아로니아 식초 제조를 위한 초산균 동정 및 식초 품질 특성 비교 엄현주

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아로니아 식초 제조를 위한 초산균 동정 및 식초 품질 특성 비교

엄현주¹․윤향식¹․권누리¹․정연정¹․김영호¹․홍성택¹․한남수²

1충청북도농업기술원

2충북대학교 식품생명공학과

Comparison of the Quality Properties and Identification of Acetic Acid Bacteria for Aronia Vinegar

Hyun-Ju Eom¹, Hyang-Sik Yoon¹, Nu Ri Kwon¹, Yeon-Jeong Jeong¹, Youngho Kim¹, Seong Taek Hong¹, and Nam Soo Han²

1Chungcheongbukdo Agricultural Research and Extension Services

2Department of Food Science and Biotechnology, Chungbuk National University

ABSTRACT For development of high effective vinegar, the selective enrichment procedure was conducted to isolated acetic acid bacteria of alcoholic hydrolysis strains from natural fermented aronia. The 16s rRNA sequences of selected 4 strains were identified as Acetobacter pasteurianus. These strains were investigated for acetic acid fermentation by using 50% aronia juice and 7% alcohols at 30ºC for 21 days. The changes in pH, total acidity, alcohol contents, color, total polyphenol contents, and tannin contents were investigated. As a result, the pH decreased and the total acidity of all the samples gradually increased during fermentation period. The YJ 9-1 strain tended to increase the total acidity quicker than did the other strains. The alcohol contents were reduced according to the length of the fermentation period. YJ 6-1 and YJ 9-1, which have high alcoholysis activity, remained under 1% alcohol in just 12 days. When comparing the physiological activity, the YJ 9-1 strain was the highest for the total polyphenol and tannin contents among all the stains at the end of fermentation.

Key words: aronia, vinegar, acetic acid bacteria

Received 19 September 2019; Accepted 13 November 2019 Corresponding author: Hyun-Ju Eom, Chungcheongbukdo Agricul- tural Research and Extension Services, Cheongju, Chungbuk 28130, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-43-220-5692 Author information: Nam Soo Han (Professor)

서 론

식초는 동･서양의 대표적인 발효식품으로 술이 시어지는 현상에 의해 발견되었고, 음식을 조리할 때 신맛을 내는 조 미식품으로 식품의 저장기간을 연장하기 위해서도 사용된 다(Cho 등, 2013). 식품공전에 의하면 식초는 곡류, 과실류, 주류 등을 주원료로 하여 발효시켜 제조하거나 이에 곡물 당화액, 과실 착즙액 등을 혼합･숙성하여 만든 발효식초와 빙초산 또는 초산을 희석하여 만든 합성식초가 있다(KFDA, 2008). 특히 과실식초는 과일의 술덧이나 착즙액이 30% 이 상을 함유하고 있어야 한다. 식초의 총산은 4~20% 미만으 로 규정하고 있으며, 각종 휘발성 및 비휘발성의 유기산, 당 류, 아미노산, 에스테르 등이 함유되어 특유의 풍미와 신맛 을 가지고 있다(Baek 등, 2014). 그 외에 강한 산성 때문에 식품 내 유해 미생물의 생육을 억제하는 살균효과를 비롯하

여 소화액 분비촉진, 노화방지, 당뇨, 피로회복, 동맥경화와 고혈압 예방효과 등의 기능성(Woo 등, 2010; Lee 등, 2010;

Casale 등, 2006)이 밝혀지면서 단순 조미료 기능에서 건강 기능성 식초로 고급화, 다양화되며 수요가 증가하고 있다 (Jeoung과 Lee, 2000). 그러나 발효식초는 수율이 낮고 소 요되는 시간이 길며 장기간 발효 과정으로 인한 이미, 이취 발생뿐만 아니라 품질관리가 어려운 문제가 있어 고품질의 천연 양조식초 제조에 어려움이 있다.

