Study on Antioxidant and Anti-inflammatory Effects of Components of Mahwangbujaseshin-tang

麻黃附子細辛湯의 각 구성약물별 항산화 및 항염 효능에 관한 연구

최철우⋅오민석*

대전자생한방병원 한방재활의학과, 대전대학교 한의과대학 한방재활의학교실*

Study on Antioxidant and Anti-inflammatory Effects of Components of Mahwangbujaseshin-tang

Chul-Woo Choi, K.M.D., Min-Seok Oh, K.M.D.*

Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, Daejeon Jaseng of Korean Medicine Hospital, Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Dae-jeon University*

RECEIVED September 16, 2014 REVISED October 2, 2014 ACCEPTED October 7, 2014

CORRESPONDING TO

Chul-Woo Choi, Daejeon Jaseng of Korean Medicine Hospital, 644, Tanbang-dong, Seo-gu, Deajeon 302-859, Korea

TEL (042) 610-0538 FAX (042) 610-0415 E-mail [email protected]

Copyright © 2014 The Society of Korean Medicine Rehabilitation

Objectives This study was carried out to find out the Antioxidant and Anti-inflammatory Effects of Components of Mahwangbujaseshin-tang in LPS-Stimulated RAW264.7 Macrophages.

Methods There are 5 experimental groups. ; normal, control, EH (Ephedrae Herba), ALRP (Aconiti Lateralis Radix Preparata) and AR (Asiasari Radix). The extract of EH, ALRP and AR (100 μg/ml) was added to each group. We examined cytotoxicity, total phenolic contents, DPPH and ABTS free radical scavenging activity, Intracellular ROS (reactive oxy- gen species) production, NO (Total Nitric oxide), iNOS (inducible nitric oxide synthase), PGE2 (prostaglandin E2), COX-2 (cyclooxygenase-2), IL-1β (interleukin-1β), IL-6 (inter- leukin-6), TNF-α (tumor necrosis factor-α), MMP-9 (matrix metalloproteinase-9), TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1) and HO-1 (heme oxygenase-1) expression level.

Results 1. Total phenolic contents of EH were in the highest level. 2. DPPH and ABTS free radical scavenging activity of EH was in the highest level. 3. ROS production was sig- nificantly decreased in AR. 4. NO production was significantly decreased in EH, ALRP, AR and iNOS expression was decreased in EH, AR. 5. PGE2 and COX-2 expression was de- creased in EH, AR. 6. IL-1β production was significantly decreased in EH, AR and IL-6 production was significantly decreased in AR. TNF-α production was significantly de- creased in ALRP, AR. 7. MMP-9 and TIMP-1 production were significantly decreased in EH. 8. HO-1 expression was significantly increased in EH. 9. With simultaneous usage of SnPP which is expression inhibitor of HO-1, NO, IL-1β, IL-6 and TNF-α production were partially increased in EH, ALRP, AR.

Conclusions According to this study, Components of Mahwangbujaseshin-tang have anti-oxidants and anti-inflammation effects in LPS-Stimulated RAW264.7 Macrophages. (J Korean Med Rehab 2014;24(4):15-28)

Key words Mahwangbujaseshin-tang, Anti-inflammation, Anti-oxidation

서론»»»

염증은 조직에 상처나 감염 등이 발생할 때, 자신을 보 호하기 위한 신체의 대응기전이며, cytokine이나 free radical 등의 자극성 물질에 대한 생체 방어반응이다¹⁾. 대 식세포가 내독소로 알려진 lipopolysaccharide (LPS)의 자 극을 받으면 interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) 등과 같은 염증성 cytokine을 방출하게 되고^2-4), inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX- 2)의 발현을 유도하여 nitric oxide (NO) 및 prostaglan- dinE2 (PGE2)와 같은 염증성 인자가 생성됨으로써 염증 반응이 매개된다^5,6).

Nitric oxide (NO)는 생체 내에서 NO synthase (NOS) 라는 효소의 촉매작용을 통해 L-arginine으로부터 생성되 는 반응성이 강한 free radical이다. NO는 생리적인 현상 인 혈압조절과 신경전달 매개체로 작용하며, 면역반응에 중추적인 역할을 하고 있으며, 뼈를 형성하는 chon- drocyte와 synoviocyte 같은 세포에서도 발현되고 있다⁷⁾. 그러나 과량의 NO 생성은 염증반응을 일으키고, 조직의 파괴 및 면역체계의 이상을 일으킨다고 보고되고⁸⁾ 있다.

NO가 과량 생성되면 TNF-α, IL-1 및 IL-6 등 pro-in- flammatory cytokine 뿐만 아니라 COX-2 같은 염증 매개 물질도 과량 생산되어 과도한 면역 반응을 일으키며⁹⁾, re- active oxygen species (ROS)도 과량 생성하게 된다^10,11).

Heme oxygenase-1 (HO-1)은 heme이 carbon mon- oxide (CO), biliverdin, free iron으로 분해되는 반응을 촉진하는 효소이며 pro-inflammatory cytokines를 줄이고 anti-inflammatory cytokines의 생성을 촉진시키는 생리학 적인 기능에 관여한다^12,13). HO-1은 세포, 동물 및 사람을 대상으로 진행된 다양한 실험연구를 통해 활성산소의 자 극과 같은 산화적 스트레스로부터 세포와 조직을 보호하 는 중요 분자로 인식되고 있으며, 특히 LPS를 처리한 RAW 264.7 대식세포에서 HO-1은 NO의 생성과 iNOS 유 전자 발현을 저해함으로써 염증반응을 차단하는 것으로 알려져 있다^14,15).

