국내산 가시파래 추출물의 Phytochemicals와 항산화 활성
백승연․김다희․김수진․김미리 충남대학교 식품영양학과
Phytochemicals and Antioxidant Properties of Enteromorpha prolifera Extract in Korea
Seung Yeon Baek, Da Hee Kim, Su Jin Kim, and Mee Ree Kim Department of Food & Nutrition, Chungnam National University
ABSTRACT Enteromorpha prolifera (EP) in Korea contains an abundance of phytochemicals such as vitamins, phyco- cyanin, chlorophyll, flavonoids, and phenolic compounds. The first purpose of this study was to evaluate the antioxidant activities of three extracts added with ethanol and fractionated with distilled water or ethyl acetate, respectively. The second purpose was to analyze the bioactive compounds of EP by liquid-chromatography mass spectrometry (LC/MS).
The phycocyanin, chlorophyll, flavonoid, and total phenolic compound contents of EP extract with ethyl acetate (EPEA) were the highest among all extracts. For the antioxidant properties of EPEA, the EC50, IC50, and IC100 values were 24.9, 5.4, and 5.9 mg/mL, respectively. Based on these results, EPEA had the highest antioxidant activities compared to EP extract with distilled water and ethanol. In addition, the main bioactive compound of EPEA was analyzed by LC/MS and classified by library researching. In the LC/MS analysis, the bioactive compounds in EPEA were determined in order of decreasing amount to be carotenoid-derived dihydroactinidiolide, canthaxanthin, and methio- nine-derived dimethylsulphoniopropionate. In conclusion, these results suggest that EPEA, which has many bioactive phytochemicals and high antioxidant activity, is a potential healthy and functional food.
Key words: Enteromorpha prolifera, phytochemicals, antioxidant properities, dihydroactinidiolide, dimethylsulphonio- propionate
Received 2 April 2020; Accepted 3 May 2020
Corresponding author: Mee Ree Kim, Department of Food and Nutrition, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-42-821-6837
Author information: Seung Yeon Baek (Graduate student), Da Hee Kim (Graduate student), Su Jin Kim (Graduate student), Mee Ree Kim (Professor)
서 론
전 세계적으로 친환경 식품에 대한 관심이 높아지면서 해 조류에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 해조류에는 식이 섬유뿐만 아니라 신체를 구성하고 대사를 돕는 칼슘, 철분, 마그네슘, 요오드 등의 무기질, 비타민 A, B군, C, 두뇌 발달 과 인지능 개선 효과가 있는 다가불포화지방산 등이 풍부하 다(Lee 등, 2014). 이에 Lim(2012)은 다시마 분말을 스펀 지케이크에 첨가하였고, Park 등(2015)은 매생이 분말을 국 수에 첨가하였고, Baek 등(2018)은 김을 모닝빵에 첨가하 는 등 해조류를 기존의 식품에 첨가하여 건강 지향적 제품을 개발하고자 하는 연구도 활발하게 진행되고 있다. 또한 해조 류에는 육상 식물체보다 더욱 다양하고 항산화 활성이 우수 한 phytochemicals이 함유되어 있어 해조류 추출물을 이용
하여 생리활성을 돕는 바이오 소재에 관한 연구도 활발하게 진행되고 있다(Gómez-Guzmán 등, 2018; Yoshie-Stark 등, 2002). 이에 Cho와 Bang(2004)은 국내산 다시마 추출 물을 동물의 식이에 첨가하여 항당뇨와 항산화 효과에 대해 보고하였고, Son 등(2016)은 국내산 감태, 개서실, 모란갈 파래, 꽈배기 모자반, 톳 등 20종의 해조류를 메탄올로 추출 하여 항치매 활성에 대해 보고하였으며, Kim 등(2019b)은 상처 치유에 관여하는 소재로 국내산 미역과 미역귀를 에탄 올로 추출하여 성분을 규명하였다. 특히 해조류의 phyto- chemicals 중 하나인 카로티노이드는 β-카로틴, lutein, vi- olaxanthin, zeaxanthin, neoxanthin, fucoxanthin 등의 primary carotenoid와 astaxanthin, canthaxanthin, echi- neone 등의 secondary carotenoid로 분류되어 연구되고 있으며, 섭취 시 다양한 생리활성 기능을 가지고 있어 만성 질환, 암, 심혈관계 질환, 눈 건강과 관련된 질병의 치료 보조 제, 약리 식품으로 각광받고 있다(Poojary 등, 2016; Fer- nández-Sevilla 등, 2010).
가시파래(Enteromorpha prolifera)는 중국과 일본, 국내 에서 서산, 태안, 무안, 신안 등 서해안과 남해안의 갯벌에서 서식하는 갈파래과 녹조류이다. 최근에는 국내산 가시파래 의 영양적 우수성이 보고되면서 일본, 유럽, 대만, 미국 등에
Extracting milled Enteromorpha prolifera 200.0 g with 95% ethanol for overnight at room temperature and repeating three times
▼
Centrifuging the extract at 3,000 rpm for 20 min at 4°C
▼
Concentrating the crude extract (21.7 g) using rotary evaporator and a vacuum drier
▼
Dissolving the crude extract added with distilled water and partitioning with ethyl acetate
▼
Freeze-drying the fraction with distilled water at −70°C (2.1 g)
Concentrating the fraction with ethyl acetate using rotary evaporator and a vacuum drier (2.6 g) Fig. 1. The scheme of preparing the three extracts of Enteromorpha prolifera.
서 고급 식재료로 수출되고 있고 국내에서는 가시파래를 다 양한 식품에 접목한 연구가 활발하게 진행되고 있다(Kim 등, 2019a; Baek과 Kim, 2019). 또한 가시파래에 함유된 함황 다당류는 항산화, 항당뇨, 항염 효과가 알려져 국내외 에서 가시파래 추출물에 관한 활발한 연구가 이루어지고 있 다(Cho 등, 2010; Kim 등, 2011; Yu 등, 2017). 그뿐만 아니라 가시파래에는 높은 항산화 활성을 가진 클로로필, 피코시아닌, 플라보노이드, 폴리페놀 등이 함유되어 있어 Yan 등(2019)과 Lin 등(2019)은 중국에서 채취된 가시파래 를 에탄올로 추출하여 중국산 가시파래에 함유된 플라보노 이드류와 폴리페놀류의 항당뇨 효과와 유효 성분에 대해 보 고하였다(Baek과 Kim, 2019). 그러나 국내산 가시파래 추 출물에 대한 phytochemicals에 대한 연구는 미비한 실정이 며 Cho 등(2011)이 국내산 가시파래 추출물의 항산화 효과 에 대한 연구를 보고하였으나, 가시파래는 pH, 온도 등에 따라 쉽게 변색이 일어나므로 본 연구에서는 가시파래의 함 유된 클로로필, 피코시아닌, 카로티노이드 등의 변질을 최소 화하여 phytochemicals을 추출하여 항산화 효과와 유효 성 분에 대해 연구를 하고자 하였다(Baek과 Kim, 2019).