식초를 발효하는 데 가장 중요한 요소 중 하나는 초산균이 며, 균주에 따라 식초의 품질을 판정하는 지표로 이용되며 이들이 식초의 독특한 향과 맛을 결정한다(Yim 등, 2015;

Baek 등, 2014). 국내의 초산균 연구는 감(Park 등, 2005), 유자(Kang 등, 2006), 꾸지뽕(Yim 등, 2015), 금강밀(Cho 등, 2013), 오미자(Lim과 Sul, 2004), 감귤(Yi 등, 2014) 등 식초에 관한 연구 등이 보고되었으나, 초산 발효균주의 개량이 아직은 제한적이다. 이에 초산의 생산 수율이 높고 식초 제조에 용이한 균주를 발굴 및 개발하여야 할 필요성이 대두되고 있다.

아로니아는 북아메리카 장미과에 속하는 베리류의 열매 로서 폴리페놀 화합물, 플라보노이드, 안토시아닌 등의 생리 활성 물질을 함유하여 항산화, 항염증, 항당뇨, 항암작용,

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시력개선의 효과를 나타내며 의약품 및 기능성 식품의 소재 로써 크게 각광받고 있다(Zheng과 Wang, 2003; Jankowski 등, 1999). 그러나 아로니아는 특유의 신맛과 떫은맛으로 생과로 이용하기에는 한계가 있어 가공식품으로 개발할 필 요성이 대두되고 있다. 우리나라에서 아로니아가 재배되기 시작한 시기가 길지 않기 때문에 보다 다양한 가공품 연구가 필요하며 이 중 아로니아 식초에 관한 연구는 반응표면분석 법을 이용한 식초 발효조건(Park 등, 2014) 외에는 개발 사 례가 없으며, 아울러 적합한 균주 선발과 발효조건에 대한 연구가 필요하다고 판단된다.

따라서 본 연구는 아로니아를 이용한 식초를 개발하기 위 하여 아로니아를 자연 발효하여 빠른 알코올 분해력과 초산 생성능이 우수한 균주를 분리하였고, 초산균 균주별 아로니 아 식초를 제조한 후 품질 특성을 분석하였다.

재료 및 방법

초산균주의 배지 조건

초산 생성균 분리를 위한 선택배지는 1% yeast extract (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), 3% CaCO3(Dae- jung, Siheung, Korea) 5% glucose(Junsei, Koshigaya, Japan), 2.5% agar(Junsei), 3% ethanol(Merk, Darmstadt, Germany), 0.03% bromcresol purple(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 ethanol을 제외한 나머지 를 121°C, 15분간 살균하여 냉각한 후 사용 직전에 ethanol 을 무균적으로 첨가하여 제조한 YCE 배지에서 30°C에서 3일간 배양한 다음 사용하였다. 초산 생성 액체 배지는 1%

yeast extract, 5% glucose, 3% ethanol을 첨가한 YGE 배지를 사용하였고, 살균 후 shaking incubator(HB-201SL, Hanback Scientific Co., Bucheon, Korea)에서 30°C, 200 rpm으로 배양하며 사용하였다.

초산균주의 분리

초산 생성이 우수한 초산균을 분리하기 위해 우선 아로니 아 착즙액을 초기 총산 2%에 맞춰 실온에서 10주간 자연 발효시켰다. 아로니아 발효액을 7일마다 YCE 선택배지에 100 µL 도말하여 30°C에서 3일간 배양한 후 배지의 색 변화 관찰과 colony 주위에 투명환을 형성하는 수백 개의 균을 순수 분리하였다. 선발한 균주를 형태학적으로 관찰한 후 3회 이상 순수 배양한 다음 YGE broth 10 mL에 접종하고 30°C에서 2일간 shaking incubator(VS-8480SFN, Vision Scientific Co., Ltd., Bucheon, Korea)에서 진탕배양(200 rpm) 한 후, 균 증식도를 분광광도계(Carry UV-Vis spec- trophotometer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용해 배양액의 흡광도(660 nm)를 측정한 후 총 산 함량이 높은 균주를 최종 선별하였다.

분리 초산균 동정

선발한 분리균의 동정은 16S rRNA의 염기서열을 분석하 였다. 프라이머는 Universal PCR primer인 27F, 5’-AGA GTTTGATCMTGGCTCAG-3’; 1492R, 5’-TACGGYTA CCTTGTTACGACTT-3’을 사용하였고, PCR은 initial denaturation 5분, 94°C에서 45초간 denaturation, 55°C에서 60초간 annealing 및 72°C에서 60초간 extension cycle을 35회 수행하였다. PCR 산물의 염기서열은 (주)솔젠트(Dae- jeon, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. Phylogenetic tree 작성은 BLAST network service와 미국 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information)에서 얻 은 다른 균종의 16s rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 Riboomal Database Project의 seqMatch program에서 서 열 일치도가 높은 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서 열들을 얻었다. 그리고 DDBJ(DNA Data Bank of Japan)를 통해 계통분류학적 유연관계를 분석한 후 treeview를 이용 하여 neighbour-joining method와 distance matrix data 를 사용하여 확인하였다.

