인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 1 / 31 BRIC View 2020-T31
인간의 질병을 가진 동물 모델
이 제 욱
오송첨단의료산업진흥재단 신약개발지원센터E-mail:
jwl@kbiohealth.kr 요약문 인간의 질병을 가진 동물 모델은 인간과의 유전적, 구조적 차이에도 불구하고 생체 내 시스템과의 다양한 상호작용과 약물의 흡수, 분포, 대사, 배출 과정을 모두 포함하고 있어 질병의 기전 연구와 약물의 유효성, 독성 및 약동학적 평가 등에 널리 사용되고 있다. 생물 의약학 연구에서 동물 모델의 필요성과 인간의 질병을 가진 동물 모델, 임상 시험에서의 예측 정확도를 높이기 위해 동물 모델 선택 시 고려해야 할 사항에 대해 알아보고자 한다. 인간 질병의 발병 기전과 실험동물, 약물에 대한 이해를 바탕으로 제작된 동물 모델은 인간 질병에 대한 깊은 이해와 통찰, 질병 극복을 위해 필요한 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.Key Words: Efficacy, evaluation, human disease, animal model
목 차
1. 서론 2. 본론 2.1. 동물 모델의 필요성 2.2. 동물 모델에 사용되는 실험 동물 2.2.1. 설치류 2.2.2. 비인간 영장류(Non-human primates, NHPs) 2.2.3. 기타 2.3. 동물 모델 제작 방법 2.3.1. 유전자 조작 모델(GEMs) 2.3.2. 비 유전자 조작 모델(Non-GEMS) BRIC View 동향리포트인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 2 / 31 2.4. 인간의 질병을 가진 동물 모델 2.4.1. 종양 모델 2.4.2. 염증 질환 모델 2.4.3. 면역 질환 모델 2.4.4. 대사성 질환 모델 2.4.5. 호흡기계 질환 모델 2.4.6. 심혈관계 질환 모델 2.4.7. 위장 질환 모델 2.4.8. 간장 질환 모델 2.4.9. 비뇨기계 질환 모델 2.4.10. 근골격계 질환 모델 2.4.11. 신경계 질환 모델 2.4.12. 감염 질환 모델 2.4.13. 인간화(Humanized) 마우스 모델 2.4.14. 미래의 인간 질병 모델 2.5. 동물 모델 선택 시 고려사항 2.5.1. 동물의 종, 성별, 나이 2.5.2. 질병의 발병 기전, 진행 정도 2.5.3. 약물의 표적, 작용 기전 2.5.4. 동물 윤리 3. 결론 4. 참고문헌
1. 서론
인간의 질병은 유전 요인이나 환경 요인 또는 두 가지 요인이 복합적으로 작용하여 발생한다. 질병의 발생 원인과 진행 과정에 대한 이해를 통해 질병 극복을 위한 치료법의 실마리를 찾을 수 있다. 인간의 생리와 질병을 이해하고 치료제를 개발하기 위해 다양한 시험관 내 시스템과 동물 모델을 이용한 연구가 진행되어 왔다. 시험관 내 연구 시스템은 구성 요소와 각 요소 간의 연관성 도출이 비교적 단순해 결과 해석이 명료하다. 그러나, 이를 통해 생명 현상을 이해하고, 생체 내의 복잡한 상호 작용을 통해 나타나는 임상 결과를 정확히 예측하는 데는 한계가 있다. 동물 모델은 인간과의 유전적, 구조적 차이에도 불구하고, 생체 내 세포와 조직, 면역 시스템과의 상호 작용을 통해 통합적인 정보를 제공한다. 동물 모델에는 마우스, 랫트, 토끼, 개, 돼지, 원숭이 등 다양한 동물들이 사용된다. 그 중 마우스는 비임상 연구를 위한 실험 동물 모델로 가장 많이 사용된다. 신뢰성 있는 결과를 얻기 위해서는 시험 목적에 부합하는 동물 모델을 사용하여야 한다.인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 3 / 31 인간의 질병을 가진 동물 모델은 생명 현상의 이해, 질병의 기전 연구, 약물의 유효성 및 독성, 약동/ 약력학적 평가에 사용된다. 본 리뷰에서는 인간의 질병을 가진 동물 모델의 필요성과 동물 모델 제작에 사용되는 실험 기술, 인간의 질병을 가진 다양한 동물 모델, 임상 예측 정확도를 높이기 위해 동물 모델 선택 시 고려해야 할 사항에 대해 알아보고자 한다.