麻黃附子細辛湯은 『傷寒論』¹⁶⁾에 처음 기재된 처방으 로 麻黃, 附子, 細辛으로 구성되었으며, 少陰病 초기에 邪 氣가 아직 表分에 있을 때 溫劑로써 發汗以散之하는 처방 이다¹⁷⁾. 麻黃附子細辛湯에 대한 그동안의 연구로는 알레 르기 비염 등에서의 히스타민 분비 억제 효과에 대한 연

구¹⁸⁾, 심혈관계 질환에 미치는 영향에 대한 연구^19,20), NO 생성 억제 효과에 대한 연구²¹⁾, 골관절염에 미치는 영향 에 대한 연구²²⁾등이 있다. 처방의 개별 약재에 대한 연구 로는 麻黃의 항산화 및 항염증에 효과에 대한 연구^23,24), 附子의 항염증 효과에 대한 연구^25,26), 細辛의 항염증 효 과에 대한 연구^27,28) 등이 있으며, 각각의 약물은 항염증 및 항산화 효과가 있음이 밝혀져 있다. 그러나 麻黃, 附 子, 細辛 각각의 약재를 같은 방법으로 항산화 및 항염증 효과를 비교한 연구는 없었다. 위의 연구들은 麻黃附子細 辛湯 자체를 추출하여 각각 개별 약재를 비교할 수 없거 나, 비록 처방의 개별 약재에 대한 연구가 각각 진행 되 었으나 전부 다른 시료와 연구 방법으로 개별 약재끼리의 비교가 힘들었기 때문에 동일한 연구하에 개별 약재를 비 교할 필요성이 있었다.

이에 저자는 麻黃附子細辛湯의 구성약물인 麻黃, 附子, 細辛의 항산화 및 항염 효능을 비교하고자 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포를 이용하여 세포독성, 총 Polyphenol 함량, DPPH 및 ABTS 소거능, 세포내 ROS, NO, iNOS 발 현, 염증관련 매개인자 및 HO-1 발현에 미치는 영향 등 을 관찰한 결과 유의성 있는 성과를 얻었기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법»»»

1. 재료

1) 세포

세포는 한국세포주은행(서울, 한국)에서 RAW 264.7을 구입하여 사용하였다.

2) 약재

본 실험에 사용한 麻黃附子細辛湯(

Mahwangbujase-

shin-tang

Herbal

medicine name Pharmacognostic name

麻黃 Ephedrae Herba EH

附子 Aconiti Lateralis Radix Preparata ALRP

細辛 Asiasari Radix AR

Table I. The Prescription of MBST

3) 시약

Lipopolysaccharide (LPS), dimethyl sulfoxide (DMSO), 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH)는 Sigma-Aldrich Co. (st. Louis, MO, USA)에서, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS), Penicillin 및 Streptomycin은 Hyclone Co (Logan, Ut, USA)에서, BCA protein assay kit은 Thermo Scientific Co. (Rockford, IL. USA)에서, Cell viability assay kit은 Daeillab sevice Co. (서울, 한국)에서, Nitric Oxide de- tection kit은 Intron Biotechnology Co. (수원, 한국)에서 구입하였다. Folin-Ciocalteu's phenol reagent는 Merck Co. (Darmstadl, Germany)에서, gallic acid와 sodium carbonate는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에 서 구입하였다. Cytokine Milliplex Map Immunoassay kit은 Millipore Co. (Bellerica, MA, USA)에서, PGE2

(prostaglandin E2), MMP-9 (matrix metalloproteinase-9), TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases-1), ELISA Kit은 R&D System Co (Minneapolis, USA), iNOS와 COX-2, b-actin antibody는 cell signalling Co. (Danvers, MA, USA), HO-1 (heme oxygenase-1)은 Santa Cruz Biotechnology Co. (Danvers, MA, USA), HO-1은 Santa Cruz Biotechnology Co. (CA, USA), BCA protein assay kit은 Thermo Scientific Co. (Rockford, IL. USA), 주정추 출에 이용된 주정은 (주)주정판매월드(전주, 한국)에서, 염색을 위한 ECL은 AbClon (서울, 한국)에서 구입하였 다.

4) 기기

본 실험에 사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), Freeze dryer (일신바이오베이스, 한국), ELISA reader (Molecular Devices, USA), Luminex (Milli- pore, USA.), Flow cytometry system (BD Biosciences

immunocytometry systems, USA.), Light Microscope (Carl ZEISS, Germany), Chemi-DOC (Viber Lourmat, Eberhardzell, Germany), Flow cytometer (Becton Di- ckinson, NJ USA) 등이다.

2. 방법

1) 시료 추출

MBST 개별약재인 麻黃, 附子, 細辛 30 g씩을 각각 80% 주정 500 ml에 넣고, 3시간동안 환류추출 하여, 그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 50 ml로 감압, 농축 하여 동결 건조하여 사용하였다. 麻黃, 附子, 細辛 각각 시료 추출시 최종 산물의 수득율은 순서대로 9.67%, 6.33%, 11.67%로 나타났다.

2) 세포독성 측정

Raw 264.7 세포는 96 well plate에 10⁵ cells/well로 분 주하여 24시간 동안 배양하였다. 麻黃, 附子, 細辛 추출물 을 각각 10, 50, 100, 200, 400, 800 (μg/ml)의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 μl 의 WST solution을 첨가하여 배양기(37^oC, 5% CO2)에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 nm에서 흡광도의 변화 를 측정하여, 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표 시 하였다.

3) 항산화능 측정

(1) 총 Polyphenol 함량 측정

총 Polyphenol 함량은 Folin-Ciocalteu 시약을 이용하 는 방법으로 측정하였다. 추출 시료용액 1 ml에 50%

Foiln-Ciocalteu's phenol reagent 0.5 ml를 가하여 실온 에서 3분간 반응시켰다. 반응용액에 Na2CO3 포화용액 1 ml와 7.5 ml 증류수를 차례로 혼합하여 30분간 정치시킨 뒤, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취 해 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 Polyphenol 함 량은 gallic acid를 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 따라 함량을 구하였으며 측정단위로는 GAE (Gallic acid equivalent)/g을 사용하였다.