식초 제조

분리한 우수 초산균을 이용하여 아로니아 식초를 제조하 고자 하였다. 예비실험으로 아로니아 발효주를 만든 후 식초 를 제조하였을 때 갈변화가 심해 알코올 발효는 하지 않고 초산 발효만 유도하였다. 식초용 아로니아는 충북 청주시 청 원구 아로니아 재배농가에서 구입한 바이킹 품종을 사용하 였고, 꼭지 부분을 제거하고 유압기(Daejo, Gwangmyeong, Korea)로 압착하여 사용하였다. 50% 아로니아 착즙액, 7%

발효주정(DEL, Hwaseong, Korea), 5% 각각의 우수균주 를 키운 배양액(종초) 및 38% 증류수를 혼합하고 이를 30

°C, 200 rpm 속도로 21일간 발효를 진행하였다. 이때 대조 구로 공시균주 Acetobacter pasteurianus KACC 13994를 사용하였다.

pH 및 총산 함량

아로니아 식초의 pH는 pH meter(Sartorius AG, Gottin- gen, Germany)를 이용하여 측정하였고, 총산은 시료 10 mL에 1% phenolphthalein 2~3방울을 넣고 0.1 N NaOH 로 pH 8.2~8.3이 될 때까지 적정하였다. 적정에 소비된 NaOH 소비량은 acetic acid에 상당하는 유기산 계수를 이 용하여 총산으로 환산하여 나타내었다.

Ethanol 분해능

선발된 균주들 중 ethanol을 빠르게 분해시키며 산을 생 성하는 균주를 선발하기 위해 알코올 함량을 측정하였다.

알코올 농도는 국세청주류분석법의 증류법에 의해 측정하 였다. 500 mL 삼각플라스크에 100 mL 시료와 100 mL 증 류수를 넣고 증류시킨 후 약 80 mL 정도를 증류한 다음, 증류수를 가하여 최종 용량이 100 mL가 되도록 조절한 후

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Fig. 1. Phylogenetic tree of isolates. This phylogenetic tree was obtained from the neighbor-joining method, based on nearly complete 16S rRNA gene sequences show- ing relationships between isolates and Ace- tobacter spp..

온도를 15°C로 보정하여 알코올 비중계로 알코올 도수(%) 를 측정하고 주정 환산표를 이용하여 측정하였다.

총 폴리페놀 함량

아로니아 식초의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu’s 방법(Amerine과 Ough, 1980)에 따라 진행하였다. 시료 0.1 mL, 증류수 8.4 mL, 2 N Folin-Ciocalteu reagent(Sig- ma-Aldrich Co.) 0.5 mL, 20% Na2CO3 1 mL를 혼합하여 1시간 반응시킨 후 750 nm에서 분광광도계를 통해 흡광도 값을 측정하였다. 페놀화합물 함량은 표준물질인 gallic acid (Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 상기의 방법으로 작성한 표준곡선으로 양을 환산하였고, 추출물 중의 mg gallic acid equivalent(GAE, dry basis)로 나타내었다.

탄닌 함량

아로니아 식초의 탄닌 함량은 Duval과 Shetty(2001)의 방법에 따라 측정하였다. 여과하여 10배 희석한 시료 1 mL 에 95% ethanol 1 mL와 증류수 1 mL를 가하여 잘 흔들어 주고 5% Na2CO3 용액 1 mL와 1 N Folin-Ciocalteu’s reagent(Sigma-Aldrich Co.) 0.5 mL를 가한 후 실온에서 60 분간 발색시킨 다음 725 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 총 탄닌 함량은 tannic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용한 표준곡선으로 양을 환산하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복하였고 Statistical Analysis System(v8.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 통계프 로그램을 이용하여 통계분석 하였으며, 결과의 유의성을 검 정하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 행한 후 시료 간 차의 유무를 Duncan’s multiple range test로 비교 분석하였다 (P<0.001).