따라서 본 연구에서는 phytochemicals이 풍부하여 건강 기능성 제품으로 가능성이 있는 국내산 가시파래를 추출하 여 용매에 따른 추출물의 성분과 항산화 성분을 비교하고, 가시파래 추출물의 유효 성분을 규명하여 국내산 가시파래 의 추출물에 대한 기초 자료를 제공하고자 하였다.
재료 및 방법
시료 준비
본 연구를 위한 가시파래는 충남 서산(송원식품, 서산, 한 국)에서 2019년 2월에 재배된 것을 구입하여 시료로 사용했 으며, 가시파래 추출물은 Cho 등(2011)의 방법을 참고하고 수정하여 분석에 이용하였다. 시료 준비 방법은 Fig. 1과 같 다. 가시파래 분말 200.0 g에 95% 에탄올을 첨가하여 흔들 어준 뒤, 하루 동안 침지시킨 후 Whatman filter paper
(No.2, Whatman Co., Buckinghamshire, UK)로 여과하는 것을 세 번 반복하였다. 이후 가시파래의 에탄올 추출물을 4°C, 3,000 rpm에서 20분 동안 원심분리(Combi-514R, Hanil, Hwaseong, Korea) 하여 상층액을 분리하였다. 상층 액을 rotary evaporator(N-1110, EYELA, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 감압 농축하여 휘발시킨 뒤 에탄올 추출 물 21.7 g을 얻었다. 이후 에탄올 추출물을 3차 증류수에 녹인 뒤 에틸아세테이트를 첨가하여 분액 여두로 반복 추출 하여 극성과 무극성 추출물을 얻었다. 분리된 증류수 층은 동결 건조하여 물 추출물 2.1 g을 얻었고, 에틸아세테이트층 은 감압 농축하여 에틸아세테이트 추출물 2.6 g을 얻었다.
준비된 시료들은 -20°C에서 보관되어 실험에 사용되었다.
피코시아닌 함량
Shim 등(2010)의 방법을 참고하여 시료 2 g에 메탄올 20 mL를 넣고 4°C에서 200분간 방치하여 균질화한 뒤, 3,000 rpm, 4°C에서 20분간 원심분리(Hanil) 하여 상등액을 취해 filter paper에 거른 후 분광광도계(Epoch Microplate Spec- trophotometer, BioTeck Instruments, Winooski, VT, USA)를 사용하여 620과 652 nm에서 흡광도(A)의 값을 아 래의 식에 대입하여 피코시아닌 함량을 나타내었다.
C-PC (C-phycocyanin, μg/mL)＝[A620nm－0.474×
A652nm]/5.34×1000
Allo-PC (allophycocyanin, μg/mL)＝[A652nm－0.208×
A620nm]/5.09×1000
Total phycocyanin (μg/mL)＝C-PC＋Allo-PC
클로로필 함량
클로로필 추출 및 측정은 Chappelle 등(1992)의 방법을 참고하였으며 시료 0.1 g에 dimethyl sulfoxide 5 mL를 넣 어 blending 시켜, 30°C의 암조건에서 24시간 동안 색소를 추출한 후, 분광광도계(BioTeck Instruments)를 이용하여 664와 648 nm에서 흡광도(A)를 측정하여 아래의 식에 대 입하여 클로로필 함량을 나타내었다.
Table 1. Condition of mass spectrometry Sheath gas flow rate
Aux gas flow rate Sweep gas flow rate Spray voltage Capillary temp.
Aux gas heater temp.
48 arbitrary units 11 arbitrary units 2 arbitrary units 3.5 kV
256°C 413°C Chlorophyll a (μg/mL)＝12.25×A664nm－2.79×A648nm
Chlorophyll b (μg/mL)＝21.50×A648nm－5.10×A664nm Total chlorophyll (μg/mL)＝Chlorophyll a+
Chlorophyll b
플라보노이드 함량
각 추출물 200 mg에 메탄올 1 mL를 넣고 시료로 사용했 으며 에탄올과 에틸아세테이트 추출물은 20배 희석하여 사 용하였다. 시료 50 μL에 90% diethylene glycol 450 μL, 1 N NaOH 10 μL를 넣고 37°C water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준검량선 은 naringin(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 농도별로 반응시켜 작성하였다.
총 페놀 함량
총 페놀 함량을 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent가 페 놀성 화합물에 의해 몰리브덴 청색으로 환원되는 원리로 측 정하였다(Singleton 등, 1999). 플라보노이드와 동일하게 시료 용액을 준비하여 측정하였다. 시료 50 μL에 증류수 50 μL와 0.2 N Folin-Ciocalteu’s reagent 500 μL를 넣고 5분 간 반응시킨 후 7.5% Na2CO3 400 μL를 넣고 빛을 차단하여 30분간 반응시키고 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표 준검량선은 포화 tannic acid(Yakuri Pure Chemicals Co., Ltd., Kyoto, Japan)를 사용하였다.
SOD 유사 활성(superoxide dismutase-like activity) SOD 유사 활성은 Marklund와 Marklund(1974)의 방법 에 따라 과산화수소(H2O2)로 전화시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사 활성으로 나타 내었다. 플라보노이드와 동일하게 시료 용액을 준비한 뒤, 시료 용액 40 μL에 Tris-HCl의 완충용액(50 mM Tris＋10 mM EDTA, pH 8.5) 260 μL와 7.2 mM pyrogallol 20 μL를 가하여 25°C에서 10분간 반응시킨 후 1 N HCl 0.1 mL를 가하여 반응을 정지시키고 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 420 nm에서 측정하였다. SOD 유사 활성은 시료 첨가 구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.
Activity (%)＝
(
1－ AbsAbssample)
×100blank
DPPH 라디칼 소거능
플라보노이드와 동일하게 시료 용액을 준비하여 각각 농 도별로 희석하고 시료 용액 50 μL에 150 μL의 1.5×10-4 mM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액을 가한 후 30분간 실온에서 방치한 다음 515 nm에서 흡광도를 측 정하여 라디칼 소거능(%)을 다음 식으로 계산한 후 농도별 라디칼 소거능에 대한 검량선에서 라디칼 소거능이 50%가 되는 농도인 IC50 값을 구하였다(Blois, 1958). 표준물질은 ascorbic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다.
Free radical scavenging
effect (%) ＝ AbsDPPH-Abssample AbsDPPH ×100
Hydroxyl 라디칼 소거능
플라보노이드와 동일하게 시료 용액을 준비하여 농도별 로 희석한 시료 30 μL에 buffer 70 μL를 넣고 30 mM de- oxyribose, 1 mM ascorbic acid, 1 mM EDTA, 1 mM FeCl3, 1 mM H2O2 용액을 각각 20 μL씩 넣고 37°C에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 2% TCA 용액 200 μL와 1%
TBA 용액 200 μL를 넣고 교반하여 100°C에서 20분간 반 응 후 냉각하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도별 라디칼 소거능(%)을 아래 식으로 계산하여 검량선을 그린 후 라디칼 소거능이 100%가 되는 농도인 IC100 값을 구하였 다. 표준물질은 methyl sulfoxide(Daejung Co., Daejeon, Korea)를 사용하였다.
