Biphasic Electrophoresis를 이용한 혈청 지질상의 분석 박지영

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Biphasic Electrophoresis를 이용한 혈청 지질상의 분석

박지영․최현우․이진솔․김수현․조 덕․신명근․신종희․서순팔․양동욱

전남대학교 의과대학 진단검사의학교실

Serum Lipid Analysis Using Biphasic Electrophoresis

Ji-Young Park, Hyun-Woo Choi, Jin-So Lee, Duck Cho, Myung-Geun Shin, Jong-Hee Shin, Soon-Pal Suh, and Dong-Wook Ryang

Department of Laboratory Medicine, Chonnam National University Medical School, Gwangju, Korea

Background: Recently biphasic agarose gel electrophoresis method using Chol/Trig Combo^TM for simultaneous detection of cholesterol and triglyceride on lipoprotein fractions has been developed to facilitate the classification and interpretation of abnormal lipoprotein patterns of patients with hyperlipidemia. The author analysed serum lipid profiles using Chol/Trig Combo^TM in the patients of OPD in Department of Internal Medicine.

Methods: Measurement of serum cholesterol and triglyceride using enzymatic method was performed in the sera of 415 patients from April, 2006 to July, 2006. Simultaneously, we electrophoresed serum cholesterol and triglyceride using Chol/Trig ComboTM with analysis software (ED BANK, Helena Laboratories, Saitama, Japan).

Results: According to ATP III guideline, we set up standard cholesterol as 200 mg/dL and triglyceride as 150 mg/dL, respectively, and the patients were classified into control, hypercholesterolemic, hypertriglyceridemic and hypercholesterolemic/hypertriglyceridemic groups, respectively. Hypercholesterolemic group had higher HDL and LDL, hypertriglyceridemic group had higher HDL, VLDL and the rates of positive modified LDL, hypercholesterolemic/

hypertriglyceridemic group have higher VLDL and the rates of positive modified LDL than the control. Otherwise, the rates of positive modified LDL were 19.8% in the control, 23.6% in the hypercholesterolemic group, 50.9% in hypertriglyceridemic group, and 39.3% in hypercholesterolemic/hypertriglyceridemic group.

Conclusions: The frequency of the rates of positive modified LDL and VLDL was higher in the hypertriglyceridemic group than those in the control.

Key Words：Biphasic electrophoresis, Cholesterol, Triglyceride

교신저자：서순팔

우) 501-757 광주광역시 동구 학동 8번지 전남대학교병원 진단검사의학과

전화：062)220-5341, FAX：062)224-2518 E-mail： [email protected]

서 론

일반검사실에서 총콜레스테롤, low density lipoprotein- cholesterol (LDL-C), high density lipoprotein-cholesterol (HDL)-C, 그리고 중성지방 등의 지질측정에는 흔히 효소법 이 이용되고 있다. HDL-C의 경우 heparin sulfate-Mn

²⁺

,

dextran sulfate-Mg

²⁺

등의 polyaniondivalent cation을 이용 하는 방법은 다른 지질을 침전시키는 전처리 후 측정해야 하는 번거로움이 있고, 지단백을 각 분획으로 정확히 분리 할 수 있는 초고속원심법(ultracentrifugation)은 16시간 이상 원심을 해야 하므로 일상적 검사로 사용하기 힘들며, 아가 로스 젤을 이용한 전기영동법은 분획의 구분이 뚜렷하지 않 아 정확한 지단백을 정량할 수 없는 단점이 있다[1].

근래에 들어 HDL-C 및 LDL-C을 효소법을 이용하여

직접 측정할 수 있고, 분석법의 개선으로 보다 많은 지질성

분을 간편하게 검사할 수 있게 되었지만, 아직까지 당화

LDL (glycated LDL) 또는 산화 LDL (oxidized LDL)

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등의 변성 LDL (modified LDL, m-LDL)을 쉽게 측정할 수 있는 방법은 흔하지 않다.