(2) DPPH 소거능 측정

자유라디칼 소거 활성 시험은 안정한 자유라디칼 DPPH를 사용하는 방법으로 주정에 용해시킨 0.2 mM의

DPPH 용액 150 μl와 麻黃, 附子, 細辛 각각의 추출물 (100 μg/ml) 100 μl를 각각 혼합하고, 37^oC에서 30분간 반응 시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군 은 시료액 대신 물을 넣었으며, DPPH 용액대신 주정을 넣어 보정 값을 얻었다. 자유라디칼 소거율은 아래의 식 에 따라 계산하였다.

소거율(%)=

대조군의 흡광도−시료 첨가군의 흡광도

( )×100

대조군의 흡광도

(3) ABTS 소거능 측정

ABTS assay 방법은 기존에 보고된 방법을 96 well plate에 맞게 수정하여 실시하였다. 麻黃, 附子, 細辛 각 각의 추출물은 최종 농도 100 (μg/ml)으로, ABTS 용액 은 7.4 mM ABTS (2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid))와 2.6 mM potassium persulphate를 제 조한 후, 암소에 하루 동안 방치하여 양이온(ABTS·＋)을 형성시킨 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값 이 1.5 이하가 나오도록 희석하고, 희석된 ABTS·＋ 용액 150 μl와 추출물을 각각 5 μl 혼합하고, 실온에서 10분 간 반응시킨 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산 화능은 증류수를 대조군으로 하여 대조군에 대한 ABTS 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다.

소거율(%)=

대조군의 흡광도−시료 첨가군의 흡광도

( )×100

대조군의 흡광도

(4) 세포내 ROS 생성 측정

Raw 264.7 세포 내에서 reactive oxygen speies (ROS) 를 측정하기 위하여 2′,7′-dichlorofluorescin diac- etate(DCF-DA)를 이용하였다. 12 well plate에 Raw 264.7 세포를 1.5×10⁵ cells/well이 되게 분주하였다. 24 시간 동안 배양한 후, 麻黃, 附子, 細辛 추출물을 100 (μg/

ml)의 농도로 처리하고, LPS 1 μg/ml을 처리하여, 다시 24시간 동안 37^oC, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 후, 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리하여 모은 세포를 차 가운 PBS로 2회 세척한 후, DCF-DA 10 μM를 첨가하여 15분 동안 빛이 차단된 37^oC에서 염색하였다. 염색 후 차

가운 PBS를 넣어 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리한 다음 상청액을 제거하고 다시 PBS 400 μl를 부유시켜 유세포 분석기를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 변화를 분석 하였다.

4) 항염증 효능 측정

(1) NO 생성 억제 효과 측정

NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System²⁹⁾을 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cells은 96 well plates에 10⁵ cells/well로 분주하여 24시 간 동안 배양 한 후, 麻黃, 附子, 細辛 각각의 추출물을 100 (μg/ml)의 농도로 처리하고, LPS 1 μg/ml을 처리 하여, 다시 24시간 동안 배양하였다. N1 buffer를 50 μl 를 각 well에 처리한 후, 10분간 상온에서 암소 반응 후, N2 buffer 50 μl를 각 well에 처리하고, 10분간 반응시 킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite stand- ard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.

(2) ELISA 측정

Raw 264.7 cells을 6 well plates에 3×10⁵ cells/ml이 되도록 분주하고, 24시간 동안 배양한 후, 麻黃, 附子, 細 辛 추출물을 1, 10, 100 (μg/ml)의 농도로 처리하고, LPS 1 μg/ml을 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 세 포배양액을 수거하여 일정량의 상등액을 취해 PGE2, MMP-9, TIMP-1 kit을 사용하여 PGE2, MMP-9, TIMP-1을 각각 측정하였다.

(3) Cytokine 생성량 측정

Raw 264.7 cells을 12 well plates에 1.5×10⁵ cells/ml 이 되도록 분주하고, 24시간 동안 배양한 후, 麻黃, 附子, 細辛 추출물을 100 (μg/ml)의 농도로 처리하고, LPS 1 μg/ml을 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 세포배양 액을 수거하여 배양액에 함유된 IL-1β, IL-6, TNF-α를 custom-made 4-plex cytokine Milliplex panel을 이용하 여 측정하였다.

(4) Western blot

Raw 264.7 cells을 12 well plates에 1.5×10⁵ cells/ml 이 되도록 분주하고, 24시간 동안 배양한 후, 麻黃, 附子, 細辛 추출물을 100 (μg/ml)의 농도로 처리하고, LPS 1 μg/ml을 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 PBS로 3회 세척한 후 세포를 얻어 원심분리하여 pellet에 lysis buf-

Fig. 1. Effects of EH, ALRP, AR extract on the cell viability of RAW 264.7 cells. Cells were treated with 10, 50, 100, 200, 400, 800 (μg/ml) of each ex- tract for 24 hours. Cell viability was determined using the WST assay.

The results are expressed as mean±S.D. from three inde- pendent experiments.

Samples Total phenolics (mg GAE*/g ext.)

EH 105.04±1.65

ALRP 5.12±0.15

AR 28.77±1.67

*Total phenolic contents was expressed as milligram of gallic acid equivalent (GAE) per gram of extract.

Table II. Total Phenolic Contents of 80% Ethanol Extract of EH, ALRP and AR

fer를 가하여 ICE에서 30분간 반응시킨 후, 12,000 rpm으 로 15분 동안 원심분리를 하여 상등액을 모았다. 모은 상 등액은 BCA protein assay kit를 사용하여 단백질을 정량 하였다. 단백질 20 μg을 5Xsample buffer에 넣고 100^oC 에서 5분간 불활성화 시켜 12% SDS polyacrylamide gel 에 전기영동 하였다. 전기영동 된 SDS polyacrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 transfer 한 후 5%

skim milk에서 30분간 blocking 하였다. iNOS, COX-2, HO-1, b-actin의 항체는 1：1000의 비율로 4^oC에서 over- night으로 부착시켰으며 그 후 tris buffered salin Tween- 20 (TBST) buffer로 5분간 3번 washing하였다. 2차 항체 는 1：1000의 비율로 희석하여 2시간 상온에서 부착시킨 후 TBST buffer로 2시간 동안 여러번 washing하였고, ECL (AbClon, Seoul, Korea)을 처리한 membrane을 Chemi-DOC를 이용하여 단백질을 확인하였다.