Free radical scavenging
effect (%) ＝ Absblank-Abssample Absblank ×100
LC-MS 분석
성분 분석을 위해 LC-MS(Ultimate 3000 RS_UHPLC, Q-Exactive Orbitrap, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하였고 분석 조건은 Lin 등(2019)을 참고 하였다. 분석을 위해 각각 5 μL 시료가 주입되었고, 컬럼은 C18 컬럼(Acquity uplc BEH C18, 1.7 μm, 2.1×100 mm, Waters, Worcester, MA, USA)을 이용하였다. 컬럼 온도 는 50°C 이하를 유지했으며, flow rate는 0.3 mL/min, 이동 상 용매는 0.1% formic acid가 희석된 물(A)과 메탄올(B)을 사용하여 분석하였다. 용매 구배 조건은 초기 A와 B를 90:
10의 비율로 0~5분 동안 흘려준 뒤, 13~18분을 B 100%로 흘려주었다. 이후 초기 조건과 동일하게 18~20분 흘려주는 설정을 하였다. 이온화 조건은 positive로, scan range는 80~1,200 m/z로 설정하였다. 질량분석기의 source는 elec- trospray ionization(ESI)을 이용하여 spray voltage 3.5 kV로 분석하였고, 자세한 질량분석기 조건은 Table 1에 나 타내었다. 각각 검출된 성분의 m/z cloud는 mass spectral database(HighChem Ltd., Bratislava, Slovakia)에 의해 확인되었다.
통계처리
본 실험 결과는 3회 반복하여 측정한 값을 SPSS 24.0 (Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chi-
Table 2. Phycocyanin and chlorophyll content of Enteromor- pha prolifera (EP) extracts
Content EPDW1) EPET EPEA Phycocyanin
(μg/mL) C Allo Total
6.4±0.2c2)3) 12.2±0.6b 18.6±0.8c
167.0±31.1b 538.9±8.8a 705.9±22.7b
352.9±2.3a 545.9±3.1a 898.9±5.3a Chlorophyll
(μg/mL) a b Total
4.9±0.3c 8.9±0.5c 13.8±0.8c
30.2±0.1a 34.5±1.1b 64.7±1.0b
29.3±0.1b 53.3±0.4a 82.6±0.5a
1)EPDW, EP extract with distilled water; EPET, EP extract with ethanol; EPEA, EP extract with ethyl acetate.
2)All data are mean±SEM.
3)Different letters (a-c) in the same row are significantly differ- ent by Duncan’s multiple range test at P<0.05.
A B
Fig. 2. Flavonoid (A) and total phenolic compounds (B) content of Enteromorpha prolifera (EP) extracts. EPDW, EP extract with distilled water; EPET, EP extract with ethanol; EPEA, EP extract with ethyl acetate. All data are mean±SEM. Different letters (a-c) above the bars are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05.
cago, IL, USA) software package 프로그램을 이용하여 기술통계를 실시하고 평균과 표준오차를 구하여 나타냈으 며, 분산분석(ANOVA)을 실시하여 유의성이 있는 경우에 Duncan의 다중범위검정(Duncan’s multiple range test)을 이용하여 시료 간의 유의차를 검정하였다(P<0.05).
결과 및 고찰
피코시아닌과 클로로필 함량
가시파래 추출물의 피코시아닌 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같으며 C-피코시아닌 함량은 증류수 추출물에서 6.4 μg/mL, 에탄올 추출물에서 167.0 μg/mL, 에틸아세테 이트 추출물에서 352.9 μg/mL로 나타났다(P<0.05). Allo- 피코시아닌 함량은 증류수 추출물에서 12.2 μg/mL, 에탄올 추출물에서 538.9 μg/mL, 에틸아세테이트 추출물에서 545.9 μg/mL로, 에틸아세테이트 추출물에서 총 898.9 μg/mL의 가장 많은 피코시아닌이 추출되었다(P<0.05). 일반적으로 피코시아닌은 남조류를 구성하는 phycobiliprotein과 관련 이 있는 수용성 색소로 라디칼 소거능이 뛰어나 항산화, 항 염, 항암 작용을 하는 물질로 알려져 있다(Bhat와 Madya- stha, 2000; Romay 등, 1998; Subhashini 등, 2004). 국내 에서는 Baek 등(2019)의 가시파래 첨가 마카롱, Kim 등 (2019a)의 가시파래 첨가 곤약젤리 등 다양한 제품에 색을
내고 기능성을 부여하기 위해 식품에 첨가하여 사용되고 있 으며 해외에서는 식품뿐만 아니라 화장품, 생명공학, 제약 등에도 이용되고 있다(Eriksen, 2008). 이에 가시파래 에틸 아세테이트 추출물에서 피코시아닌이 다량으로 추출되었으 므로 항산화 활성이 뛰어날 것으로 생각된다.
가시파래 추출물의 총 클로로필 함량은 증류수 추출물이 13.8 μg/mL, 에탄올 추출물이 64.7 μg/mL, 에틸아세테이 트 추출물이 82.6 μg/mL로 에틸아세테이트 추출물에서 유 의적으로 가장 높게 나타났다(Table 2). 클로로필 a의 함량 은 에탄올 추출물이 30.2 μg/mL로 가장 높게 나타났으며 클로로필 b의 함량은 에틸아세테이트 추출물이 53.3 μg/mL 로 가장 높게 나타났다. 클로로필은 porphyrin 고리의 중앙 에 마그네슘 이온이 결합해 있는 형태의 tetrapyrrole 구조 의 녹색 색소로, 메탄올과 phytol이 결합하고 있어 지용성을 나타낸다(Lee 등, 2009b). 클로로필의 porphyrin 구조는 항산화 활성을 갖게 하는 필수적인 요소로, DPPH와 같은 자유 라디칼을 제거하는 것으로 알려져 있으며, 클로로필 a, b는 구조적인 차이로 b에는 알데하이드(CHO)가 결합해 있어 a보다 높은 항산화 활성을 가진다(Lanfer-Marquez 등, 2005; Endo 등, 1985). 이에 각 추출물에 클로로필의 함량은 항산화 활성에 영향을 줄 것으로 생각되며, 총 함량 과 클로로필 b의 함량이 높은 에틸아세테이트 추출물의 항 산화 활성이 높을 것으로 예상된다.