최근 소개된 Epalyzer 2 (REP; Helena Labora- tories, Saitama, Japan)는 biphasic electrophoresis 법을 이용하여 콜레스테롤과 중성지방을 각각 아가로스 젤 전기영동을 시행한 후, LDL, very low density lipoprotein (VLDL), HDL, chylomicron (CM) 및 중 간밴드(midband) 등의 5 분획으로 나누어 지질양상을 검 색하는 장비로서 혈청 콜레스테롤과 중성지방 농도를 이용 하여 각각의 분획을 정량할 수 있으며, Fredrickson 유형 분류 및 m-LDL의 측정도 가능하다.

저자들은 본 연구에서 대학병원 외래를 방문한 환자를 대상으로 biphasic electophoresis법을 이용하여 고지혈증 군에 따른 지질양상의 분석, Fredrickson 유형에 따른 분 류 및 m-LDL의 분포 등을 조사하고자 하였다.

대상 및 방법

1. 대상 및 혈청지질측정

2006년 4월부터 동년 6월까지 전남대학교병원 내과 외 래를 방문한 환자 415명을 대상으로 하였으며, 남자 204 명(60±15.6세) 및 여자 211명(60±15.1세)이었다. 혈청 분리는 12시간 공복 후 채취한 말초혈액 검체를 4℃에서 15분간 3,000 rpm으로 원심하여 시행하였으며, 총 콜레 스테롤과 중성지방은 GPO-PAP (glycerol phosphate oxidase-phenylperoxidase aminophenozonphenol)와 CHOD- PAP (cholesterol oxidase phenol 4-aminoantipyrine peroxidase)를 각각 이용하여 효소법으로 측정하였다.

NCEP-ATP III 지침[2]에 따라 콜레스테롤과 중성지방 의 정상범위 상한치를 각각 200 mg/dL과 150 mg/dL로 하여, 이를 기준으로 ‘정상대조군’(콜레스테롤 <200 mg/

dL, 중성지방 <150 mg/dL), ‘고콜레스테롤혈증군’(콜레스 테롤 ≥200 mg/dL, 중성지방 <150 mg/dL), ‘고중성지방 혈증군’(콜레스테롤 <200 mg/dL, 중성지방 ≥150 mg/

dL), ‘고콜레스테롤/ 고중성지방혈증군’(콜레스테롤 ≥200 mg/dL, 중성지방 ≥150 mg/dL) 등의 4군으로 나누었다.

2. 지단백 전기영동

지질측정에 이용한 혈청검체로 콜레스테롤 및 중성지방에 대한 전기영동을 시행하였다. 1



L의 혈청을 Epalyzer 2 의 아가로스 젤 상에 주입한 후, 400V로 15분간 전기영동

하였다. 아가로스 젤은 REP Lipo-30 plate (Helena Laboratories, Japan)을 사용하였고, 콜레스테롤과 중성 지방은 각각 cholesterol dehydrogenase와 glycerol-3- phosphate를 포함한 시약(CHOL/TRIG COMBO

^TM

, Helena Laboratories)을 이용하여 염색하였다. 이동거리 에 따른 젤의 변이영향을 제거하고, 염색과 스캔 후에 두 분획이 보다 정확하게 겹쳐져 나타나게 하기 위해서 젤을 두 부분으로 나누어, 한쪽은 콜레스테롤을 염색하고, 다른 한쪽은 중성지방을 염색하였다. 염색한 젤은 5% 초산에 30분간 고정한 후, 증류수로 세척하고 건조후에 570 nm 에서 densitometer로 스캔하였다. 스캔된 패턴은 분석소프 트웨어(ED BANK, Helena Laboratories)를 이용하여 LDL, VLDL, HDL, CM 및 midband 등의 5분획으로 나누었다. 나누어진 분획은 필요에 따라 수기로 LDL, VLDL, HDL, CM 등의 4분획으로 수정하였으며, 수정된 분획을 효소법으로 측정된 콜레스테롤과 중성지방 농도를 대입하여 각각의 분획을 정량하였고, Fredrickson 유형에 따라 관찰되는 고지혈증 예를 각각 I, IIa, IIb, III, IV 및 V형 등으로 분류하였다.