2. 본론
2.1. 동물 모델의 필요성
생명 현상은 몸을 구성하는 각 요소의 생물학적 활성과 각 요소들 간의 상호 작용을 통해 조절된다. 질병은 각각의 활성과 상호작용의 균형이 깨어졌을 때 발생한다. 특히, 생체 내의 상호 작용은 복잡하고 정교해서 시험관 내 시험이나 다른 방법으로 이를 대체하기는 불가능하다. 생명 의약학 연구에서 동물 모델이 필요한 이유는 크게 3가지로 요약할 수 있다. 첫째, 생명 현상을 이해하기 위한 모델이 된다. 실험 동물도 몸의 기본 구성 요소와 호흡, 소화, 대사, 생식 등 생명을 유지하는데 필요한 주요 기능을 수행하는 방식은 인간과 동일하다. 따라서 동물 모델 연구를 통해 인간의 생명 현상을 이해할 수 있다. 둘째, 질병 연구의 모델이 된다. 동물도 인간과 유사한 질병을 가지고 있어 인간 질병 연구의 대리자로 사용할 수 있다. 질병 모델 연구를 통해 발병 기전과 진행 과정을 이해할 수 있다. 마지막으로, 치료제 개발을 위한 평가 모델이 된다. 치료제를 개발하여 규제 당국의 승인을 받기 위해서는 동물 모델에서 작용 기전, 유효성, 독성 평가를 통해 약물이 안전하고 효과적임을 입증해야 한다. 그리고 약동/ 약력학적 평가를 통해 임상 유효 농도와 사용법에 대한 근거 자료를 산출하여야 한다.2.2. 동물 모델에 사용되는 실험 동물
2.2.1. 설치류 설치류는 생물 의약학 연구에 가장 널리 사용되는 동물이다. 그 중에서 가장 많이 사용되는 마우스는 다른 실험 동물에 비해 몇 가지 장점이 있다. 첫째, 지금까지 기초 유전 정보가 많이 축적되어 있어 유전자 조작 기술을 통해 다양한 동물 모델 제작이 가능하다. 둘째, 생육 및 번식 기간이 짧고 자손의 수가 많아 단기간에 많은 개체를 생산할 수 있다. 셋째, 유전적으로 동일한 계통의 동물을 유사한 연령대로 쉽게 구할 수 있다. 넷째, 유전적 동일성으로 질병 증상이 일관되고 실험 간 편차가 적어 결과의 재현성이 좋다. 넷째, 크기가 작아 다루기 쉽고, 유지 관리에 작은 공간과 낮은 비용이 필요하다. 마지막으로, 동물 종이 다양하여 실험 목적에 적합한 종을 선택할 수 있다. 이러한 이유로 설치류는 질병의 기전 연구는 물론 신약 개발 초기 단계부터 비임상 전 과정에 걸쳐 약물의 작용 기전, 효능, 독성, 약동/ 약력학적 평가에 널리 사용된다.인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 4 / 31 2.2.2. 비인간 영장류(Non-human primates, NHPs) 실험 동물은 인간과 유사성이 높을수록 임상 결과 예측의 정확도는 증가하는데, 비인간 영장류가 인간과 유사성이 가장 높다. 특히, 몇 가지 분야에서는 비인간 영장류를 실험 모델로 사용할 필요가 있다. 첫째, 약물의 안전성 평가에 필요하다. 의약품 가이드라인에는 반복 투여 독성 평가에 비설치류에서의 평가를 포함하도록 하고 있고, 유럽에서는 약력학적 평가에 영장류를 포함하도록 하고 있다. 왜냐하면, NHP가 약물의 부작용을 예측에 연관성이 가장 높은 동물 종이기 때문이다. 특히, 생 바이러스 백신은 NHP에서의 효능 및 안전성 평가 결과가 요구된다. 둘째, 감염 질환 연구에 적합하다. 감염 질환 동물은 감염원에 대해 인간과 유사한 감수성과 면역 반응, 증상을 보여야 한다. HIV, 결핵, 말라리아와 같은 감염 질환에 대한 백신, 항생제, 항바이러스제 연구에 특히 유용하다. 셋째, 뇌 연구에 적합하다. NHP는 인간의 보고, 듣고, 느끼고, 생각하고 행동하는 양식을 가장 잘 대변할 수 있다. 알츠하이머, 파킨슨병, 다발성 경화증과 같은 뇌 신경 질환 연구에 유용하다. 넷째, 장기 이식 연구에 적합하다. 장기 이식 연구는 인간과 유사한 거부 반응을 보이는 동물 모델이 필요한데, NHP의 면역 시스템이 인간과 가장 유사하다. 비인간 영장류는 연구 목적에 따라 Rhesus, Cynomolgus, Marmoset 원숭이가 사용된다.
2.2.3. 기타
설치류와 비인간 영장류 외에도 토끼, 개, 돼지, 고양이 등 다양한 동물이 특정 질병 모델로 사용된다. 예를 들면, 토끼는 폐기종과 죽상동맥경화증 모델로, 개는 암과 당뇨 그리고 백내장 모델로, 고양이는 안과 질환 모델로 사용된다.
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2.3. 동물 모델 제작 방법
동물 모델은 제작 방법에 따라 유전자 조작 모델(Genetically engineering models, GEMs)과 비 유전자 조작 모델(Non-genetically engineering models, Non-GEMs)로 나뉜다.
그림 2. 동물 모델 제작 방법에 따른 분류(GEM, Non-GEM).