결과 및 고찰

초산 생산 균주의 분리

아로니아 식초용 우수 초산균 선발은 자연에서 발효한 아 로니아 발효액을 bromocresol purple을 함유한 YCE 배지 에 도말하여 30°C에서 3일간 배양하여 clear zone에 크게 형성하는 집락을 초산균으로 추정하고 300여 개의 집락을 1차로 순수 분리하였다. 이때 bromocresol purple에 의해 본 배지에서 초산균이 생육하면서 pH가 낮아짐에 따라 노란 색과 파란색으로 변하게 되고(Moryadee와 Pathom-Aree, 2008), CaCO₃이 분해되며 투명환(clear zone)이 형성되는 데 이 환의 크기가 클수록 초산 생성력이 뛰어난 것으로 판 단할 수 있다(Baek, 2014). 다음으로 Gram 염색을 실시하 여 Gram 음성의 단간균 혹은 간균의 형태학적 관찰을 통하 여 최종 38개의 균주를 분리하고 이들을 3%의 알코올을 함 유한 초산 생산균 분리용 액체 배지(YGE)에 각각 다시 접종 하여 30°C, 2일간 진탕배양 한 후 O.D.(optical density) 값과 초산 생성능을 비교하였다(data not shown). 38개의 균주 중 총산 함량이 높은 4개 균주를 최종 선발하였고, 16S rRNA 염기서열을 분석하여 동정하였다(Fig. 1). 그 결과 모 두 Acetobacter pasteurianus로 염기서열이 99% 일치하 여 다음 실험의 진행을 위해 초산균의 명칭을 Acetobacter sp. YJ 6-1, YJ 8-1, YJ 9-1, YJ 18-1로 각각 명명하였다.

산 생성능

초산균주를 달리하여 제조한 아로니아 식초의 pH와 산도 변화는 Table 1과 Table 2에 나타내었다. pH는 초기 3.87 로 시작하여 발효 종료 시 2.99~3.28을 나타내며 대조구인 13994가 3.28로 가장 높았고, YJ 18-1이 2.99로 가장 낮은 pH를 나타내었다(Table 1). 총산 함량 결과(Table 2), 발효 기간에 모든 시료에서 증가하는 형태를 보였고 pH와 총산의 함량이 반비례적으로 나타나며 pH가 가장 낮은 균주가 총산

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Table 1. Changes of pH in aronia vinegar by isolated acetic acid bacteria

Sample¹⁾ Fermentation time (days)

0 4 8 12 16 21

Control YJ 6-1 YJ 8-1 YJ 9-1 YJ 18-1

3.87±0.06âbC2) 3.86±0.06âbA 3.87±0.10âbA 3.86±0.00^bA 3.87±0.06âA

3.90±0.06^aB 3.63±0.00^eB 3.87±0.06^bA 3.81±0.06^cB 3.80±0.06^dB

3.93±0.12^aA 3.48±0.25^eC 3.68±0.21^cB 3.60±0.35^dC 3.72±0.12^bC

3.70±0.10^aD 3.30±0.06^cD 3.77±0.22^aAB 3.23±0.10^cD 3.50±0.06^bD

3.49±0.00âE 3.40±0.21âC 3.36±0.21âC 3.20±0.15^bD 3.40±0.10âE

3.28±0.00^aF 3.23±0.32^bE 3.12±0.06^dD 3.13±0.00^cE 2.99±0.75^eF

1)Control: aronia vinegar by Acetobacter pasteurianus KACC 13994, YJ 6-1∼YJ 18-1: aronia vinegar by each isolates.

2)Each values mean±SD. Values with different small letters (a-e) within a column are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.001). Values with different capital letters (A-F) within a row are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.001).

Table 2. Changes of total acidity in aronia vinegar by isolated acetic acid bacteria

Sample¹⁾ Fermentation time (days)

0 4 8 12 16 21

0.29±0.14^eE2) 0.41±0.20^dE 0.41±0.18^cE 0.44±0.02^bE 0.44±0.03^aF

0.56±0.09^eD 1.51±0.20^aD 0.63±0.17^dE 0.89±0.16^bD 0.85±0.06^cE

0.63±0.19^eD 2.03±0.35^aC 1.34±0.23^dD 1.99±0.79^bC 1.44±0.12^cD

1.50±0.15^eC 3.29±0.34^bB 2.70±0.50^dC 6.19±0.12^aB 2.79±0.14^cC

2.96±0.64^dB 4.48±0.17^bA 4.21±0.45^bcB 6.84±0.07^aA 3.82±0.06^cB

4.72±0.22^dA 5.56±0.01^cA 7.00±0.09^bA 6.93±0.21^bA 7.34±0.05^aA

2)Each values mean±SD. Values with different small letters (a-e) within a column are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.001). Values with different capital letters (A-F) within a row are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.001).

