Estrogenic Effects of endocrine disruptors and establishment of screening methods in mice

(1)

Korean J Vet Res

(2005) 45(4) : 545~552

545

실험동물에서의 환경호르몬 물질의 생체내 영향 및 검색법 정립에 대한 연구

정지윤·이영순*

서울대학교 수의과대학 (게재승인: 2005년 11월 28일)

Estrogenic Effects of endocrine disruptors and establishment of screening methods in mice

Ji-Youn Jung, Yong-Soon Lee*

College of Veterinary Medicine, Seoul National University, Seoul 151-742 Korea

(Accepted

:

November 28, 2005)

Abstract : The major protocol features of the rodent uterotrophic assay have been evaluated using a range of reference chemicals. The protocol variables considered include the selection of the test species and route of chemical administration, the age of the test animals, the maintenance diet used, and the specificity of the assay for estrogens. The rodents were ovariectomized under general anesthesia via bilateral flank incisions and randomly assigned to groups of 5 animals. Chemicals were DEHP, DBP, BPA and NP, were injected sc once daily with combinations of chemicals treatments for 3 days. In the results, the reported estrogenic chemicals DEHP and DBP were both negative in the single dose treatments. But, in the combinations of chemicals treatments, DEHP and DBP increased in bud number of mammary gland. Treatment of ovariectomized mice with combinations of other chemicals resulted in uterine and vaginal hyperplasia. The additive estrogenic effects were seen with the combinations of 17

β

-estradiol and DBP treatment. the competitive estrogenic effects were seen with the combinations of 17

β

-estradiol and nonylphenol, 17

β

-estradiol and bisphenol-A treatments. These results offers a sysmatic and mechanistically informative approach to assessing estrogenicity. it provides a useful profile of activity using a reasonable amount of resources and is compatible with the study of individual chemicals as well as the investigation of interactions among combinations of chemicals. The results described illustrate the intrinsic complexity of evaluating chemicals for estrogenic activities and conform the need for rigorous attention to experimental design and criteria for assessing estrogenic activity.

Key words : di-ethylhexyl phthalate, di-n-butyl phthalate, endocrine disruptors, estrogenic effects

서 론

Endocrine disruptors(EDs)

란

“

무처치생물의내분비계 에대하여그개체혹은그자손의세대어떤단계에서 든건강장해성의변화를일으키는외래성물질

”

^또는

“

생체의항상성

,

생식

,

발생

,

혹은행동에관여하는각종

생체호르몬등의합성

,

분비

,

생체내수송

,

수용체와의 결합

,

^그리고^그^{호르몬작용}^및^그^배제^등의^제^과정을

방해하는성질을가진외래성물질

”

을일컫는말이다

.

이러한내분비교란성물질중에서플라스틱에 유연재 로사용되고있는

di-ethylhexyl phthalate(DEHP)

^와

di-

ⁿ

- butyl phthalate(DBP)

가최근에문제시되고있다

.

*Corresponding author: Yong-Soon Lee

College of Veterinary Medicine, Seoul National University, Seoul 151-742, Korea [Tel: +82-2-880-1298, Fax: +82-2-876-7610, E-mail: leeys@snu.ac.kr]

(2)

Di-phthalate

^또는

bis-phthalate, DEHP

^로도^불리고^있

는이물질은플라스틱에서유연제로쓰이는액상의물

질이다

. DEHP

는우리나라에서만매년약

9

만톤이상

업적혹은의학적목적으로사용되고있는데

,

^플라스틱

의용도

(

^우의

,

^신발

,

^바닥재료

,

^식탁보

,

^장난감^등

)

^에^따

라서

1-40%

의

DEHP

를함유할수있으며

,

혈액튜브등

의의학용도구에도사용되고있다

.

^이러한

DEHP

^는^일

단플라스틱제품에사용되어진후에시간이경과하면 서서서히용출되며

,

따라서공기

,

흙

,

물등에광범위 하게분포할수있다

.

^또한

,

^음식물에^있어서도^포장재

,

제조과정

,

수송중에

DEHP

가잠재적으로들어갈수있

으며

,

육류에서도발견되고있으며

,

또한오일이나지방 성음식에더잘녹는성질을가지고있어서우유나치 즈에서최고농도로검출되었다는보고도있다

[7, 10].