3. 통계처리

실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's t-test를 사용하여 통계처리 하였고, p＜0.05에서 유의성을 검정 하였으며, 세 번 이상의 반복된 실험 결과를 평균 (mean)±표준편차(standard deviation) 값으로 나타내었 다.

결과»»»

1. 세포독성에 미치는 영향

RAW 264.7 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기

위하여 MTT assay를 실시한 결과, 대조군을 100.0±

14.8%로 나타냈을 때, 麻黃 추출물은 10, 50, 100, 200, 400, 800 μg/ml 농도에서 각각 101.3±12.9%, 100.7±

11.7%, 105.5±7.4%, 90.5±11.4%, 84.7±6.2%, 57.3±

4.8%의 생존율을 보였으며, 附子 추출물은 10, 50, 100, 200, 400, 800 μg/ml 농도에서 각각 101.5±4.1%, 100.8±10.7%, 95.6±12.3%, 67.2±12.5%, 32.5±1.9%, 23.7±5.2%를, 細辛 추출물은 10, 50, 100, 200, 400, 800 μg/ml 농도에서 각각 97.0±4.9%, 96.9±4.0%, 91.4±

12.8%, 65.5±7.6%, 21.7±3.20%, 14.4±2.5%의 생존율 을 보였다. 麻黃, 附子, 細辛의 모든 추출물에서 90% 이 상의 생존율을 보인 100 μg/ml 농도로 실험을 진행하였 다(Fig. 1).

2. 항산화 효능에 미치는 영향

1) 총 Polyphenol 함량

麻黃, 附子, 細辛 추출물에 존재하는 총 Polyphenol 함 량을 gallic acid를 표준물질로 하여 측정한 결과, Polyphenol 함량이 각각 105.04±1.65 mg/g, 5.12±0.15 mg/g, 28.77±1.67 mg/g으로 麻黃에서 가장 높게 나타 났다(Table II).

Fig. 2. DPPH free radical scavenging activity of EH, ALRP and AR extract. Extracts were incubated with DPPH solution at 37

C for 30 mins. Activities were determined by measurement of absorbance at 517 nm.

The results are expressed as mean±S.D. from three in- dependent experiments.

Fig. 3. ABTS free radical scavenging activity of EH, ALRP and AR extract. Extracts were incubated with ABTS solution at RT for 10 mins. Activities were determined by measurement of ab- sorbance at 734 nm.

The results were expressed as mean±S.D. from three in- dependent experiments.

Fig. 4. Effects of EH, ALRP and AR extract on the ROS pro- duction in Raw 264.7 cells.

The Raw 264.7 cells were stimulated with LPS and treated with each extract (100 μg/ml) for 24 hours. The ROS pro- duction was analysed following incubation with DCFH-DA by flow cytometry.

The results were presented by the mean±S.D. from three in- dependent experiments. Statistically significant value compared with control by T tes t (**p＜0.01).

2) DPPH 소거능

麻黃, 附子, 細辛 각각 100 μg/ml 농도에서 50.2±

3.2%, 3.0±1.0%, 15.1±2.3%로 나타나 麻黃에서 가장 높은 소거율을 보였다(Fig. 2).

3) ABTS 소거능

麻黃, 附子, 細辛 각각 100 μg/ml 농도에서 47.7±

1.3%, 1.6±0.5%, 9.3±0.6%로 나타나 麻黃에서 가장 높

은 소거율을 보였다(Fig. 3).

4) ROS 생성

대조군을 100.0±1.0%로 나타냈을 때 정상군은 50.9±3.7%였으며, 細辛 100 μg/ml 농도에서 83.3%로 유의성 있게(p＜0.01) 감소하였다. 麻黃은 다소 증가하였 으며, 附子에서는 감소를 보였으나 유의성은 없었다(Fig.

4).

3. 항염증 효능에 미치는 영향

1) NO, iNOS

NO 생성량은 대조군을 100±3.7%로 나타냈을 때 정상 군은 38.8±9.9%, 麻黃, 附子, 細辛에서 각각 80.5±

8.1%, 91.3±9.3%, 51.2±3.8%로 유의한 감소를 나타냈 으며, 細辛에서 가장 높은 감소율을 보였다(Fig. 5A).

iNOS 단백질의 발현량은 정상군에서 약하게 발현되었 으나, LPS 처리군에서 현저하게 증가하였으며, 麻黃, 附 子, 細辛 처리군에서는 麻黃과 細辛에서 단백질의 발현이 감소하였다(Fig. 5B).

2) PGE2, COX-2

PGE2 생성량은 정상군이 60.8±41.4 pg/ml, 대조군

Fig. 5. Effects of EH, ALRP and AR extract on NO production and iNOS expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells.

Cells were treated with LPS (1 μg/ml) and each extract 100 (μg/ml) for 24 hours.

The results are expressed as mean±S.D. from three in- dependent experiments. Statistically significant value compared with control by T test (*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001).

Fig. 6. Effects of EH, ALRP and AR extract on PGE2 pro- duction and COX-2 expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells.

Cells were treated with LPS (1 μg/ml) and each extract 100 (μg/ml) for 24 hours.

The results are expressed as mean±S.D. from three in- dependent experiments. Statistically significant value compared with control by T test (**p＜0.01, ***p＜0.001).

301.3±50.9 pg/ml, 麻黃 184.6±50.2 pg/ml, 附子 323.9±40.7 pg/ml, 細辛 92.2±34.2 pg/ml으로 나타나, 麻黃과 細辛에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다 (Fig. 6A).

COX-2 단백질의 발현량은 대조군에서 약하게 발현되 었으나, LPS 처리군에서 현저하게 증가하였으며, 麻黃, 附 子, 細辛 처리군에서는麻黃과 細辛에서 단백질의 발현이 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 6B).

