 유수신경섬유들의 수와 크기는 감소하였다. 유수신경섬유들의 모양은 불 규칙한 관모양으로 얇은 수초가 가운데 축삭을 둘 러싸고 있었다. 또한 긴 근육섬유다발에는 가는 띠모양의 많은 횡무늬들이 관찰되어 충진한 골격 근육(skeletal muscle)임을 알 수 있었다(Fig.

2B).

3. 전자 현미경 관찰 결과

축삭돌기의 유무를 보다 명확히 하기 위하여 전 자 현미경 관찰을 시행하였다. 쥐의 정상 좌골 신 경의 횡절단면의 전자 현미경으로 관찰한 소견은

다음과 같다(Fig. 4). 굵은 좌골 신경의 신경섬 유(nerve fiber)들은 대부분 직경이 10 ㎛ 정도 인 큰 섬유들과 그 사이 사이에 끼어 있는 약 1~5 ㎛ 정도의 작은 섬유들로 구성되어 있었다.

대부분 신경섬유들은 슈반세포(Schwann cell)들 이 둘러싸고 있었다. 큰 신경섬유들의 횡단면은 대부분 타원형이나 원형이었으며 두께가 약 1~2

㎛ 정도인 전자밀도가 높은 수초(myelin sheath)가 층판으로 배열되어 축삭(axon)을 둘 러싸고 있었다. 유수신경섬유들 사이에는 교원섬 유(collagen fiber)들이 빽빽하게 채워져 있었다.

축삭에는 미소관(microtubule)과 신경미세사 (neurofilament)들로 채워져 있었다.

술 후 1년이 경과한 다음 자가 근육으로 충진된 부위의 구조를 투과전자현미경으로 관찰한 결과 는 다음과 같다(Fig. 5, 6). 좌골 신경의 횡절단 Fig. 4. Electron microscopic findings of the transverse sections from normal sciatic nerve. There are the myelinated nerve fibers, axons, and blood vessel. (A; axon, M; myelin sheath, uM; unmyelinated nerve fiber, V; blood vessel, sN ; Schwann cell nucleus, 4A ; bar = 5 ㎛, 4B ; bar = 2 ㎛)

A B

Fig. 5. Electron microscopic findings of the transverse sections from the rat sciatic nerve 12 months after surgical operation. There are myelinated nerve fibers, unmyelinated nerve fibers, axons, and Schwann cells between muscular fibers. (A; axon, uM; unmyelinated nerve fiber, sN; Schwann cell nucleus, arrow; myelin sheath, ★

; skeletal muscular fiber, 5A; bar = 5 ㎛, 5B ; bar = 2 ㎛)

A B

면에서 근육섬유다발 사이사이에 신경섬유들이 위 치해 있었고, 이들 사이에 교원섬유들(collagen fibers)도 증가 되어 있었다(Fig. 5B). 원형이나 타원형의 전자밀도가 높은 슈반세포의 핵들도 정 상대조군에 비하여 그 수가 많았다(Fig. 5A, B). 슈반세포의 얇은 세포질 돌기들이 가는 띠 모양으로 2~10개 정도의 신경섬유들을 한 묶음 으로 둘러싸고 있었다(Fig. 5). 슈반세포의 얇은 세포질로 둘러싸인 신경섬유(nerve fiber)들은 대부분 직경이 2~5 ㎛ 정도의 작은 유수신경섬 유들과 2 ㎛ 이하의 작은 무수신경섬유들로 이루 어져 있었다. 수초로 둘러싸인 유수신경섬유들은 대부분 원형이나 타원형이었으나 일부에서 불규칙 한 모양도 관찰되었다. 이 들 유수신경섬유들은 두께가 약 0.5 ㎛ 이하의 전자밀도가 높은 수초가 층판으로 배열되어 축삭을 둘러싸고 있었다. 무수 신경섬유들은 전자밀도가 낮고 얇은 슈반세포의 세포질로 싸여 있었다. 유수신경섬유와 무수신경 섬유의 축삭에는 미소관과 신경미세사들로 채워져 있었다.

술 후 1년이 경과한 다음 근육으로 충진된 좌골 신경의 종절단면의 구조를 투과전자현미경으로 관 찰한 결과는 다음과 같다(Fig. 6). 긴 근육섬유 사이에 신경섬유들이 위치해 있었고, 근유섬유와 신경섬유 사이에서 불규칙하게 배열된 교원섬유들 과 전자밀도가 높고 불규칙 모양의 핵이 있는 섬 유모세포들도 관찰되었다(Fig. 6B). 근육섬유 사 이에 위치한 유수신경섬유들의 종절단면은 불규칙 한 관모양이었고, 전자밀도가 높은 수초가 축삭을

둘러싸고 있었으나 정상 대조군에 비하여 수초의 두께는 0.5 ㎛ 이하로 얇았다. 또한 무수신경섬유 들은 전자밀도가 낮고 얇은 슈반세포의 세포질로 싸여 있었다. 유수신경섬유와 무수신경섬유의 축 삭에는 횡절단면의 소견과 유사하게 소수의 미소 관들과 많은 수의 신경미세사들로 채워져 있었다.

근육섬유에는 전형적인 골격근육섬유의 Z-line들 이 규칙적으로 배열되어 있었다(Fig. 6).