함량이 가장 높았다. 최종 발효 시 4.72~7.34%의 총산 함량 을 나타내며 식초의 식품공전 기준인 4%(v/v, 초산 기준) 이상 도달하였다. 최종 발효 시 대조구는 총산 함량이 4.72

%로 가장 낮은 반면 나머지 균주에서는 5.56~7.34%로 대 조구에 비해 총산 함량이 높았다. 특히 YJ 9-1의 균주는 발효 12일 만에 6.13%에 도달하며 다른 균주에 비해 월등히 빠른 속도로 총산 함량이 증가했으며, 나머지 균주는 발효 16일 이후에 식초 총산 함량 기준에 도달하였다. 따라서 YJ 9-1이 다른 균주보다 초기 발효율이 높아 단기간 발효 시에 가장 적합한 균주라 할 수 있다. 초산균은 알코올을 영양원 이나 발효 기질로 사용하여 초산을 생성시켜 산도가 증가하 게 된다(Park 등, 2012). 이론상 초산 발효는 1분자의 알코 올로부터 1분자의 초산이 생성되고 1.0 L의 알코올은 약 1.0 kg의 초산이 생성되어야 하는데(Park, 2014), 본 연구 시료에서 7%의 알코올을 발효시켰을 때 총산 함량이 4.72

~7.34%에 도달한 것으로 보아 알코올 함량이 대조구는 4.72%로 잔류 알코올의 함량에 비해 초산 발효가 덜 일어난 반면, YJ 6-1, YJ 8-1, YJ 9-1, YJ 18-1은 알코올이 모두 초산 발효로 전환되었음을 알 수 있었다. 알코올의 잔량이 많은 것은 초산 발효가 원만하게 진행되지 않은 것이고 초산 에 비해 잔류 알코올 양이 적다면 발효조건에 의해 온도나 교반 정도에 따라 알코올의 손실량이 컸다고 볼 수 있다(Kim 등, 1997). 식초 발효는 알코올 농도, 초기 산도, 균 배양온 도, 배양속도, 배양기간 등의 다양한 발효조건에 따라 산 함 량은 크게 달라질 수 있으며(Jeong 등, 1996), 초산균주에 따라 몇몇 균주는 초산을 과산화한다고 보고되고 있다(Saeki

등, 1997; Baek 등, 2014). Cho 등(2013), Kim 등(2008), Kang 등(2006), Kim과 Choi(2006)의 연구에서 30°C에서 최적의 초산 발효가 일어난다고 보고하고 있으며, 초산 발효 시 배양액의 온도가 낮으면 균주 성장이 억제되고, 너무 높 으면 초산 생성능이 떨어지거나 오염의 위험이 있으므로 적 절한 온도조절이 필요하다(Hekmat과 Vortmever, 1992).

배양속도는 Lee 등(2002)의 참외식초 제조 연구와 Shin 등 (2002)의 당근식초, Lee 등(2000)의 감자식초 등의 연구에 서 정치배양보다 진탕배양으로 교반속도가 200 rpm일 때 총산의 함량이 높다는 것을 나타내었다. 본 연구에서도 교반 속도를 200 rpm 이상 올렸을 때 오히려 총산 함량이 증가하 지도 않고 초산균의 생육이 저해하는 것으로 나타나(data not shown) 30°C, 200 rpm으로 설정하고 식초 발효를 하 였다.