3. modified-LDL

Chol/Trig Combo

^TM

를 이용하여 CMF (charge modification frequency)값을 얻어 m-LDL을 측정하였 다. CMF는 혈청검체를 주입시킨 기점에서부터 대조군의 LDL 최고점 위치를 a로, 기점에서부터 샘플의 LDL 최고 점위치를 b로 각각 설정하여 b-a/a＊100의 식을 이용하여 계산하였으며, 이 CMF 값이 m-LDL의 단위로 정해진다.

CMF는 정상범위를 -8에서 +8까지로 샘플이 대조군보다 음극 쪽으로 이동하게 되면 CMF는 음의 값을 갖고, 양극 쪽으로 이동하게 되면 양의 값을 갖게 되는데, CMF 값이 -8보다 작거나 +8보다 큰 경우는 'm-LDL 양성'이라 정 의하였다.

4. 통계분석

통계 패키지프로그램으로 SPSS 11.0 윈도우 버전

(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 유의성을

검정하였으며, P값이 0.05 미만인 경우 ‘통계학적으로 유의

하다’고 판정하였다. 정상대조군과 고지혈증군 간에 각종 지

질측정치간에 유의한 차이가 있는지 독립표본 T검정을 실

시하였고, m-LDL의 비율이 유의한 차이가 있는지는

chi-square 검정법을 이용하여 분석하였다.

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Table 2. Fredrickson phenotypic classification of normolipidemic and hyperlipidemic groups* according to serum cholesterol and triglyceride level

Phenotype

Normolipidemic Hyperlipidemic

A (N=232)

B (N=55)

C (N=72)

D (N=56)

N % N % N % N %

I - - - - - - - -

IIa 2 0.8 - - 42 58.3 2 3.6

IIb - - 1 1.8 1 1.4 31 55.4

III - - - - - - - -

IV 5 2.2 53 96.4 3 4.2 15 26.8

V - - - - - - 2 3.6

Unclassifiable 225 97 1 1.8 26 36.1 6 10.7

*Same as Table 1.

Table 1. Comparisons of lipid values (mean±SD, mg/dL) in normolipidemic and hyperlipidemic groups*

according to cholesterol and triglyceride level

Normolipidemic Hyperlipidemic

A (N=232) B (N=55) P value

^†

C (N=72) P value D (N=56) P value Total

Cholesterol 157 ± 28 165 ± 24.7 0.223 224 ± 23 <0.001 243 ± 36 <0.001 Triglyceride 90 ± 31 222 ± 84 <0.001 98 ± 29 0.073 278 ± 157 <0.001

HDL 53 ± 27 42 ± 8.6 0.034 59 ± 18 0.049 47 ± 12 0.149

VLDL 24.5 ± 2.8 44.5 ± 16.9 <0.001 19.6 ± 5.7 0.073 56 ± 31 <0.001 LDL 87.5 ± 25.4 79 ± 30 0.641 146 ± 28 <0.001 140 ± 44 <0.001

*A, triglyceride <150 mg/dL, total cholesterol <200 mg/dL; B, triglyceride ≥150 mg/dL, total cholesterol <200 mg/dL; C, triglyceride <150 mg/dL, total cholesterol ≥200 mg/dL; D, triglyceride ≥150 mg/dL, total cholesterol

≥200 mg/dL.

†

Independent sample T-test, considered to be significant when P<0.05.

Abbreviations: HDL, high density lipoprotein; VLDL, very low density lipoprotein; LDL, low density lipoprotein.

결 과

1. 환자의 분포

총 415명의 환자는 정상대조군 232명 [남 127명 (63±15.959세), 여 119명(58±16.85세)], 고콜레스테롤혈증군 72명 [남 23명(61±9.4세), 여 49명(64±12세)], 고중성지방혈 증군 55명 [남 29명(55±17세), 여 26명(64±14세)], 고콜레스 테롤/ 고중성지방혈증군 56명[남 25명(59±16세), 여 31명 (60±10세)]으로 각각 분류되었다.