3) IL-1β, IL-6, TNF-α

IL-1β의 생성량은 대조군이 20.6±4.7 pg/ml, 정상군 이 4.1±1.5 pg/ml, 麻黃에서 9.2±3.6 pg/ml, 附子에서 12.2±3.9 pg/ml, 細辛에서 8.2±0.6 pg/ml로 나타났으 며, 麻黃과 細辛에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다 (Fig. 7A).

IL-6의 생성량은 대조군이 6008.4±642.4 pg/ml, 정상 군이 3.2±1.5 pg/ml, 麻黃에서 4882.1±487.9 pg/ml, 附 子에서 4180.4±445.1 pg/ml, 細辛에서 1178.0±215.3 pg/ml로 나타났으며, 細辛에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 7B).

TNF-α의 생성량은 대조군이 19234.7±3574.1 pg/ml, 정상군이 162.1±14.2 pg/ml, 麻黃에서 17472.1±745.0 pg/ml, 附子에서 11335.6±1511.0 pg/ml, 細辛에서 3577.7±852.7 pg/ml로 나타났으며, 附子와 細辛에서 대 조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 7C).

4) MMP-9, TIMP-1

MMP-9의 생성량을 측정한 결과 정상군은 25.25±

20.42 pg/ml, 대조군은 226.40±74.53 pg/ml, 麻黃은 100.30±18.70 pg/ml, 附子는 277.00±78.30 pg/ml, 細 辛은 657.00±95.09 pg/ml 으로 나타나, 대조군에 비해 麻黃에서 유의하게(p＜0.001) 감소하였다(Fig. 8A).

TIMP-1의 생성량을 측정한 결과 정상군은 2032.6±

172 pg/ml, 대조군은 2910.0±73.7 pg/ml, 麻黃은 1524.8±265.8 pg/ml, 附子는 2916.4±281.1 pg/ml, 細 辛은 4495.3±33.6 pg/ml 으로 나타나, 대조군에 비해 麻 黃에서 유의하게(p＜0.001) 감소하였다(Fig. 8B).

5) HO-1

RAW cells에 麻黃, 附子, 細辛을 100 μg/ml의 농도로 24시간 처리하고, HO-1 expression level을 western blot

Fig. 7. Effects of EH, ALRP and AR extract on LPS-stimulated cytokine production in RAW 264.7 cells.

Cells treated with LPS (1 μg/ml) and each extract 100 (μg/

ml) for 24 hours. The results are expressed as mean±S.D.

from three independent experiments.

Statistically significant value compared with control by T test (*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001).

Fig. 8. Effects of EH, ALRP and AR extract on LPS-stimulated MMP-9 and TIMP-1 in RAW 264.7 cells.

Cells treated with LPS (1 μg/ml) and each extract 100 (μg/

ml) for 24 hours. The results are expressed as mean±S.D.

from three independent experiments.

Statistically significant value compared with control by T test (***p＜0.001).

Fig. 9. Effects of EH, ALRP and AR extract on HO-1 ex- pression in RAW 264.7 cells.

Cells treated with each extract 100 (μg/ml) for 24 hours.

Whole cell lysates were prepared, and the protein expression of HO-1 was measured Western blot analysis. B-actin was used as an internal control.

으로 확인하였다. 麻黃에서 HO-1의 발현이 뚜렷하게 증 가하였고, 附子에서도 약간 증가하였다(Fig. 9).

6) 항염증 효과와 HO-1 발현과의 관계

HO-1 발현 억제제인 SnPP(tin (Sn) protororphryin-IX) 를 사용하여 麻黃, 附子, 細辛과 같이 각각 처리하였다.

NO 생성량은 대조군을 100±18.0%로 나타냈을 때 정상 군은 29.0±19.4%, 麻黃, 附子, 細辛에서 각각 96.1±

18.0%, 99.2±14.6%, 81.9±9.9%로 나타났으며, SnPP 없 이 麻黃, 附子, 細辛에 의해 억제 되었던 NO 생성량은 각

각 81.0±8.1%, 91.0±9.3%, 51.0±3.8%로 나타나 SnPP 병용 투여시 부분적으로 증가되었다(Fig. 10A).

IL-1β 생성량은 대조군에서는 20.6±4.7 pg/ml, 정상 군은 9.6±4.0 pg/ml, 麻黃, 附子, 細辛에서 각각 13.7±4.4 pg/ml, 13.1±3.6 pg/ml, 14.6±4.0 pg/ml로 나타났으며, SnPP 없이 麻黃, 附子, 細辛에 의해 억제 되 었던 IL-1β 생성량은 각각 9.2±3.6 pg/ml, 12.2±3.9 pg/ml, 8.2±0.6 pg/ml로 나타나 SnPP 병용 투여시 부분 적으로 증가되었다(Fig. 10B).

Fig. 10. Effects of SnPP on the inhibition of nitrite (A), IL-1b (B), IL-6 (C), and TNF-a (D) production by EH, ALRP and AR extract treatment in LPS-stimulated RAW 264.7 cells.

Cells were treated in the presence or absence of SnPP (20 uM) and each extract (100 μg/ml) for 24 hours and stimulated with LPS (1 μg/ml) for 24 hours.

The results are expressed as mean±S.D. from three independent experiments.

Statistically significant value compared with control by T test (*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001).

IL-6 생성량은 대조군에서는 6008.4±642.4 pg/ml, 정 상군은 3.2±1.5 pg/ml, 麻黃, 附子, 細辛에서 각각 5794.9±370.2 pg/ml, 5034.2±687.2 pg/ml, 1359.5±

103.0 pg/ml로 나타났으며, SnPP 없이 麻黃, 附子, 細辛 에 의해 억제 되었던 IL-6 생성량은 각각 4882.1±487.9 pg/ml, 4180.4±445.1 pg/ml, 1178.0±215.3 pg/ml로 나 타나 SnPP 병용 투여시 부분적으로 증가되었다(Fig.

10C).