플라보노이드 함량
가시파래 추출물의 플라보노이드 함량은 물 추출물이 3.1 mg/mL, 에탄올 추출물이 26.2 mg/mL, 에틸아세테이트 추 출물이 190.3 mg/mL로 나타났으며(Fig. 2A), 에틸아세테 이트 추출물의 플라보노이드 함량이 유의적으로 가장 높았 다(P<0.05). Baek과 Kim(2019)의 연구에서는 가시파래를 메탄올로 추출･농축하여 플라보노이드 함량을 측정했으며, 15.3 mg/mL 함유된 것으로 보고한 것과 관련하여 에탄올을 이용하는 것이 phytochemical 추출에 용이한 것으로 생각 된다. Yoshie-Stark 등(2002)은 녹조류에 함유된 플라보노 이드는 rutin, caffeic acid, catechol, hesperidin, morin 등이 있다고 보고했으며, Yan 등(2019)의 가시파래 에탄올
A B
C
Fig. 3. SOD like activity (A), DPPH radical scavenging (B), and hydroxyl radical scavenging (C) of Enteromorpha prolifera (EP) extracts. EPDW, EP extract with distilled water; EPET, EP extract with ethanol; EPEA, EP extract with ethyl acetate.
All data are mean±SEM. Different letters (a-c) above the bars are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<
0.05.
추출물의 플라보노이드 연구에서는 eriodictyol-O-glucu- ronide, kaempferol 등이 함유되어 있다고 보고했고 항산 화 작용으로 type 2-당뇨 모델의 인슐린 민감성과 간 손상 을 개선해 포도당 대사에 도움을 주는 항당뇨 작용을 하는 것으로 보고하였다. 이와 관련하여 본 연구의 가시파래 추출 물에서도 플라보노이드가 검출되었으므로 플라보노이드류 의 항산화 효과, 항당뇨 효과 등이 있을 것으로 사료되며, 생화학적인 효과를 위한 추가적인 연구가 진행된다면 중요 한 자료로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
총 페놀 화합물 함량
페놀 화합물은 크게 페놀산, 비플라보노이드, 플라보노이 드류로 나뉘며 그중 해조류에 함유된 비플라보노이드류 화 합물 중 항산화 활성이 우수하여 ROS(reactive oxygen species)에 의한 산화적 스트레스를 막아 세포의 손상 방지, 항염 작용을 한다고 보고된 phlorotannin은 eckols, fuha- lols, fucophlorethols, phlorethols 등을 포함한다(Gómez- Guzmán 등, 2018). 가시파래 추출물의 총 페놀 화합물의 함량(Fig. 2B)은 물 추출물이 57.6 mg/mL, 에탄올 추출물 이 37.2 mg/mL, 에틸아세테이트 추출물이 349.8 mg/mL로 나타났으며, 에틸아세테이트 추출물이 유의적으로 가장 높 았고 에탄올 추출물이 가장 낮았다(P<0.05). 이는 플라보노 이드 함량 결과와는 상이한 결과로 Yang 등(2001)의 연구 에 따르면 다른 구조의 catechin이 -OH기의 영향으로 항산 화 활성의 차이가 있다고 보고한 것과 Baek 등(2017)의 당 알코올 도라지 정과 연구에서 설탕과 당알코올의 -OH기 개 수, 구조가 페놀 화합물의 함량에 영향을 미친 것과 관련하 여 물 추출물에 다량 함유된 다당류가 결과에 영향을 미쳤을 것으로 생각된다(Cho 등, 2010). 이에 가시파래 에틸아세테 이트의 추출물에는 다양한 종류의 페놀 화합물이 존재할 것 으로 생각되며 항산화, 항염 작용 등의 효과가 있을 것으로
사료된다.
SOD 유사 활성
가시파래 추출물의 항산화 활성을 비교하기 위한 SOD 유사 활성은 EC50 값이 생체 내의 ROS를 제거하는 SOD와 50%의 유사한 효과를 나타내는 농도를 나타내는 것으로 값 이 낮을수록 높은 항산화 활성을 나타낸다(Fig. 3A). 물 추 출물이 68.0 mg/mL, 에탄올 추출물이 24.3 mg/mL, 에틸아 세테이트 추출물이 24.9 mg/mL를 나타냈는데, 에탄올과 에틸아세테이트 추출물의 항산화 활성이 물 추출물에 비해 유의적으로 높은 것으로 나타났고(P<0.05), 에탄올과 에틸 아세테이트의 유의적 차이는 나타나지 않았다(P>0.05).
Baek과 Kim(2019)이 보고한 가시파래 메탄올 추출물의 EC50 값은 166.4 mg/mL로 나타난 것과 관련하여 본 연구에 서 사용한 추출 조건이 가시파래의 phytochemical 추출에 용이한 것으로 생각되며, 차후 가시파래 추출물의 약학적 활용에 중요한 자료로 사용될 것으로 생각된다.
DPPH 라디칼 소거능
가시파래 추출물의 항산화 활성을 비교하기 위한 DPPH 라디칼 소거능은 라디칼 소거능에 대한 검량선에서 라디칼 의 소거능이 50%가 되는 농도인 IC50 값으로 계산하여 나타 내었다(Fig. 3B). 가시파래 추출물의 IC50 값은 물 추출물이 155.2 mg/mL, 에탄올 추출물이 11.9 mg/mL, 에틸아세테 이트 추출물이 5.4 mg/mL로 유의적으로 가장 낮은 값을 나타냈으며, 에틸아세테이트 추출물의 항산화 활성이 유의 적으로 가장 높았다(P<0.05). 이는 각각의 추출물에 함유된 phytochemicals의 영향일 것으로 사료된다. Shanab 등 (2011)의 Enteromorpha compressa 추출물의 항산화 활 성 연구에서도 에탄올, 물 추출물보다 에틸아세테이트의 DPPH 라디칼 소거능이 더 높게 나타났으며, 에틸아세테이
Fig. 4. TIC (total ion chromatogram) of the extract of Enteromorpha prolifera with ethyl acetate by UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS.
트를 첨가한 해조류의 추출물에는 클로로필 a, b, 카로티노 이드, 알칼로이드, 플라보노이드, 페놀 화합물 등이 함유되 어 있다고 보고한 것과 유사한 결과로 생각된다(Shanab 등, 2011).
Hydroxyl 라디칼 소거능
가시파래 추출물의 항산화 활성을 비교하기 위한 hy- droxyl 라디칼 소거능의 결과를 IC100 값으로 계산한 결과는 Fig. 3C와 같다. IC100은 hydroxyl 라디칼을 100% 환원시 키는 데 필요한 농도로 값이 낮을수록 항산화 활성이 높은데 (Yeo와 Shahidi, 2019), 물 추출물이 238.6 mg/mL, 에탄올 추출물이 49.7 mg/mL, 에틸아세테이트 추출물이 5.9 mg/
mL로 에틸아세테이트 추출물의 항산화 활성이 유의적으로 가장 높은 것으로 나타났다(P<0.05). 이는 본 연구의 플라 보노이드, 페놀 화합물 함량, DPPH 라디칼 소거능과 유사한 결과이다. 항산화 활성이 우수한 천연물의 추출물은 ROS에 의한 산화적 스트레스를 막아 histamine, serotonin, pro- inflammatory cytokines, 면역 세포 등 염증 반응에 작용하 여 항염증 효과를 갖게 된다(Geronikaki와 Gavalas, 2006).