DBP

는무색

,

무미

,

무취의 오일성상의액체이며

,

플 라스틱을유연하게만드는성질을가지고있어서카펫 트

,

페인트

,

접착제

,

헤어스프레이

,

로케트연료등에다

양하게 사용되고있다

. DBP

는쉽게 기화하지는않지

만

,

^일종의^가스로서^공기^중에^상당히^많은^양이^함유

될수있어서공기중의먼지와결합할수도있으며

,

일

반적으로공기중에서 수일내에분해된다

. DBP

는물

에잘녹지않으나더러운먼지입자가물과접촉시에 는물에서검출되기도한다

.

이러한

DBP

의자연계에서 의분해는박테리아가관련하는데박테리아의 종류및 온도에따라수일내지는수개월걸려서분해되기도 한다

[1].

이상에서의연구보고서에서보듯이

DEHP

^와

DBP

^는

모두환경에서인체에영향을줄수있는물질로서그 동안은안전한물질로판단되어왔으나

,

최근의동물실 험및인간에게서일어나는환경에의한생식기계통의 이상

,

^정자수의^감소^즉^{내분비교란성}^{물질이라는}^의심

을받고있는물질들이다

.

이러한물질들은그들하나하 나는독성을나타내기에는미약할지라도이러한여러 물질에생체가노출되었을때그들물질간의상승작용 에의한인체에의영향그리고체내에만성으로축적시 의영향을생각할때이러한내분비교란성물질에대 한연구가활발히이루어져야할것이다

.

또한

,

오늘날 우리가일상생활에서섭취하는환경호르몬물질들은

그하나하나마다의

EDs

^작용은^미약할^수^있으나

,

^그

러한작용이서로상가작용을일으킬때의위험요소는

아직까지명확히밝혀져있지않다

.

이러한

DEHP, DBP

가생체내만성독성뿐만아니라내분비계의 장애물 질로서최근에대두되고있는바본실험에서는이물 질을이용한생체내에서의내분비계장애및이를토대 로내분비계교란물질검색법의정립을위해서연구를 실행하였다

.

재료 및 방법

실험동물

대한실험동물센터에서암컷

9

주령마우스

(ICR) 80

마리를구입하여실험실환경에

1

주일간순화기간을두 고건강한개체만을선별하여사용하였다

.

^{지금까지의}

보고서에의하면랫드와마우스의내분비교란물질에 대한감수성이실험물질마다다르게나타났으나

[2,12],

이전 실험결과를 기준으로볼 때랫드와마우스에

DEHP, DBP

단독투여시의

estrogenic effect

에대한감 수성은유의적인차이가없게나타난바

,

^마우스를^실험

동물종으로선택하였다

.

순화기간이지난마우스에난 소적출술을실시한후

2

주간기간을두어난소적출이 완벽하게된마우스를실험에사용하였다

.

^예비사육^및

실험전기간동안사육환경은온도

23±2

^o

C,

상대습도

60±10%

를유지하였고

,

마우스를자연채광하에서케

이지

(polycarbonate, 26

^×

42

^×

18 cm,

^명진

,

^한국

)

^에^각각

5

마리씩 넣어사육하였으며

,

실험동물용사료

(

삼양사 료

,

한국

)

와식수를자유로이공급하였다

.

시험물질

시험물질인

DEHP, DBP, nonylphenol, bisphenol-A,

그 리고

17

^β

-estradiol (E2)

^을

Sigma (USA)

^사에서^구입하였

으며

,

실온·차광하에보관하며실험에사용하였다

.

투여 방법 및 투여 군의 구성

일반적으로내분비교란물질에대한검색방법에있 어서의투여경로는 피하주입과 복강주입이있으나

,

실험 하는물질의혼합투여시피하주입에대한보고가없으므 로피하주입으로투여하였으며

,

내분비교란물질의in

Fig 1. Change of uterus weight of mice exposed to

chemical mixture Each value represents mean

±

SD (n = 5)

C, corn oil 5 m

^l

/kg; E2,17

β

-estradiol 5

µ

g/kg; B, DBP

1,500 mg/kg; E, DEHP 1,500 mg/kg; b, bisphenol-A 100

mg/kg; N, nonylphenol 100 mg/kg *, significantly different

from control group (

p

< 0.05).