고 찰

말초 신경이 파열되어 연결성이 상실된 경우 미 세 수술 기법을 이용하여 일차 신경 봉합술을 시 행한다. 일차 봉합술이 적용되지 못하고 신경 결 손이 초래된 예에서는 신경 이동술과 신경 전이 술, 관절 굴곡, 골 단축술, 신경 이식술 등이 적 용될 수 있으나 단점이 많고 예후가 불확실하다.

신경결손시 재생을 촉진시키는 방법으로, 모양 과 크기를 쉽게 선택할 수 있고 보관이 가능하다 는 장점이 있어 신경 도관(nerve conduit)을 이 용하고 있다. 이러한 신경 도관으로 사용되는 대 체물질들은 비합성 도관(non-synthetic guide tubes)으로 정맥²⁾, 근(muscle)¹⁾, 자가 교원질 (autogenous collagen)^9,11)이 있으며, 합성 물질 들은 lactate polymer, polygalactin mesh, polyethylene, microporous polytetrafluo- roethylene, silicone, silicon-polymer^3,7) 등이 있다. 특히 골격근은 얻기 쉽고 생체내 흡수가 용 이하며 항원 발현성(antigenecity)이 없거나 적 Fig. 6. Electron microscopic finding of the longitudinal sections from the rat sciatic nerve 12 months after surgical operation. There are myelinated nerve fibers, unmyelinated nerve fibers, axons, and collagen fibers between muscular fibers. (A; axon, C; collagen fiber, arrows; myelin sheath, ★; skeletal muscular fibers, 6A; bar = 5

㎛, 6B; bar = 2 ㎛)

A B

고, 쉽게 혈관이 형성될 수 있으며, 산소 운반이 잘되어야한다는 신경매체물의 조건^5,12)에 잘 부합 된다. 특히 절단 신경의 원위단에서 나오는 신경 성장 인자(nerve growth factor)가 이들 변성 근육의 기저막들을 따라 전도되거나 target- derived neurotrophic factor (TDNF)의 누출 을 방지하는 도관의 역할을 하는 등의 장점이 있 다¹⁶⁾.

근육을 변성시키기 위한 방법으로 방사선 조사, 물리적 충격이나 화학처리, 열과 냉 처리 등이 이 용되며 근육을 -170℃의 액화 질소내에 급냉시킨 후 상온의 증류수에 약 10분간 담아 삼투압에 의 한 근 세포의 파열을 유도하는 방법이 짧은 시간 내에 임상 적용이 가능하다. 저자는 급냉에 의한 근육 변성 시 근육이 변절되고 부스러지는 단점이 있어 신경외막 안에 삽입하기가 어려워, 대둔근을 채취하여 변성시키지 않고 신경 봉합술과 동시에 사용하였다. 신경외막을 최대한 보존하면 도관역 할을 하여 재생 축삭이 제 방향이 아닌 다른 방향 으로 자라 들어가는 것을 방지할 수 있고, 주위 조직으로 부터의 염증세포나 섬유아세포의 침윤을 막는 차단 효과(barrier effect)와 신경영양 인자 (neurotrophic factor)의 누출을 방지하므로써 농도를 높일 수 있으므로⁷⁾, 신경 재생의 정도가 원활하여 임상에서 사용이 가능한 장점이 있다.

저자가 시행한 실험에서는 신경외막을 최대한 보 존하여 그 안에 골격근을 충진하고 장기간(1년)이 경과한 다음 신경 재생 정도를 파악하고자 하였 다.

육안 소견에서도 술 후 1년이 경과 한 다음 수 술 부위는 반흔 조직이 유착되어 있었으나, 근육 을 충진하고 신경외막을 봉합한 부위의 좌골 신경 내로는 침투하지 못하는 소견이었다. 광학 및 투 과 전자 현미경 소견 상 근육을 충진하고 신경외 막을 봉합한 부위의 좌골 신경에서 골격근육섬유 들 사이에서 슈반세포, 유수섬유, 무수섬유, 축삭 돌기 등이 확인되었다. 특히 원형이나 타원형의 전자밀도가 높은 슈반세포의 핵들도 정상대조군에 비하여 그 수가 증가되었으며, 슈반세포의 얇은 세포질 돌기들이 신경섬유를 직접 둘러싸고 있을 뿐만 아니라 가는 띠 모양으로 2~10개 정도의 신경섬유들을 한 묶음으로 둘러싸고 있었다. 이러

한 결과는 슈반세포가 말초 신경의 지지세포 (supporting cell)로서의 역할과 아울러 신경재 생 시 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.

이상의 결과로 미루어 신경의 신경외막을 최대 한 보존하고 그 안에 근육을 충진하여 봉합하므로 써 점진적인 신경재생을 가능케 하고 신경의 재생 능력을 갖는 신경영양 인자를 신경내에 보관할 수 있음은 물론이고 반흔 조직의 형성을 방지하여 약 1 cm까지의 신경 결손은 신경재생이 가능할 것으 로 사료된다.

결 론

쥐의 좌골 신경 결손시 자가 골격근 충진 후, 신경외막 봉합술을 시행한 경우 신경 재생이 원활 하였음을 확인할 수 있었다. 향 후 신경전도검사 등의 추가적인 연구가 필요하지만, 임상적으로 1 cm 정도의 좌골 신경 결손시에 자가 신경 이식술 을 대치하여, 자가 골격근을 이용한 신경재생시술 이 가능할 것으로 사료된다.

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