Lee 등(2008)의 용매에 따른 가시파래 추출물 연구에서는 LPS로 RAW 264.7 세포에 염증 반응을 유도했을 때 물, 에탄올, 부탄올, 디클로로메탄, 헥산 등의 용매에 비해 에틸 아세테이트 추출물에서 NO 생성 수준과 pro-inflamma- tory cytokines이 감소했다고 보고했으며, 이와 관련하여 본 연구의 항산화 활성 결과는 유의미한 결과를 나타낸 것으 로 생각된다. 따라서 본 연구의 항산화 실험 결과를 토대로
평가했을 때 가시파래 에틸아세테이트 추출물은 항산화 및 항염 효과가 우수한 물질로 향후 다양한 in vivo 실험을 통한 효과가 입증된다면 염증성 질환을 포함한 산화적 스트레스 에 의한 질병을 예방하고 치료하는 데 후보물질로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
LC/MS를 이용한 phytochemicals 분석
피코시아닌, 클로로필, 플라보노이드, 총 페놀 화합물, 항 산화 실험을 통해 얻은 결과를 토대로 항산화 활성이 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 추출물의 성분을 알아보고자 LC/MS를 이용하여 분석한 total ion chromatogram을 Fig.
4에 나타내었다. 전체 peak area는 10,569,052,048로, 3만 여 개의 화합물이 검출되었다. LC/MS를 통해 검출된 3만여 개의 화합물을 library를 통해 매칭하고 Cho 등(2011), Yamamoto 등(2014), Sun 등(2016), Baek과 Kim(2019), Yan 등(2019), Lin 등(2019), Baek 등(2020)의 가시파래 의 향 성분에 관한 연구를 참고하여 당류, 단백질, 아미노산, 지질, 지방산, unknown 화합물 등의 성분을 제외한 유의미 한 peak들을 선별하여 가시파래 에틸아세테이트 추출물에 서 검출된 phytochemicals의 결과를 Fig. 5에 나타내었다.
가시파래 에틸아세테이트 추출물에서 가장 많이 검출된 phytochemical은 dihydroactinidiolide(DA)로 전체 면적 의 1.54%(peak area: 162,280,482)를 차지하였다. DA는 해조류의 카로티노이드, 특히 β-카로틴이 빛이나 열에 의해 서 분해되거나 lipoxygenase에 의해 분해되어 생성된다 (Klok 등, 1984; Bosser 등, 1995; Isoe 등, 1969). Baek과
A
B
C
D
E
F
Fig. 5. Mass spectrum graph and intensity of dihydroactinidiolide (A), canthaxanthin (B), dimethylsulphoniopropionate (C), pheo- phorbide a (D), fucoxanthin (E), and violaxanthin (F) in the extract of Enteromorpha prolifera with ethyl acetate.
Kim(2019)의 가시파래 성분 분석에서 카로티노이드가 검 출된 것으로 보아 가시파래의 에틸아세테이트 추출물에서 검출된 DA도 카로틴에서 유래된 것으로 생각된다. Yama- moto 등(2014)의 가시파래의 휘발성 화합물 분석에서도 검 출되었으며 Sun 등(2016)의 가시파래 분획물에서 DA와 같 은 β-카로틴의 분해물인 loliolide, isololiolide가 검출된 것 과 관련하여 유의미한 결과로 생각된다. Das 등(2018)은
Aβ23-35로 ROS 생성을 유도한 세포 실험에서 DA가 높은
항산화 작용으로 신경 세포에 대한 보호 효과를 나타내어 알츠하이머 치료 후보물질로 사용할 수 있을 것으로 보고한 바 있다. 이에 가시파래 에틸아세테이트 추출물에 대한 in vitro 및 in vivo 실험으로생화학적 연구가 이루어진다면 약리학적으로 유용한 물질로 사용될 수 있을 것으로 사료된 다.
다음은 canthaxanthin으로 전체 면적의 1.2%(peak area:
135,581,005)를 차지하였다. Canthaxanthin은 해조류에 함유된 카로티노이드의 일종이며 높은 항산화 활성으로 항 암, 항염증 작용을 하는 것으로 알려져 있다(Boominathan 과 Mahesh, 2015; Chew 등, 1999; Mathews-Roth, 1982).
다음으로 검출된 dimethylsulphoniopropionate(DMSP)는 전체 면적의 1.01%(peak area: 107,168,264)를 차지하였 다. DMSP는 해조류에 함유된 메티오닌으로부터 물질대사 로 만들어지는 화합물로 같은 갈파래과인 창자파래에도 검 출되었던 것과 유사하다(Gage 등, 1997). 또한 Baek 등 (2020)의 가시파래의 향 성분 분석에서도 메티오닌에서 유 래된 dimethyl sulfide와 methyl sulfide가 가장 많이 검출 된 것과 관련하여 유의미한 결과로 생각된다. Sunda 등 (2002)은 해조류에 함유된 DMSP는 hydroxyl 라디칼(･OH) 과 반응하여 소거시키는 효과적인 항산화 물질로 작용할 수 있다고 보고한 것과 관련하여 본 연구의 hydroxyl 라디칼 소거능에서 가시파래의 에틸아세테이트 추출물의 항산화 활성이 가장 높게 나온 것과 관련된 결과로 생각된다. 또한 DMSP는 포유류의 신경 세포에도 작용하여 세포 성장에 관 여하고, 세포 독성을 막아주는 역할을 하여 신경 보호 효과 가 있는 것으로 알려져 가시파래의 에틸아세테이트 추출물 의 신경 보호 효과에 대한 연구가 추가로 진행된다면 약리학 적으로 유용한 물질로 사용될 수 있을 것으로 생각된다 (Wichmann 등, 2016).
다음으로 많이 검출된 화합물은 pheophorbide a로 전체 면적의 0.76%(peak area: 80,764,435)를 차지하였다. Cho 등(2011)의 가시파래에 95% 에탄올을 첨가하여 60°C에서 2시간 동안 추출한 뒤 유기 용매로 분획하여 항산화 활성을 평가한 연구에서는 추출물의 항산화 활성에 영향을 미치는 주요 화합물로 pheophorbide a가 검출된 것과 관련하여 유 의미한 결과로 생각된다. Pheophorbide a는 클로로필에서 phytol기와 마그네슘 이온이 떨어지면서 생성되는 갈색 화 합물로 항산화, 항염 작용을 하며 해조류에 함유된 phloro- tannin보다 항산화 활성이 높은 것으로 알려져 본 연구의
항산화 결과와 관련하여 유의미한 것으로 생각된다(Lee 등, 2009b; Okai와 Higashi-Okai, 1997; Cho 등, 2011). 또한 본 연구의 추출물은 60°C의 고온이 아닌 상온에서 추출하였 으므로 pheophorbide a의 함량이 비교적 적었을 것으로 생 각된다(Cho 등, 2011).