(3)

vivo검색법중하나인설치류

3

^일^자궁^증식^에세이^방법

에따라서투여횟수및투여기간은

1

^일

1

^회

, 3

^일간^투여

를원칙으로실험을실시하였다

.

투여군은총

16

개군으 로각군당

5

^마리의^마우스를^두어^실험에^{사용하였다}

.

시험군의 구성, 투여농도 및 용량

1)

^시험군의^구성

2)

용량 설정

: DEHP, DBP, Bisphenol-A, estradiol, nonylphenol

은 기존의 보고서에 근거하여

estrogenic

effect

^를^주는^{최소용량을}^투여^용량으로^{설정하였다}

[5,

6, 9].

3)

투여방법

: Bisphenol-A

는먼저

100% ethanol

에녹 인후

corn oil

^에

ethanol

^의^용량이

10%

^가^되도록^희석

하여투여하고

, estradiol, nonylphenol, DEHP

그리고

DBP

는

corn oil

에각군에 맞는용량을희석하여마리당

volume

^이

5 m

^l

/kg

^이^되도록^견갑부^피하에^{투여하였다}

.

실험 항목

1)

^시험^방법

난소적출된랫드및마우스를투여직전군분리한 다음시험물질을

3

일간매일

1

회투여하였다

.

임상관 찰및체중변화는매일관찰기록하였으며

,

^마지막^투여

후

24

시간경과시에부검을실시하였다

.

2)

^난소^적출술

Ketamin

^과

Rumpun

^을

9 : 1

^의^비율

(v/v)

^로^혼합하여^랫

드

,

마우스각각

2 m

l

/kg

이되도록복강에주입하여마 취시킨후

,

^요추

1-3

^번째에^해당하는^부위를

1.5 cm

^정

도절개하여피부및근육을분리한후난소를제거한 다음봉합하였다

.

난소적출의완벽하게되었는지의여 부를확인하기위해서수술후시험물질투여전

2

^주

동안질도말을통하여질상피세포의각화유무를판 독하였다

.

3)

조직학적인검사

10%

중성포르말린에고정한질

,

자궁

,

간장그리고신 장을탈수

,

^{파라핀침투}^및^포매한^후^조직^절편을^제작

하여

H&E

염색을하여광학현미경

(Olympus, Japan)

으 로관찰하였다

.

한편

,

광학현미경으로의관찰시질점 막상피세포의각화및높이

,

^{자궁체에서}^난관으로

1

^되

는부위를일정하게채취하여자궁점막상피세포의상 태및높이

,

그리고난관의직경을측정하였다

.

4)

유선조직의관찰

부검시채취한유선을슬라이드글라스에잘펴서 도말한다음

, glacial acetic acid

^와

100% ethanol

^을

1 : 3

으로섞은용액에

60

분간고정시킨다음

70% ethanol

과

증류수로 각각

15

분씩 조직을씻어낸 후

24

시간동안

alum carmine

^에^침적하여^염색을^실시하는

whole mount assay

법을 이용하였다

.

염색액인

alum carmine

은

1g

의

carmine

^과

2.5 g

^의

alum potassium

^을

500 m

^l의^증류수에

넣어섞은후

20

^분간^끓여서^다시

500 m

^l이^되도록^증

류수를부은후필터에여과하고

thymol 100 mg

을첨가

하여만들었다

. 24

^시간

alum carmine

^염색을^실시한^조

직슬라이드를탈수한후

toluene

^에^담궈서^{지방조직을}

분해하였고

, 1

주일이지난후

permount

로

slide glass

상 에

mounting

^을^실시하여

,

^{실체현미경}

(Olympus, Japan)

^으

로

terminal end buds

^와

terminal end ducts

^의^수를^유선

림프절을중심으로한일정한배율

(×20)

상에서관찰하

였다

.

5)

각종조직의

apoptosis

관찰

파라핀포매한질

,

^자궁

,

^간장^그리고^{신장조직에서의}

apoptosis

를관찰하기위하여

ApopTag kit(Oncor, USA)

를이용하여

TUNEL assay

를실시하였다

.