2.3.1. 유전자 조작 모델(GEMs)
유전자 조작 모델은 유전공학기술을 사용하여 특정 유전자를 변형(제거, 삽입, 조절) 시켜 원하는 표현형으로 만든 것이다. 유전자 조작에는 상동염색체 재조합 기반(homologous
recombination-based) 기술과 핵산 효소 매개 게놈 편집(nuclease-mediated genome editing) 기술이 사용된다.
상동염색체 재조합 기반 기술은 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)의 유전자 조작 기술로 오랫동안 사용되어 왔다. 표적 유전자(target gene) 서열의 내부 혹은 외부에 위치한 2개의 유전자 서열 단편(homologous sequence 1&2)을 도입하고자 하는 대체 유전자(replacement gene)의 양쪽에 연결한 유전자 조작용 벡터(vector)를 제작한다. 미세 주사(microinjection)로 배아줄기세포에 주입하면, 상동염색체 간의 재조합에 의해 표적 유전자를 제거하거나, 새로운 유전자를 삽입 혹은 치환할 수 있다.
핵산 효소 매개 게놈 편집(nuclease-mediated genome editing) 기술은 Zinc Finger Nucleases (ZNFs), Transcription Activator Like Effector Nucleases (TALENs), CRISPR/ Cas9와 같은 핵산 효소를 사용하여 표적 유전자를 조작하는 방법이다. TALEN-기반 게놈 편집 기술은 특정 DNA 서열을 인식하여 결합하는 가이드 단백질과 서열 비특이적으로 DNA를 절단하는 핵산 효소를 융합한 단백질 가이드(Protein-guided) 기반의 게놈 편집 시스템이다 [1]. 가이드 단백질이 특정 DNA
서열을 인식하여 결합하면 핵산 효소가 DNA를 절단한다. 절단 부위는 non-homologous end joining (NHEJ)으로 재결합되거나, 함께 넣어준 vector DNA와의 homologous recombination에 의해 외래 유전자가 삽입 혹은 치환된다.
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CRISPR/ Cas9 기반 게놈 편집 기술은 특정 DNA 서열을 인식하는 short guide RNA (crRNA-tracrRNA)와 spacer DNA가 연결된 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats
(CRISPR)와 DNA-RNA complex를 특이적으로 절단하는 Cas9 핵산 효소로 구성된 핵산 가이드 기반의 게놈 편집 시스템이다 [2]. 표적 유전자의 특정 서열을 CRISPR가 인식하고 Cas9이 절단하여 제거하거나, 절단된 자리에 homologous recombination에 의해 특정 유전자 서열을 삽입할 수 있다.
트랜스포손 매개(transposon-mediated) 게놈 조작 기술은 게놈의 다른 위치로 쉽게
이동하는 성질을 가진 transposon 벡터를 사용하여 외부 유전자를 도입하는 방법이다 [3]. 대표적인 예로 Sleeping Beauty, PiggyBac이 있다. 그 외 렌티바이러스 매개 형질전환(Lentivirus-mediated transfection) 기술은 게놈 DNA에 쉽게 삽입되는 Lentivirus의 특성을 이용한 것으로, ES 세포나 초기 배아에 외부 유전자를 고효율로 도입하는 방법으로 사용된다. 그림 3. 유전자 조작 기술을 사용한 동물 모델의 유형. 현재까지 개발된 유전자 편집기술을 사용하여 표적 유전자를 제거하거나, 발현량을 조절하고 새로운 유전자를 삽입한 동물 모델을 제작할 수 있다 [4]. 녹아웃(Knock-out, KO) 모델은 특정 유전자를 파괴하거나 비활성화하는 모델로, 녹아웃 방식에 따라 세 가지로 나눌 수 있다. 첫 번째, 구성적 녹아웃은 유전자의 일부 혹은 전체를 모든 세포에서 영구적으로 비활성화하는 방법이다. 두 번째, 조건부 녹아웃은 표적 유전자를 특정 시기 혹은 특정 조직에서만 비활성화하는 방법이다. 구성적 녹아웃이 치명적인 유전자의 기능이나 비임상 연구에 사용될 수 있다. 세 번째, 유도성 녹아웃은 특정 시기에 유전자의 비활성화를 유도하는 방법이다. 구성적 녹아웃이 치명적인 발달 관련 유전자의 기능 연구에 사용될 수 있다.
인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 7 / 31 녹인(Knock-in, KI) 모델은 1:1 치환으로 특정 유전자를 제거하고 새로운 유전자를 도입하는 모델이다. 도입되는 유전자는 단일 아미노산을 치환하는 점 돌연변이(point mutation)에서부터 리포터 유전자(LacZ, GFP, Luciferase, 등), 기능 유전자, 인간 유전자 등 다양하다. 예를 들어, 인간의 항체를 생산하는 인간화 마우스는 마우스의 immunoglobulin (Ig) 유전자를 인간의 Ig 유전자로 치환하여 인간 항체를 생산할 수 있게 한 것이다.