알코올 분해능

초산균주를 달리하여 제조한 아로니아 식초 발효기간에 잔존 알코올 함량을 측정하였다(Fig. 2). 그 결과 모든 실험 구에서 발효기간에 감소하여 YJ 6-1, YJ 9-1은 발효 12일 째 알코올 함량이 0%로 과실 식초의 품질기준인 잔류 알코 올 함량 1.0% 미만에 적합하였고, 대조구, YJ 8-1 및 YJ 18-1은 발효 20일 후에 알코올 함량이 각각 1%, 0%, 0%로 식초로 적합하였다. YJ 6-1과 YJ 9-1이 다른 균주보다 발 효 초기부터 알코올 함량이 빠르게 감소하는 것으로 보아 알코올을 빠르게 분해시켜 초산으로 전환함으로써 알코올 분해능이 우수하다고 할 수 있다. Park 등(2014)의 아로니

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0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 4 8 12 16 20

Fermentation period (day)

Alcohol contents (%) .

Fig. 2. Changes of alcohol contents in aronia vinegar by isolated acetic acid bacteria. Control, aronia vinegar by Acetobacter pas- teurianus KACC 13994; YJ 6-1∼YJ 18-1, aronia vinegar by each isolates.

Table 3. Changes of Hunter’s color value in aronia vinegar by isolated acetic acid bacteria

Sample¹⁾ 　 Fermentation time (days)

　 0 12 21

L*

(lightness)

1.85±0.07âC2) 1.85±0.01âA 1.97±0.12âC 1.93±0.12âC 1.98±0.08âC

7.74±0.17^aA 4.22±0.71^cA 7.19±0.08^aA 6.24±0.11^bB 5.74±0.07^bB

6.08±0.03âbB 5.60±1.60^bA 6.44±0.15âbB 7.26±0.18âA 5.80±0.47âbA Control

YJ 6-1 YJ 8-1 YJ 9-1 YJ 18-1

a*

(redness)

1.41±0.13^bC 1.48±0.26^bC 2.20±0.46âC 2.01±0.67âbC 2.10±0.38âC

16.22±0.14âB 14.15±1.92^bB 16.20±0.02âB 17.36±0.14âB 14.89±0.08^bB

18.56±0.36âbA 19.47±0.93âA 17.53±0.60^bcA 17.83±1.24âbcA 16.79±2.26^cA Control

YJ 6-1 YJ 8-1 YJ 9-1 YJ 18-1

b*

(yellowness)

−0.64±0.09^aC

−0.54±0.08^aA

−0.40±0.18^aC

−0.40±0.26^aC

−0.37±0.09^aC

0.75±0.33^bB 1.72±1.05âbA 1.24±0.06âbB 2.33±0.20âB 1.59±0.05âbB

3.70±0.37âA 3.13±1.57âA 3.10±0.33âA 3.24±0.06âA 3.59±0.14âA

2)Each values mean±SD. Values with different small letters (a-c) within a column are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.001). Values with different capital letters (A-C) within a row are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.001).

아 반응표면분석법을 이용한 아로니아 식초 제조에 관한 연 구에서 최적 알코올 농도는 7.78%이고, Kim 등(1997)의 유자과즙을 이용한 식초 제조 연구에서 알코올 함량이 7~

8%일 때 초기 발효 시간을 단축할 수 있다고 보고하고 있다.

또한 Mo 등(2013)의 오미자 식초 연구에서도 초기 알코올 함량이 6%에서 최대 초산 농도를 나타내며, 일반적인 연구 에서 5~8%의 알코올이 이용되고 있다. 식초는 초산균에 의 해 알코올을 발효기질과 영양원으로 이용하여 분해시키며 아세트알데히드를 거쳐 아세트산과 CO2를 형성한다. 이때 최적 알코올 농도는 균주와 발효조건의 영향을 받게 된다.

초기 알코올 농도가 적정농도 이하와 이상의 농도일 때는 정상적인 발효가 유도되지 않았으며, 특히 고농도의 기질에 서는 알코올에 대한 내성이 약해져 초산균의 성장이 억제되 어 발효가 유도되기 어렵다는 연구가 있다(Kang 등, 2011).

따라서 본 연구에서도 최대의 초산을 얻기 위해 7% 초기 알코올 농도를 조절하여 실험을 진행되었다.