TNF-α 생성량은 대조군에서는 19234.7±3574.1 pg/

ml, 정상군은 162.1±14.2 pg/ml, 麻黃, 附子, 細辛에서 각각 17994.2±1231.0 pg/ml, 14914.2±2203.2 pg/ml, 7858.5±1881.4 pg/ml로 나타났으며, SnPP 없이 麻黃, 附子, 細辛에 의해 억제 되었던 TNF-a 생성량은 각각 17472.1±745.0 pg/ml, 11335.6±1511.0 pg/ml, 3577.7±

852.7 pg/ml로 나타나 SnPP 병용 투여시 부분적으로 증

가되었다(Fig. 10D).

고찰»»»

인체 내에는 free radical을 제거하는 산화억제 기구가 활성화되어 있어서 산화촉진물질과 산화억제물질이 균형 을 이루고 있지만 여러 가지 요인들에 의하여 이 균형상 태가 깨져서 산화촉진 쪽으로 기울게 되면, 산화적 스트 레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포 손상 및 병리적 질환이 야기된다³⁰⁾. 이런 산화적 스트레스는 기본 적으로 노화와 밀접한 관련을 갖고 있으며, 체내 DNA 손 상, 지질의 과산화로 인한 세포막의 손상, 단백질과 지질 의 산화 등을 가져와 동맥경화나 암, 백내장, 노인성 치 매, 파킨슨씨병과 같은 질환 등을 유발 시킨다³¹⁾.

본 연구에서 사용한 麻黃附子細辛湯은 『傷寒論』¹⁶⁾에 처음 등재된 처방으로 麻黃, 附子, 細辛으로 구성되어 있 으며 "少陰病 始得之 反發熱 脈沈者 麻黃附子細辛湯主之"

라 하여, 辛甘溫한 性味로 溫少陰之經, 溫少陰之寒의 작 용이 있다¹⁷⁾.

麻黃은 "主治 喘咳水氣也. 旁治 惡風 惡寒 無汗 身疼 骨節痛 一身黃腫³²⁾."이라 하여 身疼 骨節痛에 대한 효능 이 언급되었으며, 임상에서는 神經痛과 류마티스 관절염 초기에 다른 약재들과 병용하여 통증 억제에 사용하고 있 고³³⁾, 이 등²³⁾은 麻黃이 다발성 관절염에 유효함을, 송 등²⁴⁾ 은 麻黃 추출물의 항산화 효능을 보고한 바 있다.

附子는 "主逐水也. 故能治 惡寒 身體四肢 及骨節疼痛 或沈重 或不仁 或厥冷³²⁾."라 하여 身體四肢 骨節疼痛에 대한 효능이 언급되었으며, 고 등²⁵⁾은 PGE, IL-6 및 TNF- α의 변화에 영향을 미쳐 다양한 면역 또는 염증반응을 억제한다고 보고하였다.

細辛은 "主治 宿飮停水也. 故治 水氣在心下而咳滿 或上 逆 或脇痛³²⁾."이라 하여 脇痛에 대한 효능이 언급되었으 며, 황 등²⁷⁾은 collagen 유발 관절염 모델에서 TNF-α, IL-6, Anti-collagen II 억제, 연골의 파괴와 골막의 증식 감소로 류마토이드 관절염 억제에 유효함을 보고하였다.

麻黃附子細辛湯에 대한 연구로는 이 등²²⁾의 麻黃附子 細辛湯의 골관절염 치료 효능에 대한 연구가 있었지만, 각각 개별 약재에 대한 비교 연구는 없었다. 이에 저자는 麻黃附子細辛湯의 각 구성약물별 항산화 및 항염증 효능 을 검토하고, HO-1 발현과 항염증 효능과의 연관성을 규 명하고자 하였다.

본 연구에 사용된 LPS는 그람 음성균의 외막성분으로 써 대식세포의 감염초기에 반응하고 숙주 방어에 중추적 인 역할을 하나, 과도한 LPS 자극은 대식세포에서 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β 및 IL-6 와 같은 전 염증성 매개물질과 nitric oxide(NO), prosta- glandin E2 (PGE2) 등의 염증 매개물질을 분비시킨다^34,35). RAW 264.7 세포에 대한 독성을 검토하고자 MTT as- say로 측정한 결과 麻黃, 附子, 細辛의 모든 추출물에서 90% 이상의 생존율을 보인 100 μg/ml 농도로 실험을 진행하였다(Fig. 1).

항산화 효능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 총 Polyphenol 함량, DPPH 및ABTS radical 소거능에 미치 는 영향, ROS 생성량에 미치는 영향을 측정하였다.

Polyphenol 화합물은 flavonoids, anthocyanins, tan- nins, catechins, isoflavones, lignanas, resveratrols 등을 총칭하며, 식물계에 널리 분포되어 있고 과일 및 엽채류 에 다량 함유되어 있다³⁶⁾. Polyphenol에 존재하는 다수의 히드록실기(-OH)는 여러 화합물과 쉽게 결합하는 특성을 가지고 있어 항산화 효과 및 항암, 항염 효과가 뛰어나며³⁷⁾, 박 등³⁸⁾은 총 Polyphenol 함량이 높을수록 DPPH 소거능 등의 항산화 활성이 높아진다고 보고하였다.

본 연구에서 麻黃, 附子, 細辛 추출물에 존재하는 총 Polyphenol 함량을 gallic acid를 표준물질로 하여 측정한 결과, 각각 105.04±1.65 mg/g, 5.12±0.15 mg/g, 28.77±1.67 mg/g으로 麻黃에서 가장 높게 나타났다 (Table II).

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 비교적 안정 된 자유기로 과다 생성시 염증 등을 일으킬 수 있으며, DPPH radical 소거 활성법은 여러 항산화 활성을 측정하 는 방법 중 가장 간단하면서 대량으로 측정이 가능하고 실제 항산화 활성과도 연관성이 높다^39,40). ABTS 양이온 소거활성은 ABTS 용액과 과항산칼륨과의 반응에 의해 생 성된 ABTS 양이온이 추출물의 항산화력에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 항산 화 측정 방법으로, DPPH radical 제거능과 유의적인 상관 성을 보이는 것으로 알려져 있다⁴¹⁾.