녹다운(Knock-down) 모델은 RNA 간섭(RNA interference, RNAi)을 이용한 유전자 침묵(gene silencing) 기술을 적용한 모델이다 [5]. Short hairpin RNA (shRNA) 발현 벡터를 도입하면 특정 유전자의 발현을 간섭하여 단백질 발현량을 감소시킬 수 있다. 녹아웃 모델에 비해 쉽고 빠르게 만들 수 있으며, shRNA 발현을 일시적, 가역적으로 조절함으로써 치명적인 유전자 모델을 제작할 수 있다.
유도에 의한 유전자 조절 방법은 치명적인 특정 유전자의 발현을 유도 시스템을 사용하여 가역적으로 조절하는 것이다. Cre recombinase 유도 시스템은 loxP 서열을 선택적으로 절단하는 Cre recombinase를 사용하여 유전자 발현을 선택적으로 조절하는 기술이다 [6]. 특정 유전자 발현을 간섭하는 shRNA 서열의 중간에 loxP-flanked transcriptional STOP cassette (-loxP-STOP-loxP-) 서열을 삽입하면, 평상 시에는 유전자 interruption에 의해 기능적인 shRNA가 만들어지지 않는다. Cre
recombinase의 발현을 특정 시간 혹은 조직에서 유도하면, Cre recombinase가 loxP-STOP-loxP cassette을 잘라내면 기능적인 shRNA가 만들어져 해당 유전자 발현이 감소된다. Cre recombinase의 유전자를 Tet promoter 하에 두면 Doxycycline을 사용하여 Cre 유전자의 발현을 유도하여 조절할 수 있다.
Dox 유도 시스템은 대장균의 테트라사이클린 저항성 관련 유전자의 발현을 조절하는 테트라사이클린(Tetracycline, Tet) 오페론(operon)을 사용하여 유전자 발현을 선택적으로 조절하는 시스템이다 [7]. Tet operon의 promoter 서열에는 유전자 발현을 개시하는 operator와 이를 저해하는 repressor가 경쟁적으로 결합할 수 있다. Tet이 없을 경우, 활성화된 repressor가 promoter에
결합하여 operator의 결합을 방해함으로써 Tet operon 유전자의 발현이 억제된다. Tet이 있을 경우, repressor가 Tet에 의해 불활성화되고, operator는 Tet promoter에 결합하여 Tet operon 유전자 발현이 개시된다. Doxycycline (Dox)은 Tet의 구조적 유사체로, Tet repressor를 불활성화 시켜 Tet promoter 하의 유전자 발현을 유도할 수 있다. 따라서, 유전자 조작 기술을 사용하면 특정 유전자를 영구적, 일시적, 혹은 가역적으로 조절할 수 있는 동물 모델을 제작할 수 있다. 2.3.2. 비 유전자 조작 모델(Non-GEMS) 비 유전자 조작 모델은 환경적인 요소를 화학적, 물리적, 생물학적 방법으로 조절하여 만든 동물 모델이다. 화학적인 방법은 특정 세포에 독성을 나타내거나, 기능을 제한하는 화합물을 사용하는 방법이다. 물리적인 방법은 수술적인 방법으로 특정 조직을 제거하거나, 기능을 제한하는 방법이다. 생물학적 방법은 종양세포 이식이나 고지방 식이 요법 등을 사용하는 방법이다. 특히, 생물학적 방법은 실험 동물에 따라 감수성이 다르므로, 실험 방법에 따라 적합한 동물 종을 선택하는 것이 중요하다.
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2.4. 인간의 질병을 가진 동물 모델
인간의 질병을 가진 동물 모델은 유전적 혹은 비유전적 방법으로 제작이 가능하다. 질병별 동물 모델은 아래의 표 1에서 확인할 수 있다. 표 1. 인간 질병을 가진 동물 모델. 질병 분류 질병 동물 모델 유발 방법 종양 암세포 이식(피하, 동소, 동종, 이종, 인간화 마우스) 혈관신생 유전적, 비유전적 염증 질환 급성, 만성 염증 피부 염증, 패혈증 Carrageenan, Imiquimod BSA, KLH, OVA, LPS Ligation & puncture면역 질환 알레르기, 천식, 비염
류마티스 관절염
HDM, Bet V1/V2 BSA, OVA, Collagen CFA, LPS, Antibody
대사 성 질환 당뇨(I/II), 비만 STZ, NA, Alloxan, MSG, High fat diet, Surgery
호흡기계 질환 천식, 호중구증가증(ARDS), 폐섬유증(CF), COPD OVA, HDM, LPS, Bleomycin, Smoke 심혈관계 질환 죽상 경화증, 심부전, 심근경색
혈전증, 당뇨 합병증, 고혈압 KO, Surgery
위장 질환 위궤양, 소장 염증, 대장염 Ethanol, Indomethacin, DSS, TNBS/DNBS, OXA
간장 질환 간염, 지방간(NAFLD), 지방 간염(NASH) DIO, CCl4, HBV, WHV
비뇨기계 질환 사구체신염, 급성신부전
만성신장질환(CKD), 방광염