또한 전체 면적의 0.12%(peak area: 12,616,396)를 차 지하는 fucoxanthin은 미역, 다시마, 감태와 같은 갈조류에 서 많이 검출되는 카로티노이드의 일종이며, violaxanthin 으로부터 생합성되기도 하는 물질로 항산화, 항염, 항암, 항 당뇨, 항이뇨, 항비만 작용을 하는 것으로 알려져 있다 (Boominathan과 Mahesh, 2015; Maeda 등, 2008; Lee 등, 2009a; Mikami와 Hosokawa, 2013). Hu 등(2018)의 연구 에서는 fucoxanthin이 세포의 자멸사를 막아주며 항산화 효 소의 발현과 관련된 Nrf2/HO-1 pathway를 활성화해 뇌의 신경 세포를 보호한다고 보고하였으며, Xiang 등(2017)은 fucoxanthin이 치매의 원인 물질인 β-amyloid의 생성을 막 아준다고 보고한 것과 관련하여 본 연구의 가시파래 에틸아 세테이트 추출물은 추가적인 연구를 통해 최근에 각광받고 있는 치매 예방 물질 혹은 치료제로 사용될 수 있을 것으로 생각된다. 다음으로 전체 면적의 0.11%(peak area:
11,235,245)를 차지한 violaxanthin이 검출되었으며, 녹조 류에서 주로 검출되는 카로티노이드의 일종으로 항염작용 을 하는 것으로 알려져 있다(Mikami와 Hosokawa, 2013;
Soontornchaiboon 등, 2012). Baek과 Kim(2019)의 연구 에서 가시파래에 카로티노이드가 함유되어 있다고 보고한 것과 관련하여 본 연구의 LC/MS 분석에서 다양한 종류의 카로티노이드류 화합물이 검출된 것은 유의미한 것으로 생 각된다.
이외에도 가시파래의 에틸아세테이트 추출물에서는 극소 량의 astaxanthin, apocarotenoid, apocarotenal, chlor- ophyllin, lutein, zeaxanthin, 다가불포화지방산, benzal- dehyde, 가시파래에 함유된 메티오닌 유래 향 성분인 me- thional, methanethiol, lipoxygenase에 의해 생성된 지방 산화물인 heptanal 등이 검출되었다(Baek 등, 2020; Ya- mamoto, 2014). 또한 flavonone, trans-stilbene, 4,4′- dinitrostilbene, triiodophloroglucinol, naringenin, phe- nylnaringenin, xanthone 등이 극소량 검출되었으며, 이와 같은 화합물들은 플라보노이드와 페놀 화합물 결과에 영향 을 미쳤을 것으로 생각된다. 식물에서 유래하는 phyto- chemicals의 경우 용매의 극성, 추출 온도, 시료의 종류, 보 관 등에 따라 추출되는 물질들이 다르므로 다양한 방법으로 추출한다면 주요 화합물이 달라질 수 있다.
요 약
본 연구는 비타민, 무기질, phytochemcials 등이 풍부하다 고 알려진 가시파래를 물, 에탄올, 에틸아세테이트에 추출하 여 시료로 얻어 항산화 활성을 평가하고 유효 성분을 밝혀내
고자 하였다. 피코시아닌, 클로로필, 플라보노이드 함량을 측정한 결과 에틸아세테이트 추출물에서 각각 898.9 μg/
mL, 82.6 μg/mL, 190.3 mg/mL로 함량이 가장 높았으며, 에탄올 추출물, 물 추출물 순으로 함량이 적었다. 총 페놀 화합물 함량을 측정한 결과 에틸아세테이트 추출물의 함량 이 349.8 mg/mL로 가장 높았고 에탄올 추출물의 함량이 37.2 mg/mL로 가장 낮았다. 이는 에탄올 추출물보다 물 추출물에 페놀 화합물의 결과에 영향을 미치는 다당류의 -OH기가 상대적으로 높아 영향을 미쳤을 것으로 사료되었 다. 이후 SOD 유사 활성, DPPH 라디칼 소거능, hydroxyl 라디칼 소거능을 통한 항산화 활성 평가에서도 가시파래 에 틸아세테이트 추출물의 항산화 활성이 가장 높게 나타났으 며, 이는 에틸아세테이트에 추출된 피코시아닌, 클로로필, 플라보노이드, 페놀 화합물의 영향일 것으로 생각되었다. 천 연물 추출물의 항산화 활성은 산화적 스트레스에 의한 염증 반응에 관여하여 항염증 효능을 나타내며, 용매별 가시파래 추출물의 항염 효과 평가에서도 에틸아세테이트 추출물의 효과가 가장 우수한 것으로 나타났다. 이와 관련하여 가시파 래의 에틸아세테이트 추출물의 우수한 항산화 활성을 기반 으로 한 in vivo 실험의 결과가 뒷받침된다면 염증뿐만 아니 라 산화적 스트레스에 의한 질병의 치료 혹은 물질로 이용될 수 있을 것으로 생각된다. 항산화 활성을 평가한 결과를 바 탕으로 가시파래 에틸아세테이트 추출물의 항산화 활성에 영향을 미치는 유효 성분을 알아보기 위해 LC/MS로 분석을 진행하였다. 가시파래 에틸아세테이트 추출물에서 가장 많 이 검출된 phytochemical은 카로티노이드계 화합물들로 dihydroactinidiolide(DA), canthaxanthin, fucoxanthin, violaxanthin이었다. 이 중 가장 많이 검출된 것은 DA로 β- 카로틴으로부터 빛이나 열에 의해서 분해되거나 β-카로틴 이 lipoxygenase에 의해 분해되어 생성된 것으로 생각되었 다. 다음으로 많이 검출된 화합물은 dimethylsulphonio- propionate(DMSP)로 해조류에 함유된 메티오닌으로부터 물질대사로 만들어지는 화합물로 가시파래의 향 성분 분석 에서도 메티오닌에서 유래된 dimethyl sulfide와 methyl sulfide가 가장 많이 검출된 것과 관련하여 유의미한 결과로 생각되었다. 다음으로 많이 검출된 화합물은 pheophorbide a로 에틸아세테이트 추출물에서 클로로필이 다량 검출된 것 과 관련하여 추출 과정에서 phytol기와 마그네슘 이온이 떨 어지면서 생성된 것으로 사료되었다. 이외에도 가시파래의 에틸아세테이트 추출물에서는 소량의 astaxanthin, apoca- rotenoid, apocarotenal, chlorophyllin, zeaxanthin, 다가 불포화지방산, benzaldehyde, 가시파래에 함유된 메티오닌 유래 향 성분인 methional, methanethiol, lipoxygenase 에 의해 생성된 지방산화물인 heptanal 등이 검출되었다.