본 연구에서 麻黃, 附子, 細辛 추출물에 대한 DPPH 및 ABTS radical 소거능을 측정한 결과 麻黃에서 가장 높은 소거율을 보였다(Fig. 2, 3).

인체 내에는 안정한 상태의 산소가 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학 반응과 같은 환경적 및 생화 학적 요인 등에 의하여 superoxide anion radical, hy- droxyl radical, hydrogen peroxide radical 및 singlet oxygen과 같은 반응성이 큰 활성산소(reactive oxygen species, ROS)로 전환된다⁴²⁾. 이들 활성산소는 강한 산화 력으로 류마티스 관절염, 당뇨병, 동맥경화, 암 등 각종 질병과 생체 대사과정에서 생성되어 세포막 지방질을 과 산화 시키고 세포막 투과성의 변화를 초래하여 DNA 손 상을 유발시킨다^43-45).

본 연구에서 RAW 264.7 세포에서의 ROS 생성량을 측 정한 결과, 細辛 100 μg/ml 농도에서 유의하게 감소하 였다. 麻黃은 다소 증가하였으며, 附子에서는 감소를 보 였으나 유의성은 없었다(Fig. 4).

항염증 효능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 NO 생 성과 iNOS 발현에 미치는 영향, PGE2 생성과 COX-2 발 현, IL-1β, IL-6, TNF-α, MMP-9, TIMP-1 생성에 미치는 영향, HO-1 발현에 미치는 영향 및 항염증과 HO-1 발현 과의 관계에 미치는 영향을 측정하였다.

Nitric oxide synthase (NOS)는 NO 생성에 관여하는 효소로 세포의 종류에 따라 신경성 NOS (nNOS), 내피성 NOS (eNOS), 유도성 NOS (iNOS)로 구분되며 그 중 iNOS는 NO의 과발현에 영향을 미치며 다양한 세포에서 유도되어 병리생태학적 관점에서 중요한 역할을 한다⁴⁶⁾. NO는 일반적으로 신경계와 면역계에서 중요한 전달 물질 로 작용하여 박테리아를 사멸시키거나 종양을 제거하는 역할을 하지만, 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시키게 되며 조직의 손상, 유전자 변이, 신경 퇴행성 질병 등의 발생에 관여한다^47,48). 또한 NO는 활성산소인 superoxide 와 결합하게 되면 보다 반응성이 강한 peroxynitrite의 형 태로 전환되어 생체조직의 괴사를 야기할 수 있다⁴⁹⁾.

본 연구에서 NO 생성량을 측정한 결과, 麻黃, 附子, 細 辛에서 모두 유의한 감소를 나타냈다(Fig. 5A). iNOS 단 백질의 발현량은 麻黃, 附子, 細辛 처리군에서는 附子를 제외하고는 단백질의 발현이 감소하였다(Fig. 5B).

Prostaglandin E2는 여러 질환에서 염증, 신장 혈류량 과 기능유지, 신체의 평형 유지 등에 매우 중요한 역할을 하는 물질로 알려져 있다⁵⁰⁾. 이는 cyclooxygenase의 활성 화에 따른 산물로서 염증질환, 자가 면역 질환 등에 중요 한 역할을 하며, 특히 염증 반응의 중요한 매개 물질로 작용하고 혈관 확장 외에 통증과 발열 반응을 유도한다⁵¹⁾.

Cyclooxygenase (COX)-1 유전자와 COX-2 유전자는 arachidonic acid를 prostaglandins (PGs)과 thromboxane 으로 전환시키는 과정을 조절하는 효소로서 비스테로이 드 항염증제(NSAIDs)는 COX 효소의 활성을 억제하여 PGs 생성을 저해함으로써 항염증효과를 나타낸다⁵²⁾. 특 히 COX-2는 세포내외 자극에 의해 그 발현이 유도되는 특징을 가지며 세포분열촉진물질(mitogen)이나 종양 유 도물질(tumor promotor)의 자극 후 PG 상승과 비례하여 증가하기 때문에 염증발생과 암발생 등에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다⁵³⁾.

본 연구에서 PGE2 생성과 COX-2 발현에 미치는 영향 을 알아본 결과, PGE2 생성량은 麻黃과 細辛에서 대조군 에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 6A). COX-2 단백질의

발현량은 麻黃, 附子, 細辛 처리군에서는 附子를 제외하 고 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 6B).

Cytokine인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6은 염증성 활막에서 다량 생산되어 기질의 합성을 저해하고 분해를 촉진한

다^54,55). TNF-α는 염증반응을 유발하는 인자로, 반응이

시작되면 다른 염증 매개 인자들과 함께 증상을 악화시킨 다⁵⁶⁾. IL-1β는 T세포를 활성화시키고 림프구, 단핵구 등 의 세포 염증부위 침윤을 증가시키며⁵⁷⁾, IL-6는 B세포의 증식, 분화, 항체 형성에 관여하는 물질로 IgM, IgG, IgA 의 증식을 유도하고 T세포 분화 증식에 관여하는 것으로 알려져 있다⁵⁸⁾.

본 연구에서 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성량에 미치는 영향을 알아본 결과, IL-1β의 생성량은 麻黃과 細辛에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였고(Fig. 7A), IL-6의 생 성량은 細辛에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다 (Fig. 7B). TNF-α의 생성량은 附子와 細辛에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 7C).

MMP-9은 기저막에 포함된 type IV collagen 등의 파 괴를 촉진시켜 세포외 기질의 파괴를 동반하는 여러 질환 과 암세포의 침윤 및 전이 등에 밀접히 관련되어 있다⁵⁹⁾. TIMPs는 MMPs와 1：1로 결합하여 MMPs의 활성화를 억 제하며⁶⁰⁾, MMPs와 TIMPs의 발현의 부조화가 염증성 질 환에서 조직의 분해를 일으킨다고 추측된다⁶¹⁾. MMPs의 역조절 단백인 TIMPs는 세포외 기질의 항상성을 유지하 는 중요한 인자이며, 이 중 TIMP-1은 MMP-9의 역조절 단백으로서 1：1로 복합체를 이루어 MMP-9의 활성을 저 하시킨다고 알려져 있다⁶²⁾.