2. 각 군의 지질분획양상

각 군의 지질분획 양상은 Table 1과 같다. 고콜레스테롤 혈증군은 정상대조군에 비해 HDL의 수치가 유의하게 낮았 고, LDL은 유의하게 높았다. 고중성지방혈증군은 HDL, VLDL 수치 및 m-LDL의 양성율이, 그리고 고콜레스테롤/

고중성지방혈증군은 VLDL, LDL의 수치 및 m-LDL의 양성

율이 각각 대조군에 비하여 유의하게 높았다(P<0.05).

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Fig. 1. The distribution of modified LDL.

Abbreviations: TG, triglyceride; Chol, cholesterol; CMF, charge modification frequency.

Table 3. Distribution of modified LDL of normolipidemic and hyperlipidemic groups* according to serum cholesterol and triglyceride level

CMF

^†

Normolipidemic Hyperlipidemic

A (N=232)

B (N=55)

C (N=72)

D (N=56)

N % N % N % N %

-9 ~ -17 15 6.5 2 3.6 1 1.4 2 3.6

-8 ~ + 8 186 80.2 27 49.1 55 76.4 34 60.7

+9 ~ +18 25 10.8 18 32.7 13 18.1 10 17.9

+19 ~ +28 3 1.3 6 10.9 2 2.8 7 12.5

+29 ~ +38 1 0.4 2 3.6 1 1.4 2 3.6

+39 ~ +48 2 0.8 - - - - - -

Over +48 - - - - - - 1 1.8

*Same as Table 1.

†

CMF: charge modification frequency, defined 'modified LDL positive' when <-8 or >+8.

3. 고지혈증에서 Fredrickson형에 따른 분류

대조군에서 Fredrickson 유형이 판정되지 않은 예가 97% (225/232)이었다. 고콜레스테롤혈증군에선 IIa형이 58.4% (42/72), 고중성지방혈증군에선 IV형이 96.4%

(53/55), 고콜레스테롤/고중성지방혈증군에선 IIb가 55. 4%

(31/56)로 각각 가장 많았다(Table 2). 한편 본 연구에서 I형

과 III형의 환자는 관찰되지 않았다.

4. 고지혈증에서 m-LDL의 분포

고지혈증에서의 m-LDL의 분포는 Table 3 및 Fig. 1 과 같다. 정상대조군에서 m-LDL이 양성인 예는 19.8%

(46/232)으로서 그중 CMF가 +8이상이 31예이었으며,

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A B

CM VLDL LDL CM CM VLDL LDL CM

A B

D C

Fig. 2. Densitometric scanning of various hyperlipidemias. Cholesterol and triglyceride are red and gray, respectively, in the densitogram. (A) Normolipidemic control (total cholesterol 139 mg/dL, triglyceride 100 mg/dL). (B) Type IIa hyperlipidemia (total cholesterol 231 mg/dL, triglyceride 129 mg/dL) with high peak LDL-C.

(C) Type IIb hyperlipidemia (total cholesterol 231 mg/dL, triglyceride 259 mg/dL) with high peak LDL-C and VLDL-TG. (D) Type IV hyperlipidemia (total cholesterol 195 mg/dL, triglyceride 335 mg/dL) with high peak of VLDL-TG.

Abbreviations: HDL, high density lipoprotein; VLDL. very low density lipoprotein; LDL, low density lipoprotein; TG, triglyceride; CM, chylomicron.

-8미만은 15예이었다. 고콜레스테롤/고중성지방혈증군은 50.9% (28/55)에서 m-LDL이 관찰되었으며, 그 중 CMF +8이상이 26예, -8미만은 2예였다. 고콜레스테롤혈 증군은 23.6% (17/72)이 m-LDL이 양성이었으며, 그 중 16명이 CMF +8 이상이었고, 나머지 1명이 -8 미만이었 다. 고중성지방혈증군은 39.3% (22/56)에서 m-LDL이 양성 이었으며, CMF +8이상인 경우가 20예, -8미만인 경우가 2 예였다.

5. 고지혈증군의 지단백 전기영동상

정상대조군, 고중성지방혈증군, 고콜레스테롤혈증군 및 고콜레스테롤/고중성지방혈증군 등의 전형적 지단백 전기영 동상은 Fig. 2에서와 같았다.