Antibody, CFA, Gentamicin, Cisplatin, Glycerol, Surgery, Adriamycin, CYP, LPS
근골격계 질환 골관절염, 골절, 골다공증, 뼈 결함 MIA, Surgery
신경계 질환 파킨슨, 동맥 폐색, 척수 손상, 뇌경색, 뇌졸중 6-OHDA, MPTP, Surgery
감염 질환 결핵
Influenza, HIV, MERS, 코로나
Bacteria (Mycobacterium tuberculosis) Virus (Influenza, HIV, MERS, SARS-CoV-2)
2.4.1. 종양 모델
종양 모델은 대부분 암세포주를 이식하여 제작하며, 암세포 이식 장소와 기원에 따라 다양한 모델로 나뉜다. 종양 모델은 암 유전자나 바이오마커 발굴, 종양의 발달 과정 및 기전 연구,
인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 9 / 31 암세포 이식 장소에 따른 모델 [8] 이소(Heterotopic) 이식 모델은 암세포가 유래한 조직과는 다른 곳에 이식하는 모델이다. 대표적인 모델이 피하(Subcutaneous) 이식 모델이다. 피하 이식 모델은 제작이 쉽고, 종양 증식이 육안으로 쉽게 관찰되어 항암 효능 평가 모델로 가장 널리 사용된다. 다만, 종양이 유래한 조직의 특성을 반영하지 못한다는 단점이 있다. 예를 들어, 유방암은 에스트로겐 호르몬의 영향을 받는데, 피하 이식 모델은 감수성에서 해당 조직과는 다르다. 췌장관선암(pancreatic ductal adenocarcinoma)은 약물이 종양 조직에 도달하기 힘든 암인데, 피하 이식 모델은 종양 특이적인 약물의 접근성 차이를 반영하기 힘들다. 동소(Orthotopic) 이식 모델은 암세포가 유래한 조직에 이식하는 모델이다. 암세포가 유래한 조직의 특성을 반영할 수 있어 임상 예측 정확도에서 보다 나은 결과를 제공한다. 반면, 모델 제작에 수술이 필요한 경우가 많아 보다 많은 시간과 노력, 기술이 요구되며, 수술에 따른 회복 및 염증 반응이 연구 결과에 영향을 미칠 수 있다. 암세포의 기원에 따른 모델 동종(Syngeneic) 이식 모델은 유전적으로 동일한 동물의 암세포를 이식하는 모델이다. 암세포의 기원이 동일하여 이식에 따른 면역거부반응이 없어 면역시스템이 완전한 동물을 사용할 수 있다. 이 모델은 약물 표적이 인간과 동일하고 표적에 직접 작용하는 약물의 효능 평가에 적합하다. 예를 들어, TGF1의 단백질 서열은 인간과 마우스가 100% 동일하여 인간에 작용하는 약물을 마우스에 그대로 적용할 수 있다. 약물의 표적이나, 약물의 표적 결합 부위가 실험 동물과 동일하다면 syngeneic 모델 적용이 가능하다. 그림 4. 면역 결핍 마우스와 인간화 마우스 발달 과정 [11].
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이종 이식(Xenograft) 모델은 유전적으로 이종인 인간의 암세포를 이식하는 모델이다 [9]. 이종의 암세포에 대한 면역거부반응을 극복하기 위해 면역결핍(Nude 또는 Severe combined immune deficient (SCID) 등) 마우스를 사용한다. 암세포주 이식(cell line-derived xenograft, CDX) 모델과 환자 유래 종양 이식(patient-derived tumor xenograft, PDX) 모델이 이에 속한다. [10]. PDX 모델은 종양의 이질성(heterogeneity)과 환자 특성을 잘 반영하고 있어 환자 맞춤형 치료를 위한 항암제 감수성 평가에 사용된다. 이 모델은 암세포에 직접 작용하는 세포 독성 항암제나 혈관형성 억제제와 같이 면역시스템과의 상호작용이 요구되지 않는 효능 평가에 적합하다. 면역시스템과의 상호작용이 요구되는 면역항암제의 효능평가에서 주의해야 할 점은 인간의 면역시스템을 이식한 인간화 마우스를 사용하여야 한다 [11]. 혈관신생(Angiogenesis) 모델 혈관신생 모델은 종양 성장에 따른 새로운 혈관 형성과 이를 억제하는 약물의 효능을 평가하기 위한 모델이다. 종양이 빠르게 성장하기 위해서는 충분한 산소와 영양분 공급을 위한 새로운 혈관 형성이 필수적이다. 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 새로운 혈관 형성에 필수적인 인자로 혈관 형성 억제제의 주요 표적이다 [12]. Matrigel plug
angiogenesis 모델은 암세포와 Matrigel을 섞은 gel plug를 누드마우스에 이식한 후, gel plug에 형성된 신생 혈관을 면역 화학적(immunohistochemistry, IHC) 염색법이나 혈관 내의
헤모글로빈(hemoglobin)을 분석하여 혈관 신생 억제 효능을 평가한다. 일반적인 종양 이식 모델에 비해 혈관 형성 기간이 짧고, VEGF를 Matrigel에 첨가하여 VEGF에 직접 작용하는 혈관 형성 억제제의 효능을 평가할 수 있다.