본 연구에서 MMP-9과 TIMP-1의 생성량에 미치는 영 향을 알아본 결과, MMP-9과 TIMP-1의 생성량은 麻黃에 서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 8).

HO는 세포내의 heme의 양을 적절히 유지하도록 하는 중요한 효소로 3가지의 동형단백질로 존재한다⁶³⁾. 대부분 의 세포에서 기본적인 대사활동에 관여하는 HO-2 및 HO-3와는 다르게, HO-1은 산화적 스트레스, 지질다당류, 멜라토닌 및 아데노신과 같은 다양한 자극에 의해 유도되 는 형태이며^64,65), 산화적 손상 억제, 염증 반응 감소 및 세포 증식 조절을 통해 조직의 항상성 유지에 중요한 역 할을 수행한다⁶⁶⁾. HO-1은 스트레스나 허혈 및 염증 반응 에서 유도되고 주로 세포를 보호하는 기전에 작용하는 것 으로 알려져 있으며⁶⁷⁾, HO-1과 CO는 nuclear factor

(NF)-κB의 inactivation을 통해 활성화된 대식세포에서 NO의 생성과 iNOS 단백질의 발현을 조절한다고 보고되 어 있다⁶⁸⁾.

본 연구에서는 HO-1의 발현에 미치는 영향 및 항염증 과 HO-1 발현과의 관계에 미치는 영향을 알아보았다. 우 선 麻黃, 附子, 細辛을 처리한 RAW cells를 western blot 으로 확인한 결과, 麻黃에서 HO-1의 발현이 뚜렷하게 증 가하였고, 附子에서도 약간 증가하였다(Fig. 9). 항염증과 HO-1 발현과의 관계를 알아보기 위해 HO-1 발현 억제제 인 SnPP를 사용하여 麻黃, 附子, 細辛과 같이 각각 처리 한 실험에서 NO, IL-1β, IL-6, TNF-α 의 생성량은 SnPP 병용 투여시 부분적으로 증가되었다(Fig. 10). 그러므로 HO-1은 항염증 효능에 영향을 미치며, 麻黃附子細辛湯의 구성약물 중 麻黃이 HO-1의 발현에 가장 큰 영향을 미친 다고 생각된다.

이상의 연구 결과를 종합하면, 麻黃附子細辛湯의 구성 약물인 麻黃, 附子, 細辛 추출물의 개별투여가 LPS로 자 극된 RAW 264.7 세포에서 항산화 및 항염증 효과를 나 타냄을 확인할 수 있었고, 아울러 항염증 효능을 촉진시 키는 HO-1의 발현에도 영향을 미친다는 것을 알 수 있었 다. 본 연구의 설계 단계에서 麻黃附子細辛湯의 개별 약 재의 항산화 및 항염증 효능 비교가 연구 주제였기 때문 에 각각의 개별 약재와 개별 약재가 혼합된 麻黃附子細辛 湯 추출물과의 비교연구가 이루어지지 못한 것은 본 연구 의 가장 큰 한계점이다. 또한 본 연구는 in vitro 실험으 로, 실제 임상 활용에 더욱 도움이 될 수 있기 위해서는 in vivo 실험까지 필요하리라 생각된다. 향후 이러한 점 들을 보완한 추가연구를 통하여 임상에서 각종 염증성 질 환, 특히 한방재활의학과 밀접한 관련이 있는 골관절염이 나 류마티스 관절염등 기타 염증성 근골격계 질환을 치료 함에 있어, 麻黃附子細辛湯 및 각 구성약물의 효능을 이 해하고 응용하는데 도움이 되었으면 한다.

결론»»»

麻黃附子細辛湯의 각 구성약물별 항산화 및 항염증 효 능을 비교하고, HO-1 발현과 항염증 효능과의 연관성을 살펴보기 위하여 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포를 이용 하여 항산화, 항염증 효능을 관찰한 결과 다음과 같은 결

론을 얻었다.

1. 총 Polyphenol 함량은 麻黃에서 가장 높았고 細辛, 附子의 순으로 나타났다.

2. DPPH, ABTS 소거능은 麻黃에서 가장 높았고 細辛, 附子의 순으로 나타났다.

3. ROS 생성량은 細辛에서 유의성 있게 감소하였다.

4. NO 생성량은 細辛, 麻黃, 附子의 순으로 모두 유의 한 감소를 나타냈으며, iNOS 발현량은 麻黃, 細辛에서 감 소하였다.

5. PGE2 생성량은 細辛, 麻黃의 순으로 유의하게 감소 하였으며, COX-2 발현량은 麻黃, 細辛에서 감소하였다.

6. IL-1β의 생성량은 麻黃, 細辛에서 유의하게 감소하 였고, IL-6의 생성량은 細辛에서 유의하게 감소하였다.

TNF-α의 생성량은 附子, 細辛에서 유의하게 감소하였 다.

7. MMP-9과 TIMP-1의 생성량은 麻黃에서 유의하게 감 소하였다.

8. HO-1 발현은 麻黃에서 뚜렷하게 증가하였고, 附子 에서 약간 증가하였다.

9. HO-1 발현 억제제인 SnPP를 사용하여 麻黃, 附子, 細辛과 같이 각각 처리한 실험에서 NO, IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성량은 SnPP 병용 투여시 부분적으로 증가 되었다.

이상과 같이 麻黃附子細辛湯의 구성약물인 麻黃, 附子, 細辛은 각각 항산화 및 항염증 효능을 가지고 있지만, 지 표에 따라서 그 효능은 각기 다르게 나타남을 알 수 있었 다. 각 개별 약재의 차이점을 인지하여 임상에 활용하면 보다 효율적인 약물 활용이 가능할 것으로 기대된다.

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