조직을탈파

라핀과정을거친후함수하여

proteinase K

^에

15

^분간

적용시킨후

, 2%

과산화수소에

5

분간담궈서내인성

peroxidase

를차단시켰다

. Digoxigenin-dUTP end labeled DNA

^를

anti-digoxigenin-peroxidase antibody

^로^검출하고

,

이를

0.05% DAB

를이용하여발색시킨후

, methylgreen

Group Dose

corn oil 5 m

^l

/kg

bisphenol-A 100 mg/kg

17

β

-estradiol 5

µ

g/kg

nonylphenol 100 mg/kg

DEHP 1,500 mg/kg

DBP 1,500 mg/kg

E2+DEHP E2 5

µ

g/kg + DEHP 1,500 mg/kg E2+DBP E2 5

µ

g/kg + DBP 1,500 mg/kg BPA+DEHP BPA 100 mg/kg + DEHP 1,500 mg/kg BPA+DBP BPA 100 mg/kg + DBP 1,500 mg/kg NP+DEHP NP 100 mg/kg + DEHP 1,500 mg/kg NP+DBP NP 100 mg/kg + DBP 1,500 mg/kg BPA+NP BPA 100 mg/kg + NP 100 mg/kg DEHP+DBP DEHP 1,500 mg/kg + DBP 1,500 mg/kg E2+BPA E2 5

µ

g/kg + BPA 100 mg/kg

E2+NP E2 5

µ

g/kg + NP 100 mg/kg

E2, 17

β

-estradiol; BPA, bisphenol-A; NP, nonylphenol

(4)

으로

5

^분간^염색하여^광학^{현미경으로}^{관찰하였다}

.

자료의 통계처리

부검시측정한모든장기및각조직에서산출된모

든수치들은분산분석

(one-way ANOVA)

^을^{실시하였다}

.

유의성은공히

95%(

p

< 0.05)

및

99%(

p

< 0.01)

의수준에 서검정하였다

.

결 과

투여 기간 중의 체 중 변화

투여전기간을통하여투여물질에의하여체중이 변했다고여겨지는변화를관찰할수없었으며

,

^통계학

적으로도유의적인차이를나타내는군은없었다

.

Uterus weight 및 fluid의 존재 유무

전체음성대조군인

corn oil

군을제외한

15

개군중에 서통계학적으로자궁무게의유의적인증가를보인군 은

8

^{개군이었으며}

,

^이^군들의^각각의^자궁^무게는^다음

과같이

4

개그룹으로나눌수있었다

.

즉

, 150 mg

이상 인그룹

, 100-150 mg

인그룹

, 60-100 mg

인그룹

,

그리고

60 mg

^이하인^그룹으로^나누어^보았다

.

150 mg

이상인 그룹에는

17

β

-estradiol(156.94),17

β

- estradiol + DEHP(157.52 mg),17

^β

-estradiol + DBP (169.12 mg)

^으로

3

^{개군이었으며}

,

^자궁^무게가

100-150 mg

인군으로는

17

β

-estradiol + bisphenol-A(106.24 mg),17

β

- estradiol + nonylphenol(118.96 mg)

^군으로

2

^{개군이었다}

. 60-100 mg

^의^자궁^무게를^보인^군은

nonylphenol(67.84 mg), nonylphenol + DBP(67.8mg), nonylphenol+ bisphenol -A(67.64 mg), bisphenol-A(61.04 mg)

^군으로

4

^개군이고

, 60mg

이하를보인군은

DEHP(42.02mg), DBP(40.72mg), bisphenol-A + DEHP(56.88 mg), bisphenol-A + DBP(58.78 mg), nonylphenol+ DEHP(52.96mg), DEHP + DBP (42.24 mg),

그리고음성대조군인

corn oil(45.48 mg)

군으로

7

개 군이었다

(Fig 1).

한편

,

^자궁^내

fluid

^의^존재는^자궁^무게가

100 mg

^이

상인군에서의모든개체에서발견되었으며

,

그이하무 게에서의군에서는발견되지않았다

.

유선조직의 변화

이번실험에서의환경호르몬물질또는환경호르몬 물질로의심되는물질들을혼합투여시에유선조직의

변화를관찰해본결과는다음과같다

(Table 1).