고 찰

Epalyzer 2는 biphasic electrophoresis법을 이용하여 콜레스테롤과 중성지방을 각각 아가로스 젤 전기영동을 시 행한 후, LDL, VLDL, HDL, CM 및 midband 등의 5 분획으로 나누어 지질양상을 검색하는 장비로서 최근 혈청 고지혈증의 양상을 검색하는데 이용되고 있다[3]. Toshimi 등[3]은 상기 방법이 지질검사에 대한 직선성, 상관성 및 정밀도 등을 고려할 때 기존의 효소법을 대치할 수 있다고 보고하였다.

LDL은 순환중 VLDL 대사과정에서 생성되는데, 그 구

성은 50%가 에스테르화된 콜레스테롤이며, 25%가 apoli-

poprotein (apo) B로 구성된 단백, 20%가 인지질, 그리

고 약간의 중성지방으로 이루어져 있다[2]. HDL은 대부분

이 단백질이며, 콜레스테롤과 인지질, 약간의 중성지방으로

이루어져 있다[4]. 본 연구에서는 혈청중성지방농도와 관계

없이 고콜레스테롤혈증군에서 정상대조군에 비해 LDL이

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높았다. 반면, HDL농도는 고콜레스테롤혈증군에선 정상지 질군에 비해 높았으나, 고중성지방혈증군에서는 정상대조군 에 비해 낮았으며, 오히려 고콜레스테롤/고중성지방혈증군에 서는 정상대조군과 차이가 없었다. HDL농도가 콜레스테롤 이나 중성지방농도에 따라 상하 값의 차이를 보이는 기전에 대해서는 좀 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다. 한편 본 결과에서는 고중성지방혈증군에서 혈청 VLDL농도가 높 았는데, 이는 12시간 공복후에 혈액을 채취하여 대부분의 혈청중성지방이 VLDL에 존재하였기 때문으로 생각된다 [5].

본 연구에서 m-LDL 양성비율은 정상대조군과 고콜레스 테롤혈증군에선 각각 29.8% 및 23.6%이었으며, 고중성지방 혈증군과 고콜레스테롤/고중성지방혈증군에선 각각 50.9%

및 39.3%로 정상대조군에 비하여 유의하게 높았다. 이러한 결과는 높은 중성지방의 농도와 m-LDL의 연관성을 시사한 다. 이는 중성지방이 풍부한 LDL일수록 입자가 작으며[6,7], 작은 입자를 갖는 LDL일수록 산화되기 쉬워 m-LDL을 보 다 잘 생성하기 때문으로 사료된다[8].

m-LDL은 LDL이 혈관벽으로 들어간 후 lipid와 apo-B에 의해서 LDL이 산화되고, phosphatidylcholine을 lysophos- phatidylcholine으로 수용화시키는 과정에서 생성되며, 또한 LDL 상호간에 응집하고 여러가지 변형을 거치면서 생성된다 [9]. 이러한 m-LDL은 monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)을 발현시키거나 단구세포를 자극하여 탐식세포를 생성하며, 탐식세포는 거품세포(foam cell)를 만든다. 또한 m-LDL은 탐식세포를 자극하여 cytokine들을 분비하는데, 이러한 cytokine들은 부착인자의 발현을 유도한다. 한편, 거 품세포는 성장인자나 metalloproteinase를 분비하여 기질을 분해시키거나 세포를 증식시킨다. 이런 작용을 통하여 m-LDL은 죽상경화증의 전구인자가 된다[10]. 또한 m-LDL 은 당뇨병이나 죽상경화증에서 당화 LDL이나 산화 LDL로 질병의 지표와 치료예후판정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며[11,12], 따라서 m-LDL은 관상동맥질환이나 당뇨병의 추적 관찰에 유용할 수 있다.