2.4.2. 염증 질환 모델 급성 염증 모델
급성 염증은 유발 물질에 노출되면 단시간에 히스타민(histamine), 활성 산소(reactive oxygen), nitrogen species, proinflammatory/ inflammatory mediators가 분비되어 유발된다. Carrageenan은 급성 염증 유발이 잘 되고 재현성이 우수하여 모델 제작에 많이 사용된다.
Carrageenan air pouch 모델은 설치류의 견갑골 쪽 피하에 멸균된 공기를 주입하여 공기 주머니(air pouch)를 만들면, 빈 공간의 표면을 따라 macrophage와 fibroblast가 증식하여 synovial cavity와 유사한 구조가 만들어진다. 여기에 유발 물질(Carrageenan 또는 LPS)을 주입하면 면역 세포 침윤, 삼출물 및 염증 인자 증가를 통해 염증 반응이 유도된다. 이 모델은 일반 관절염 모델에 비해 제작이 쉽고, 분석에 필요한 충분한 시료를 얻을 수 있어, 관절염 유사 모델로 염증 기전 연구와 항염증 약물 평가에 사용된다.
Carrageenan-induced paw edema 모델은 Carrageenan (1%)을 설치류 뒷다리의 한쪽 발바닥(footpad)에 투여하여 발 부종(paw edema)을 유발하는 급성 염증 모델이다 [13, 14]. 발의 부피와 두께 변화를 통해 염증 여부를 쉽게 판단할 수 있고, 조직 병리학적, 생화학적 분석을 통해 염증 평가가 가능해서 항염증 치료제의 효능 평가에 사용된다.
인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 11 / 31 피부 염증 모델
Chemical 유발 contact hypersensitivity (CHS) 모델은 국소 염증 모델로, hapten을 사용한 1차 감작기(Sensitization phase)와 2차 유발기(Elicitation phase)를 통해 만들어진다 [15]. 1차
감작기에는 hapten에 의해 유발된 위험 신호가 염증성 사이토카인 생산을 유도한다. 국소로 이동한 수지상 세포(Dendritic cell)는 hapten을 uptake하고 사이토카인에 의해 활성화된 후, draining lymph node로 이동하여 naïve T 세포를 활성화시킨다. 2차 유발기에 hapten에 다시 노출되면,
알레르겐(Allergen) 특이적인 T 세포가 피부로 이동하여 CD8+ effector T 세포에 의한 염증 반응이 유발된다. 이 모델은 제작 비용이 저렴하고, 결과의 재현성이 높다.
Imiquimod (IMQ) 유발 건선(Psoriasis) 모델은 Toll-like receptor (TLR) 7/8의 ligand인 Imiquimod (5%)를 피부에 도포하여 유발하는 급성 피부 염증 모델이다. 이 모델은 인간의 건선과 유사하여 건선의 가려움증과 항소염제 연구에 사용된다 [16].
Passive cutaneous anaphylaxis (PCA) 모델은 항원 특이적인 IgE 항체를 마우스 한쪽 귀의 피부 내에 주사하여 급성 염증을 유발하는 Type I allergy 모델이다 [17]. IgE를 매개로 mast cell이 분비하는 히스타민에 의해 유도된다. 이 모델은 항염증 효능 평가에 사용된다.
Delayed type hypersensitivity (DTH) 모델은 Bovine serum albumin (BSA), keyhole limpet hemocyanin (KLH), ovalbumin (OVA)과 같은 항원을 면역화 시켜, 항원 특이적인 effector T 세포를 매개로 염증 반응을 유도하는 모델이다 [18]. DTH는 특정 항원을 1차로 투여하여 감작 시킨 후, 2차로 발바닥이나 귀의 피하 혹은 피 내에 항원을 투여하여 염증을 유발 시킨다. 또 다른
방법으로는, 1차 항원 감작없이 항원 특이적인 T 세포를 투여하여 단시간에 DTH 반응을 유도할 수 있다.
패혈증(Sepsis) 모델
패혈증은 미생물에 의한 혈액 감염으로 짧은 시간 내에 혈액 내 tumor necrosis factor- (TNF-α), gamma interferon (IFN-γ), IL-1, IL-6와 같은 염증성 인자가 고농도로 증가되고, 심각한 전신 염증 반응과 다중기관부전이 유발되어 사망에 이르는 급성 염증 질환이다. 수술적인 방법이나 미생물 유래 성분을 투여하여 유발할 수 있으며, 패혈증의 발병 기전 및 치료제 연구에 사용된다.
Cecum ligation/puncture (CLP) 유발 패혈증 모델은 맹장 결찰(ligation)과 천공(puncture)을 통해 패혈증을 유발하는 모델이다 [19]. 저체온증(hypothermia), 심계항진(tachycardia),
빈호흡(tachypnea)과 같은 전형적인 패혈증 쇼크 증상을 나타낸다. 인간의 패혈증과 가장 유사하여 널리 사용된다.