①

17

β

-estradiol

을단독또는다른물질과혼합투여시 의모든군에서유선조직에서의

bud

^의^숫자가^음성대조

군에비하여증가한것을관찰할수있었다

.

②자궁무게에있어서통계학적으로유의적인무게 증가를나타낸모든군

(17

β

-estradiol

을처치한모든군

, nonylphenol, nonylphenol+ DBP, nonylphenol + bisphenol-

A)

^에서^유선의

bud

^숫자가^증가한^것을^관찰할^수^있었다

.

③자궁무게에있어서유의적인증가를보이지않은 투여군중에서

bisphenol-A

단독투여군

, bisphenol-A

와 의혼합투여군

, DEHP + DBP

^혼합^{투여군에서의}^유선에

서

bud

숫자가증가한것을관찰할수있었다

.

④

corn oil

군을제외한총

15

개군중

terminal end buds

와

terminal ducts

^에서^대조군에^비해서^유의적인^차이를

보인군은

5

개군이었으며

,

그중자궁무게에있어서유

의적인차이를보이지않은

DEHP + DBP

군이있었다

.

자궁 및 질 상피세포의 관찰

ICR mouse

^에

17

^β

-estradiol, DEHP, DBP, nonylphenol,

bisphenol-A

^를^{혼합투여한}^후

,

^각^군에서의^자궁^및^질

내막상피세포를관찰한결과는다음과같다

. Table 1. Change of terminal ductal structures in mammary

glands of female mice exposed to chemical mixture. C, corn oil 5 m

l

/kg; E2,17

β

-estradiol 5

µ

g/kg

Group No. of Structure

Terminal end buds Terminal ducts

Corn oil 85±9

^**

56±6

^**

E2 + DBP 112±14

^*

52±8

E2 162±23

^*

82±7

^*

E2 + DEHP 138±17

^*

71±5

^*

E2 + bisphenol-A 119±9

^*

64±7

E2 + nonylphenol 107±8

^*

62±6

nonylphenol 117±10

^*

67±4

nonylphenol + DBP 104±9 68±7

bisphenol-A +

nonylphenol 108±7 66±6

bisphenol-A 133±11

^*

77±8

^*

bisphenol-A + DEHP 129±12

^*

75±3

^*

bisphenol-A + DBP 137±15

^*

71±8

nonylphenol + DEHP 108±9 68±6

DEHP 78±7 57±5

DBP 83±9 60±6

DEHP + DBP 123±12

^*

72±5

^*

*

;

significantly different from control group (p < 0.05).

**

;

Each value represents mean ± SD (n = 5).

(5)

질내막상피세포층의높이를측정한결과

,

^음성대조

군

(13.3

^µ

m)

^에^비하여^유의적인^증가를^보인^군은^전체

음성대조군을제외한

15

개군중에서

12

개군으로나타났 는데

, 17

^β

-estradiol, nonylphenol, bisphenol-A

^단독^또는

혼합투여한모든군이유의적인증가를나타내었으며

,

질내막상피세포층의높이에따라서크게네부분으로 나눌수있었다

.

^즉

,

^질^내막^{상피세포층의}^높이를

100

^µ

m

이상인 군

, 50-100

µ

m

인 군

, 30-50

µ

m

인 군

,

그리고

30

µ

m

이하인군으로나누어보았다

.

질내막상피세포층이

100

^µ

m

^이상인^군은

17

^β

-estradiol (155

µ

m), 17

β

-estradiol + DBP(172.5

µ

m), 17

β

-estradiol + bisphenol-A(148.75

^µ

m), 17

^β

-estradiol+nonylphenol (121.25

µ

m), nonylphenol(106.25

^µ

m), nonylphenol+ DBP(113.75

µ

m), bisphenol-A + nonylphenol(120

µ

m)

이었다

.

질내막 상피세포층의 높이가

50-100

µ

m

인군은

17

β

-estradiol + DEHP(91.25

^µ

m), bisphenol-A+ DBP(66.25

^µ

m)

^이었으며

, 30-50

µ

m

이하인군은

bisphenol-A(45

µ

m), bisphenol-A + DEHP(41.25

µ

m), nonylphenol + DEHP(34.16

µ

m)

이었 으며

, 30

^µ

m

^이하인^군은

DEHP(15

^µ

m), DBP(12.5

^µ

m), DEHP + DBP(17.5

µ

m),

corn oil (13.3

µ

m)

이었다

(Fig 2).