이상의 결과를 종합해볼 때, 가시파래 에틸아세테이트 추출 물에는 피코시아닌, 클로로필, 플라보노이드, 페놀 화합물 등의 항산화 활성이 우수한 phytochemicals이 다량 함유되 어 있으며, 특히 항염, 신경 세포 보호 효과가 있는 것으로
알려진 카로티노이드계의 화합물과 메티오닌에서 유래된 DMSP가 다량 존재하여 항산화 활성에 영향을 미치는 것으 로 보인다. 따라서 가시파래 에틸아세테이트 추출물의 phytochemicals을 이용한 세포 및 동물 실험이 이루어진다 면 생화학적 효과를 기대할 수 있을 것이며, 본 연구 결과는 가시파래의 건강 기능성 식품으로 개발하기 위한 중요한 기 초자료로 사용될 것으로 생각된다.
감사의 글
이 논문은 2020년 지역대학우수과학자지원사업으로 한국 연구재단의 재원을 받아 수행된 연구임(2017R1D1A3B03 027867).
REFERENCES
Baek SY, Kim EJ, Li FY, Choi HJ, Kim MR. Physicochemical properties and antioxidant activities of tetraploid ‘Etteum’ va- riety Platycodon grandiflorum Jungkwa substituted for su- crose with different sugar alcohols. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2017. 12:1477-1485.
Baek SY, Kim MR. Comparison of quality characteristic and anti- oxidant activity of Enteromorpha prolifera from Seosan and Muan in Korea. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2019. 48:1070- 1078.
Baek SY, Kim SB, Kim MR. Antioxidant activities and phys- icochemical property of butter morning bread added with dried lave. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2018. 47:1242-1250.
Baek SY, Sha X, Hwang MH, Kim MR. Physicochemical prop- erties and antioxidant activities of macarons added with En- teromorpha prolifera powder. J Korean Soc Food Sci Nutr.
2019. 48:1373-1382.
Baek SY, Youn SY, Oh JS, Oh SW, Kim DH, Kim SJ, et al.
Analysis of aromatic compounds of Enteromorpha prolifera using electronic nose and GC/MS. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2020. 49:344-355.
Bhat VB, Madyastha KM. C-Phycocyanin: a potent peroxyl rad- ical scavenger in vivo and in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 2000. 275:20-25.
Blois MS. Antioxidant determinations by the use of stable free radical. Nature. 1958. 181:1199-1200.
Boominathan M, Mahesh A. Seaweed carotenoids for cancer therapeutics. In: Kim SK, editor. Handbook of Anticancer Drugs from Marine Origin. Springer, Berlin, Germany. 2015. p 185- 203.
Bosser A, Paplorey E, Belin JM. A simple way to (±)-dihydro- actinidiolide from β-Ionone related to the enzymic co-oxida- tion of β-carotene in aqueous solution. Biotechnol Prog. 1995.
11:689-692.
Chappelle EW, Kim MS, McMurtrey JE. Ratio analysis of re- flectance spectra (RARS): an algorithm for the remote estima- tion of the concentrations of chlorophyll A, chlorophyll B, and carotenoids in soybean leaves. Remote Sens Environ. 1992.
39: 239-247.
Chew BP, Park JS, Wong MW, Wong TS. A comparison of the anticancer activities of dietary β-carotene, canthaxanthin and astaxanthin in mice in vivo. Anticancer Res. 1999. 19:1849- 1853.
Cho JY, Bang MA. Hypoglycemic and antioxidative effects of
dietary sea-tangle extracts supplementation in streptozotocin- induced diabetic rats. Korean J Nutr. 2004. 37:5-14.
Cho M, Lee HS, Kang IJ, Won MH, You S. Antioxidant proper- ties of extract and fractions from Enteromorpha prolifera, a type of green seaweed. Food Chem. 2011. 127:999-1006.
Cho M, Yang C, Kim SM, You S. Molecular characterization and biological activities of watersoluble sulfated polysaccha- rides from Enteromorpha prolifera. Food Sci Biotechnol.
2010. 19:525-533.
Das M, Prakash S, Nayak C, Thangavel N, Singh SK, Manisan- kar P, et al. Dihydroactinidiolide, a natural product against Aβ25-35 induced toxicity in Neuro2a cells: Synthesis, in silico and in vitro studies. Bioorg Chem. 2018. 81:340-349.
Endo Y, Usuki R, Kaneda T. Antioxidant effects of chlorophyll and pheophytin on the autoxidation of oils in the dark. Ⅱ.
The mechanism of antioxidative action of chlorophyll. J Am Oil Chem Soc. 1985. 62:1387-1390.
Eriksen NT. Production of phycocyanin－a pigment with appli- cations in biology, biotechnology, foods and medicine. Appl Microbiol Biotechnol. 2008. 80:1-14.
Fernández-Sevilla JM, Acién Fernández FG, Molina Grima E.
Biotechnological production of lutein and its applications.
Appl Microbiol Biotechnol. 2010. 86:27-40.
Gage DA, Rhodes D, Nolte KD, Hicks WA, Leustek T, Cooper AJ, et al. A new route for synthesis of dimethylsulphoniopro- pionate in marine algae. Nature. 1997. 387:891-894.
Geronikaki AA, Gavalas AM. Antioxidants and inflammatory disease: synthetic and natural antioxidants with anti-inflam- matory activity. Comb Chem High Throughput Screen. 2006.
9:425-442.
Gómez-Guzmán M, Rodríguez-Nogales A, Algieri F, Gálvez J.
Potential role of seaweed polyphenols in cardiovascular-as- sociated disorders. Mar Drugs. 2018. 16:E250. doi: 10.3390/
md16080250.
Hu L, Chen W, Tian F, Yuan C, Wang H, Yu H. Neuroprotec- tive role of fucoxanthin against cerebral ischemic/reperfusion injury through activation of Nrf2/HO-1 signaling. Biomed Phar- macother. 2018. 106:1484-1489.
Isoe S, Hyeon SB, Sakan T. Photo-oxygenation of carotenoids.
I. The formation of dihydroactinidiolide and β-ionone from β-carotene. Tetrahedron Lett. 1969. 10:279-281.
Kim DH, Kim SJ, Kim MR. Physicochemical properties and antioxidant activities of allulose konjac jelly added with En- teromorpha prolifera. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2019a.
48:967-976.
Kim J, Lee CM, Kim SG. Phytochemical analysis and wound healing potential of ethanol extract of sea mustard and sea mustard sporophyll. Biomed Sci Lett. 2019b. 25:313-320.
Kim JK, Cho ML, Karnjanapratum S, Shin IS, You SG. In vitro and in vivo immunomodulatory activity of sulfated polysac- charides from Enteromorpha prolifera. Int J Biol Macromol.
2011. 49:1051-1058.