LPS 유발 패혈증 모델은 그람 음성 세균의 외막 endotoxin인 Lipopolysaccharide (LPS)로 패혈증을 유발하는 모델이다 [20]. LPS는 Toll-like receptor (TLR)-4의 ligand로 작용하여
proinflammatory cytokine인 TNFα와 IL-1을 대량으로 발현 시켜 전신 염증 및 다중기관부전을 유발한다. 인간의 패혈증과 많은 면에서 유사하지만, cytokine 수준이 훨씬 높고 빠르게 증가하며, 일시적이다. 따라서 이 모델은 패혈증 초기 증상 연구에 유용하다.
2-HIT 패혈증 모델은 CLP를 통한 1차 hit으로 염증을 유발하고, 5일 후에 Pseudomonas aeruginosa를 사용한 2차 hit으로 폐렴을 유발하는 모델이다 [21]. 초기 proinflammatory cytokine이 감소하고, IL-10과 같은 항염증 인자가 증가한다. 인간의 임상 증상과 유사하게 B, T 세포의 사멸이 증가하고, 면역 활성과 bacterial clearance가 감소하여 감염 상태가 길어진다. 이 모델은 패혈증의 면역 조절 기전과 면역 조절 치료제 연구에 사용된다.
인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 12 / 31 2.4.3. 면역 질환 모델
면역 질환은 면역 시스템의 불균형으로 유발되며, 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis, RA)은 만성 관절 염증을 유발하는 대표적인 자가면역질환이다. 관절에 활액막염(synovitis)을 유발하고 연골과 뼈를 손상시킨다. 심한 경우 폐 섬유증을 유발하기도 한다. 류마티스 관절염은 유발 방법에 따라 CIA, AIA, CAIA 모델로 구분된다.
Collagen-induced arthritis (CIA) 모델은 Type II collagen과 adjuvant를 유화 시켜 감수성 동물 종에 투여하여 유발시킨다. Proinflammatory cytokine인 TNF와 IL-1의 발현이 증가된다. RA 유발에는 MHC II-CD4+ T 세포에 의한 항체 반응이 중요하다. 염증성 부종과 활액막염, 면역 세포 증가, 연골 및 뼈 손상, 골극 형성 및 섬유화가 관찰된다. 인간의 RA와 병리학적 특징이 유사하여 가장 널리 사용되는 모델이다 [22].
Adjuvant-induced arthritis (AIA) 모델은 Complete Freund’s adjuvant (CFA)를 감수성 랫트에 투여하여 유발시킨다. AIA 유발에는 특정 MHC II type과 CD4+ T 세포 의존적인 항체 반응이
중요하다. 관절의 부종 및 염증, 활막 조직 증식, 연골 및 뼈 파괴 등 병리학적 특징이 인간의 RA와 유사하여, RA 치료제의 효능 및 독성 평가에 사용된다 [23].
Collagen antibody-induced arthritis (CAIA) 모델은 Type II collagen의 다양한 epitope을 인식하는 단클론 항체 혼합물과 LPS를 함께 투여하여 유발시킨다. CIA 모델에 비해 유발 기간이 짧고, 동시 유발이 가능하다. 특정 감수성 동물을 사용할 필요가 없어 동물 종 선택이 자유롭다. AIA 모델처럼 면역 시스템 전반에 영향을 미치는 CFA를 사용하지 않아 염증성/ 항염증성 인자의 기능 연구나 항염증성 약물 평가에 적합하다 [24]. 2.4.4. 대사성 질환 모델 대사성 질환은 신체의 신진 대사에 이상이 생겨 발생한다. 동물 모델은 화합물 투여, 식이요법, 수술적 방법으로 제작할 수 있다. 제작 방법에 따라 발병 기전과 약물에 대한 반응이 다를 수 있어 평가하고자 하는 약물의 작용 기전에 따라 적합한 동물 모델을 선택하여야 한다. 대표적인 대사 질환으로 당뇨, 비만이 있다. 제1형 당뇨(Type I diabetes) 제1형 당뇨는 췌장 베타() 세포의 파괴로 인슐린이 거의 혹은 전혀 생산되지 않아 고혈당증을 유발하는 자가면역질환이다. Streptozotocin (STZ) 유발 당뇨 모델은 췌장 베타세포 독성 물질인 STZ를 저용량으로 반복 투여하여 DNA 알킬화를 통한 췌장 베타세포의 선택적인 파괴로 당뇨가 유발된다. 동물 종에 관계없이 신속하게 질병이 유발되어 동종 또는 이종 췌도 이식 연구에 사용된다 [25].
Streptozotocin-Nicotinamide (NA) 유발 당뇨 모델은 NA로 STZ에 의한 독성을 감소 시켜 중증도를 완화시킨 당뇨 모델이다. 췌장 베타세포가 완전히 손상되지 않아 생존에 인슐린 투여가 필요하지 않고 증상이 장기간 안정적으로 유지된다. 이 모델은 당뇨 합병증이나 항당뇨 효능 평가 등 장기 연구에 적합하다 [26].