자궁내막상피세포층의높이를측정한결과

,

^음성대

조군

(13.75

µ

m)

에비하여유의적인증가를보인군은전

체

15

개군중에서

10

개군에서유의적인증가를나타냈 다

.

^자궁^내막^{상피세포층의}^높이를^크게

3

^부분으로^나

누어보면

,

상피세포층높이가

30-50

µ

m

인군

, 20-30

µ

m

인군

,

^그리고

20

^µ

m

^이하인^군으로^나누어^보았다

.

^자

궁내막상피세포층의 높이가

30-50

^µ

m

^인^군은

17

^β

- estradiol+DBP(48.75

µ

m), 17

β

-estradiol(50

µ

m), 17

β

-estradiol +DEHP(48.75

^µ

m), 17

^β

-estradiol+nonylphenol(45

^µ

m), 17

^β

-estradiol + bisphenol-A(40

µ

m), nonylphenol+ DBP(46.25

µ

m)

로서

6

개군이었으며

, 20-30

µ

m

인군은

nonylphenol (26.25

^µ

m), bisphenol-A(25

^µ

m), bisphenol-A + DEHP(22.5

µ

m), nonylphenol + DEHP(20

µ

m)

로서

4

개군이었다

. 20

µ

m

이하인 군은

bisphenol-A + nonylphenol(16.25

µ

m), bisphenol-A+DBP(17.5

^µ

m), DEHP(11.25

^µ

m), DBP(13.75

µ

m), DEHP + DBP(11.25

µ

m),

corn oil(13.75

µ

m)

로서

6

개군이었다

(Fig 3).

자궁 난관의 직경 측정

자궁난관의직경을측정한결과음성대조군인

corn

oil(1,100

^µ

m)

^에서의^직경에^비하여^유의적인^증가를^보

인군은

15

개군중

10

개군이었다

.

자궁난관의직경은그크기에따라서크게세부분 으로나누어보았다

. 2,000

^µ

m

^이상인^그룹과

1,500-2,000

µ

m

인그룹

,

그리고

1,000-1,500

µ

m

인그룹으로나눌수

있었다

. 2,000

^µ

m

^이상인 ^그룹은

17

^β

-estradiol + DBP (2,912.5

µ

m), 17

β

-estradiol(2,062.5

µ

m), 17

β

-estradiol+ non- ylphenol(2,350

µ

m)

으로서

3

개군에서관찰되었고

,

직경의 크기가

1,500-2,000

^µ

m

^인^군은

17

^β

-estradiol+DEHP(1,850

µ

m), 17

β

-estradiol+ bisphenol-A(1,937.5

µ

m), nonylphenol (1,500

^µ

m), nonylphenol + DBP(1,537.5

^µ

m), bisphenol-A + nonylphenol(1,562.5

µ

m), bisphenol-A + DBP(1,600

µ

m), nonylphenol + DEHP(1,537.5

µ

m)

로서

7

개군이었으며

, 1,500

^µ

m

^이하인^군은

bisphenol-A(1,162.5

^µ

m), bisphenol- A + DEHP(1,375

µ

m), DEHP(1,212.5

µ

m), DBP(1,275

µ

m), DEHP + DBP(1,312.5

µ

m),

corn oil (1,100

µ

m)

으로서

6

개군에서관찰되었다

(Fig 4).

표적장기의 중량변화

시험물질인

DEHP

^의^표적^독성^장기인^{간장에서의}

무게를측정한결과

, DEHP

^를^단독 ^또는^혼합^투여한

군에서전반적으로음성대조군인

corn oil(1.88 g)

에비

Fig 2. Change of vaginal epithelium height of mice exposed to chemical mixture. Each value represents mean

±

SD (n = 5) C, corn oil 5 m

l

/kg; E2,17

β

-estradiol 5

µ

g/kg; B, DBP 1 , 500 mg/kg; E, DEHP 1 , 500 mg/kg; b, bisphenol-A 100 mg/kg; N, nonylphenol 100 mg/kg *;

significantly different from control group (

^p

< 0.05).