Klok J, Baas M, Cox HC, de Leeuw JW, Schenck PA. Loliolides and dihydroactinidiolide in a recent marine sediment probably indicate a major transformation pathway of carotenoids. Tetra- hedron Lett. 1984. 25:5577-5580.
Lanfer-Marquez UM, Barros RMC, Sinnecker P. Antioxidant ac- tivity of chlorophylls and their derivatives. Food Res Int.
2005. 38:885-891.
Lee BM, Kim CJ, Kim CT, Seo JJ, Kim IH. Concentration of fucoxanthin from Ecklonia cava using supercritical carbon dioxide. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2009a. 38:1452-1456.
Lee JH, Kim MR, Min HS, Lee YE, Song ES, Kwon SJ, et al.
The food & principle of cookery－a scientific approach. 3rd
ed. Kyomunsa, Paju, Korea. 2014. p 196-200.
Lee SY, Jung HJ, Lee YE, Kim MR, Kim MR, Song HN. Food chemistry. Powerbook, Goyang, Korea. 2009b. p 255-267.
Lee UJ, Hyeon CG, Yoon WJ, Kim JY, Kim DS, Yang EJ, et al. Extract of Ulva prolifera and its use as anti-inflammatory medicine. Korea Patent 10-2008-0090252. 2008.
Lim EJ. Quality characteristics of sponge cake added with La- minaria japonica powder. Korean J Food Nutr. 2012. 25:922- 929.
Lin G, Liu X, Yan X, Liu D, Yang C, Liu B, et al. Role of green macroalgae Enteromorpha prolifera polyphenols in the modulation of gene expression and intestinal microflora pro- files in type 2 diabetic mice. Int J Mol Sci. 2019. 20:E25.
doi: 10.3390/ijms20010025.
Maeda H, Tsukui T, Sashima T, Hosokawa M, Miyashita K.
Seaweed carotenoid, fucoxanthin, as a multi-functional nu- trient. Asia Pac J Clin Nutr. 2008. 17:196-199.
Marklund S, Marklund G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient as- say for superoxide dismutase. Eur J Biochem. 1974. 47.3:469- 474.
Mathews-Roth MM. Antitumor activity of β-carotene, canthaxan- thin and phytoene. Oncology. 1982. 39:33-37.
Mikami K, Hosokawa M. Biosynthetic pathway and health bene- fits of fucoxanthin, an algae-specific xanthophyll in brown seaweeds. Int J Mol Sci. 2013. 14:13763-13781.
Okai Y, Higashi-Okai K. Potent anti-inflammatory activity of pheophytin a derived from edible green alga, Enteromorpha prolifera (Sujiao-nori). Int J Immunopharmacol. 1997. 19:355- 358.
Park BH, You MJ, Cho HS. Quality characteristics of dried noo- dle containing Capsosiphon fulvescens powder. J East Asian Soc Diet Life. 2015. 25:300-308.
Poojary MM, Barba FJ, Aliakbarian B, Donsì F, Pataro G, Dias DA, et al. Innovative alternative technologies to extract car- otenoids from microalgae and seaweeds. Mar Drugs. 2016.
14:E214. doi: 10.3390/md14110214.
Romay C, Armesto J, Remirez D, González R, Ledon N, García I. Antioxidant and anti-inflammatory properties of C-phyco- cyanin from blue-green algae. Inflamm Res. 1998. 47:36-41.
Shanab SMM, Shalaby EA, El-Fayoumy EA. Enteromorpha com- pressa exhibits potent antioxidant activity. J Biomed Bio- technol. 2011. Article ID: 726405.
Shim EK, Kim HJ, Kim HR, Kim MR. Quality characteristics of riceyeotgangjung with added spirulina powder. J East Asian Soc Diet Life. 2010. 20:888-895.
Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventós RM. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Method Enzymol. 1999.
299:152-178.
Son HJ, Um MY, Kim I, Cho S, Han D, Lee C. In vitro screen- ing for anti-dementia activities of seaweed extracts. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2016. 45:966-972.
Soontornchaiboon W, Joo SS, Kim SM. Anti-inflammatory ef- fects of violaxanthin isolated from microalga Chlorella ellip- soidea in RAW 264.7 macrophages. Biol Pharm Bull. 2012.
35:1137-1144.
Subhashini J, Mahipal SV, Reddy MC, Mallikarjuna Reddy M, Rachamallu A, Reddanna P. Molecular mechanisms in C-phy- cocyanin induced apoptosis in human chronic myeloid leuke- mia cell line-K562. Biochem Pharmacol. 2004. 68:453-462.
Sun YY, Wang H, Guo GL, Pu YF, Yan BL, Wang CH. Isola- tion, purification, and identification of antialgal substances in green alga Ulva prolifera for antialgal activity against the
common harmful red tide microalgae. Environ Sci Pollut Res Int. 2016. 23:1449-1459.
Sunda W, Kieber DJ, Kiene RP, Huntsman S. An antioxidant function for DMSP and DMS in marine algae. Nature. 2002.
418:317-320.
Wichmann H, Brinkhoff T, Simon M, Richter-Landsberg C.
Dimethylsulfoniopropionate promotes process outgrowth in neural cells and exerts protective effects against tropodithietic acid. Mar Drugs. 2016. 14:E89. doi: 10.3390/md14050089.
Xiang S, Liu F, Lin J, Chen H, Huang C, Chen L, et al. Fucoxan- thin inhibits β-amyloid assembly and attenuates β-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. J Agri Food Chem.
2017. 65:4092-4102.
Yamamoto M, Baldermann S, Yoshikawa K, Fujita A, Mase N, Watanabe N. Determination of volatile compounds in four commercial samples of Japanese green algae using solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometry. Sci World J. 2014. Article ID: 289780.
Yan X, Yang C, Lin G, Chen Y, Miao S, Liu B, et al. Antidia- betic potential of green seaweed Enteromorpha prolifera fla- vonoids regulating insulin signaling pathway and gut micro- biota in type 2 diabetic mice. J Food Sci. 2019. 84:165-173.
Yang X, Chen L, Park J, Shen S, Wang Y. Mechanisms of scav- enging reactive oxygen species of tea catechins. Proceedings of the 6th International Symposium on Green Tea. 2001 May 18. Seoul, Korea. p 111-120.
Yeo J, Shahidi F. Revisiting DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhy- drazyl) assay as a useful tool in antioxidant evaluation: a new IC100 concept to address its limitations. J Food Bioactives.
2019. 7:36-42.
Yoshie-Stark Y, Hsieh YP, Suzuki T. Distribution of flavonoids and related compounds from seaweeds in Japan. J Tokyo Univ Fish. 2002. 89:1-6.
Yu Y, Li Y, Du C, Mou H, Wang P. Compositional and structural characteristics of sulfated polysaccharide from Enteromorpha prolifera. Carbohydr Polym. 2017. 165:221-228.