한편 저자들은 LDL과 m-LDL사이에 어떠한 관계가 있 는지 알아보기 위해 NCEP-ATP III guideline에 따라 LDL농도 100 mg/dL을 기준으로 LDL이 100 mg/dL이 상인 군과 100 mg/dL미만인 군으로 각각 나누어 변성 LDL 의 양성율을 비교하였다. 저LDL군과 고LDL군의 m-LDL 양성율은 각각 29.6% (42/142) 및이고, 고LDL군의 m-LDL 양성율은 27.1% (74/273)로 서로 유의한 차이가 없었다(결 과 미제시). 따라서, LDL농도는 m-LDL농도에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보였다. Kannel 등[13]은 산화 LDL과 혈청에서 측정한 LDL은 관계가 없고, 오히려 개개인의 항 산화상태가 산화 LDL의 혈청농도와 관련이 있다고 보고하 였다.

본 연구에서 정상대조군과 고지혈증군의 형별을 분류한 결과, 정상대조군에서는 유형이 결정되지 않은 예가 97.0%이

었으며, 고중성지방혈증군에선 IV형이 96.4%, 고콜레스테롤 혈증군은 IIa형이 58.4%, 고콜레스테롤/고중성지방혈증군은 IIb가 55.4%로서 각각 가장 높은 비율을 차지하였다. 이는 대체적으로 Fredrickson 유형에 합당한 결과로 사료되며, 이 미 수치로서 짐작할 수 있는 Fredrickson 유형 분류를 densitogram으로 시각화함으로서 어느 지질분획이 특히 증가 되었는가를 쉽게 알 수 있는 동시에 치료후 추적관찰에도 유 용할 것으로 보인다[14].

본 연구에서는 각 고지혈증군에 따라 각 지질의 혈청농 도와 나오는 유형, m-LDL의 분포에 대해 알아보았는데, 대학병원 외래 초진환자만을 대상으로 시행되어 질병 및 질 환군이 확정이 되지 않은 사례가 많아 임상질환이 아닌 지 질농도의 정도에 따라 환자군을 분류하고, 그 의의를 알아 보고자 하였기에 다소 미흡한 성적이라고 여겨진다. 따라서 다양한 질환군에 대한 의의 규명을 위해서는 향후 장 기간 에 걸친 추가적 연구가 필요할 것으로 사료된다.

요 약

배경: 최근 콜레스테롤과 중성지방을 각각 전기영동한 후 Chol/Trig Combo

^TM

(Helena Laboratories, Japan)로 구분 염색하여 그 양상을 검색하는 biphasic electrophoresis법이 소개되었다. 저자는 대학병원 내과 외래 초진환자를 대상으로 biphasic electrophoresis법을 이용하여 혈청 지질양상, Fredrickson 유형별 고지혈증 분 류 및 변성 LDL (modified LDL; m-LDL) 등을 조사하 였다.

방법: 2006년 4월부터 동년6월까지 전남대학교병원 내 과 외래를 방문한 초진 환자 415명을 대상으로 하였다.

ATP III guideline에 따라 콜레스테롤 200 mg/dL 및 중 성지방 150 mg/dL를 기준으로 대조군과 고지혈증 군으로 나누었다. 효소법으로 혈청 콜레스테롤과 중성지방을 측정 하였으며, 동시에 biphasic electrophoresis 후 분석 소프 트웨어(ED BANK, Helena Laboratories)를 이용하여 HDL, VLDL, LDL 및 m-LDL 등의 양상을 분석하였다.

결과: 고콜레스테롤혈증군은 정상대조군에 비해 HDL이 유의하게 낮았으며, LDL은 유의하게 높았다. 고중성지방혈 증군은 HDL, VLDL 수치 및 m-LDL의 양성율이, 그리고 고콜레스테롤/고중성지방혈증군은 VLDL, LDL 수치 및 m-LDL의 양성율이 대조군에 비하여 유의하게 높았다 (P<0.05). 한편 m-LDL 양성율은 대조군에서는 19.8%

(46/232), 고콜레스테롤혈증군은 23.6% (17.72), 고중 성지방혈증군에선 50.9% (28/55), 그리고 고콜레스테롤/

고중성지방혈증군에선 39.3% (22/56)이었다.

결론: 이 장비로 m-LDL을 측정할 수 있었다. LDL은

중성지방 농도와 관계없이 고콜레스테롤혈증군에서, 그리고

m-LDL의 양성율과 VLDL은 콜레스테롤 농도와 관계없이

고중성지방혈증군에서 각각 높았다.

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