Fig 3. Change of uterine epithelial cell height of mice exposed to chemical mixture. Each value represents mean

±

SD (n = 5). C, corn oil 5 m

^l

/kg; E2,17

β

-estradiol 5

µ

g/kg; B, DBP 1 , 500 mg/kg; E, DEHP 1 , 500 mg/kg; b, bisphenol-A 100 mg/kg; N, nonylphenol 100 mg/kg *;

significantly different from control group (

p

<0.05).

(6)

하여무게의증가를관찰할수있었으며특히통계학적

으로유의성을보인그룹은

DEHP

^단독^투여군

(2.3 g)

^과

DEHP

와

nonylphenol

을혼합투여

(2.66 g)

한

2

개군이었다

(Fig 5).

시험물질인

DBP

^의^표적^독성^장기인^신장의^무게를

측정한결과

,

모든군에서음성대조군과비교하여유의

적인변화를관찰할수없었다

(Fig 6).

Apoptosis 발생빈도

본실험에서구성된

16

개군에서의간

,

신장

,

그리고

자궁과질에서

apoptosis

^의^{발생빈도를}^{측정하였다}

.

^실험

결과모든군에서의

apoptosis

는대조군에비하여그빈

도에차이가나타나지않았으며

,

^단지

DBP 1,500 mg/kg

단독투여군중

1

^{마리에서의}^{자궁조직에}

apoptosis

^의^발

현이현저히증가한것을관찰할수있었다

.

고 찰

DEHP, DBP

는생체내만성독성뿐만아니라내분비

계의장애물질로서최근에대두되고있는물질로서

,

^환

경호르몬물질로알려진

bisphenol-A, nonylphenol

^과^혼

합투여시in vivo에서의

estrogenic effect

작용여부에대 하여알아보았다

.

본논문에서는 in vivo 실험방법중

Rodent 3-day uterotrophic assay

^와

Modified rodent 3-day uterotrophic assay

를취합하여실험에적용하였다

.

또한

,

기존에실험항목으로언급되어있지않는

whole mount

assay

^와

TUNEL assay

^를^아울러^실험에^{적용하였다}

.

^검

사항목으로는자궁및질의무게

,

유선조직에서의

bud

의숫자양상

,

^자궁^조직에서^자궁^내막^{상피세포층의}

높이

,

질내막상피세포층의높이

,

자궁난관의직경을 측정하는방법을사용하였다

.

유선조직에서의

DEHP + DBP

^군에서

bud

^의^숫자는^{조직에서의}^유의적인^변화가

없는것과는달리유선에서의

bud

의숫자가음성대조

군에비하여증가한양상을보였기때문에

whole mount

assay

^도^검색법에^있어서^중요한^지표로^여겨진다

.

^결론

적으로

,

환경호르몬검색항목에있어서지금까지일반 적으로사용된자궁의무게보다는자궁과질에서의내 막상피세포층의조직학적인검사와

whole mount assay

도유용한검색방법일것으로판단되어진다

.

간과신장의무게를측정한결과

DEHP

를투여한군

과

DEHP

^와

nonylphenol

^을^혼합^투여한^군에서의^간^조

직의비대를관찰할수있었는데

,

이러한결과가

nony-

lphenol

이

DEHP

의

peroxisomal proliferation

작용에대하

여

promoter

^로^작용하는^것으로^여겨진다

.

^앞으로^좀더

연구되어야할것은

DEHP

와같은성질즉

, hypolipidemic non-genotoxic carcinogenic

한다른독성물질과함께병

용실험하여결과를비교해보는연구와

female rat

^에서

의장기간투여시내분비계장애에대한연구가또한

Fig 4. Change of diameter in uterine tubule (

±

SD) at mice exposed to chemical mixture Each value represents mean

±

SD (n = 5) C, corn oil 5 m

^l

/kg; E2,17

β

-estradiol 5

µ

g/kg; B, DBP 1,500 mg/kg; E, DEHP 1,500 mg/kg; b, bisphenol-A 100 mg/kg; N, nonylphenol 100 mg/kg *;

significantly different from control group (

^p