색도

초산균주를 달리하여 제조한 아로니아 식초의 색도 변화 를 분석한 결과는 Table 3에 나타내었다. 명도를 나타내는 L값은 발효 초기 1.85~1.98에서 발효 종료 시 5.60~7.26 으로 발효기간에 증가하였으며, YJ 9-1이 가장 높았다. a값 (적색도)은 발효 초기 1.41~2.20에서 21일 발효 종료 시 16.79~19.47로 증가하는 형태를 보였고, b값(황색도) 역시 발효 초기에 비해 증가하며 -0.64~-0.37에서 3.10~3.70 으로 증가하였으며, 시료 간에 유의적인 차이는 없었다. 아 로니아는 주로 안토시아닌으로 구성된 색소로 pH에 비교적 안정한 형태를 띠며 적색도가 증가한 것으로 보인다.

아로니아 식초의 색도 결과 발효가 진행되면서 식초의 색 이 진해졌는데, 알코올 및 초산 발효가 진행될수록 식초의 색이 더 진해지는 연구(Kim 등, 2013)와 일치하였으나, 오 미자 초산 발효에 관한 연구(Mo 등, 2013)에서는 발효 전후 L값과 b값은 유의적인 차이가 없고 a값은 감소한다고 보고 하여 상이한 결과를 얻었다. 또한 Park 등(2010)의 고추를 첨가한 발아현미 식초 제조에 관한 연구에서는 L값은 감소 하고 a값은 약간 증가하며, b값은 농도에 따라 증가하거나 감소한 결과를 나타냈다. 이에 따라 발효 원료에 따라 색도 변화가 다른 것으로 보인다. Park 등(2014)의 반응표면분석 법을 이용한 아로니아 식초 제조에 관한 연구에서의 색도 결과 L값은 47.58~71.00, a값은 31.77~51.15, b값은 18.45

~48.58로 본 연구의 값과 차이가 컸으며, 초산이 많이 생성 될수록 L값은 낮고 a, b값은 높은 경향을 띠는 결과를 나타 내며 본 연구와 상이한 결과를 나타내었다. 이를 통해 원료

(6)

cA cC bA bA

aA aB

cB abA

dB bB

aA

dD bA

eC cB aD

cB dF

bC bC aE bE

dD cC

eD bF

aC

eE dD cD

0 100 200 300 400 500

Tannic acid (mg%) .

0day 4day 8day 12day 16day 21day

Fig. 4. Comparison in total tannic acid contents of aronia vinegar according to isolated acetic acid bacteria. Control, aronia vinegar by Acetobacter pasteurianus KACC 13994; YJ 6-1∼YJ 18-1, aronia vinegar by each isolates. 0∼21 day: vinegar fermentation time (days). Values with different small letters (a-e) within a period are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.001). Values with different capital letters (A-F) within a sample are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.001).

aA aA aA aA

aA

cB dB aA

eB bB

dC cBC aB

eC

bBC aC

abD bC

aC abB

bE aC

cD dC

cD

bD aA

dC cD cD

0 50 100 150 200 250 300

Total polyphenol contents (mg%) .

0day 4day 8day 12day 16day 21day

Fig. 3. Comparison of total polyphenol contents in aronia vine- gar by isolated acetic acid bacteria. Control, aronia vinegar by Acetobacter pasteurianus KACC 13994; YJ 6-1∼YJ 18-1, ar- onia vinegar by each isolates. 0∼21 day: vinegar fermentation time (days). Values with different small letters (a-e) within a period are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.001). Values with different capital letters (A-E) within a sample are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.001).

가 같더라도 발효조건이나 균주 등에 의해 색도 변화가 달라 질 수 있다고 판단된다.

총 폴리페놀 함량

폴리페놀성 물질은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대 사산물 중의 하나로 phenolic hydroxy를 가지며 다양한 구 조와 분자량을 가진다. 이들은 거대 분자와 결합하여 항산화 효과의 생리활성 기능을 가진다(Fine, 2000). 서로 다른 초 산균을 이용하여 제조한 아로니아 식초의 총 폴리페놀 함량 을 분석한 결과는 Fig. 3과 같다. 발효 초기 202.63~223.87 mg%에서 발효 종료 시 90.83~243.33 mg%, 발효 종료 시 YJ 9-1의 균주가 243.33 mg%로 가장 높았으며, 전체적으 로 발효가 진행될수록 감소하는 형태를 보였다. 야콘 뿌리를 이용한 초발효에 관한 연구에서도 발효가 진행될수록 총 폴 리페놀 함량이 감소한다고 보고하였는데(Lee 등 2010), 이 는 초산 발효 과정에서 페놀 분해 및 변형으로 인해 총 페놀 함량이 감소한다는 결과에 기인한다. 그러나 YJ 9-1 균주의 총 폴리페놀 함량은 초기에 감소하다가 12일 이후 다시 증 가하는 형태를 보였다. 대조구를 포함한 나머지 균주는 16 일까지 감소하는 경향을 보이다가 16일 이후 다시 약간 증 가하는 형태를 보였다. 이는 초산균에 의해 알코올 분해와 초산 발효가 일어나는 과정에서 폴리페놀 성분들이 분해되 어 감소하다가 알코올 분해가 끝난 후 폴리페놀 화합물들이 더 이상 분해되지 않고 용출되었기 때문인 것으로 보이나 이에 관한 추후의 연구가 더 필요할 것으로 판단된다. 한편 주정을 첨가한 양파식초 연구(Cheun 등, 2005)에서는 원료 에 대한 열처리, 원료 열매의 과피, 과육 등의 부위에 따른 식초 발효방법에 따라 폴리페놀 함량이 차이가 난다고 보고 하고 있다. 따라서 아로니아 식초도 다양한 원료처리 방법에 따른 연구가 더 필요하다고 판단된다.

탄닌산

탄닌 성분은 과실, 야채류 및 식물 종자 등 식물체에 널리 함유되어 있어 약리성과 더불어 단백질이나 alkaloid와 결 합하는 특성을 가지며, 탄닌에 의한 떫은맛은 과실 및 음료 의 풍미에 관여하기도 한다(Cho 등, 1993). 아로니아 식초 의 탄닌산 함량 측정 결과 Fig. 4에 나타냈다. 발효 초기 349.97~382.26 mg%에서 발효 종료 시 142.95~288.45 mg%로 전체적으로 발효가 진행됨에 따라 감소하는 형태를 보였다. 시료 중 YJ 9-1의 경우 12일 이후에 다시 증가하며 발효 종료 시 288.45 mg%로 다른 시료에 비해 가장 높은 활성을 보였다. 으름열매 식초(Lee 등, 2014)와 감식초 연 구(Yoon, 2009)에서 발효 전후의 탄닌 함량이 증가하는 경 향을 보인다는 연구와는 다른 결과가 나타났지만, 탄닌 함량 은 페놀 성분과 상관관계가 높다고 보고됨에 따라 페놀성 물질 함량이 탄닌 함량에 큰 영향을 줄 것이라는 결과와는 일치하였다. 따라서 본 연구에서 발효기간에 따른 탄닌 함량 의 변화가 폴리페놀 함량 변화와 매우 흡사한 것을 볼 수 있었다.

요 약

아로니아 식초 제조를 위해 아로니아 자연발효액으로부터 약 300여 개의 초산균을 분리해 산 생성능이 우수한 균주 4종(YJ 6-1, YJ 8-1, YJ 9-1, YJ 18-1)을 최종 동정하였다.

이 균주를 종균으로 이용해 아로니아 착즙액 50%, 알코올 함량을 7%로 조정한 후 30°C에서 21일간 발효하였다. 발효 기간에 아로니아 식초의 pH, 총산, 총 폴리페놀, 탄닌을 측 정하였다. 그 결과 pH는 발효가 일어나는 동안 낮아졌으며, 총산은 pH 감소 양상과 유사하게 발효가 진행될수록 증가하 는 것으로 나타났다. 특히 YJ 9-1의 총산 함량이 초기에

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빠르게 증가하는 경향을 보였다. 알코올 분해력은 YJ 6-1, YJ 9-1의 잔류 알코올 함량이 12일 만에 1% 미만으로 대조 구에 비해 빠른 분해력을 나타내었다. 아로니아 식초의 생리 활성 분석 결과 발효 종료 시에 YJ 9-1에서 총 폴리페놀, 탄닌 함량이 대조구를 비롯한 다른 균주에 비해 우수한 결과 를 나타내었다. 따라서 본 연구에서는 아로니아 자연 발효액 으로부터 분리한 초산균주 YJ 9-1을 배양하여 아로니아 식 초 제조 시 단기간 내에 고효율의 기능성 식초를 제조할 것 으로 본다.

감사의 글

본 연구는 농촌진흥청 공동연구사업(지역특화작목기술개발 사업, 과제번호: PJ01343601)의 지원에 의해 이루어진 것 임.

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