인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 13 / 31 제2형 당뇨(Type II diabetes) 제2형 당뇨는 인슐린 저항성과 인슐린 부족으로 고혈당증이 유발되는 대사성 질환이다. 고지방 식이요법(High-fat diet)이나 수술적인 방법으로 유발시킬 수 있으며, 인간의 당뇨병과 상당히 유사하다. 고지방식/ STZ 유발 당뇨 모델은 고지방식으로 인슐린 저항성을 유도한 후, STZ로 췌장 베타세포의 기능 장애를 유발하는 모델이다. 유발이 쉽고 저렴하며, 인간의 제2형 당뇨병과 매우 유사하여 치료제 개발 연구에 사용된다 [27].
자궁 내 성장 지연(Intrauterine growth retardation, IUGR) 당뇨 모델은 단백질과 총 칼로리 제한, 과도한 글루코코르티코이드 노출, 양측 자궁 동맥 결찰을 통해 자궁 내 태아의 성장을 지연 시키는 모델로, 성인기에 인슐린 분비 결함, 인슐린 저항성, 췌장 베타세포 손실을 통해 제2형 당뇨가 유발된다. 이 모델은 노년기에 발병하는 제2형 당뇨병 연구에 적합하다 [28]. 부분 췌장 절제(Partial pancreatectomy) 당뇨 모델은 췌장의 일부를 수술로 제거하여 췌장 베타세포의 양을 감소시킴으로써 인슐린 부족으로 인해 고혈당증이 유발되는 모델이다. 모델 제작에 수술이 필요하고 췌장 제거 비율을 잘 조정해야 하지만, 화학적인 방법과 달리 장기 독성이 없다. 췌장 베타세포 감소에 따른 보상 기전 연구에 유용하다 [29].
다이어트 유발 비만(Diet-induced obesity, DIO)
Ob/ob나 db/db 마우스와 같은 유전적 비만 모델은 병리 기전 연구에는 유용하다. 반면 고칼로리 식이요법을 통한 비만 모델은 인간의 비만을 보다 잘 모방하기 때문에 비만 치료제의 비임상 연구에 보다 적합하다. 카페테리아 다이어트(Cafeteria diet) 유발 비만 모델은 쿠키, 사탕, 치즈, 가공육과 같이 맛있고 쉽게 구할 수 있는 식품을 사용하여 비만을 유발하는 모델이다. 식품에 포함된 다량의 소금과 설탕, 지방이 서양식과 유사하여 어린 시절의 비만을 잘 모방하고, 자발적인 과식을 통해 비만이 유발된다. 실제 인간의 비만을 가장 잘 모방할 수 있는 모델이다 [30].
고지방식(High fat diet) 유발 비만 모델은 C57BL/ 6 마우스에 고지방식을 무제한으로 먹여 비만, 고혈당증, 고혈압을 유발하는 모델이다. 인간의 비만과 증상이 매우 유사하며, 마우스의 비만 모델로 적합하다. DBA/ 2J 마우스와 Sprague-Dawley (SD) 랫트도 고지방식 비만 유발이 잘 되는 동물 종이다. Monosodium glutamate (MSG) 유발 비만 모델은 조미료인 MSG를 신생아 마우스에 투여하면 복부와 시상 하부 뉴런의 선택적인 파괴를 통해 인슐린 저항성 및 비만이 유발되는 모델이다 [31]. 2.4.5. 호흡기계 질환 모델 알레르기성 천식(Allergic asthma)은 만성 폐기도 질환이다. 비인간 영장류 모델은 인간 알레르기의 원인인 집먼지 진드기(house dust mite, HDM)나 꽃가루 알레르겐(birch pollen allergens, Bet V1/V2)을 사용하여 유발시킬 수 있다. 기관지 폐포 세척액(BALF)의 면역세포, 혈청 IgE, 폐 조직의 알레르기성 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13)이 증가된다. 인간의 천식과 병리학적, 조직 병리학적, 면역학적 관점에서 매우 유사하다. 마우스 모델은 OVA/ alum을 2주 간격으로 복강 투여하여 감작한 후, 3주 차에 OVA 에어로졸로 유발시킬 수 있다.
인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 14 / 31 알레르기성 비염(Allergic rhinitis)은 공기 중의 알레르기성 항원에 노출된 후 발생하는 코 염증 질환이다. 알레르기성 항원과 면역증강제를 사용하여 유발시킬 수 있으며, 항원과 면역증강제의 종류나 조합에 따라 각기 다른 면역 반응을 유도할 수 있다. BALB/c 마우스 비강에 OVA를 점적하여 유발할 수 있으며, BALB/c의 유발률이 C57BL/6 보다 우수하다. LPS 유발 폐 호중구 증가증 모델은 만성 호흡기 질환 모델로, 감수성 동물인 Sprague-Dawley나 Wistar 랫트의 기관이나 비강 내에 LPS를 투여하여 유발이 가능하다 [32]. 이 모델은 호중구 증가 관련 기전 연구나, 약물의 효능 평가에 사용된다.
Bleomycin 유발 폐 섬유증(Cystic fibrosis, CF) 모델은 항암제인 Bleomycin을 설치류의 기관 내 점적하여 유발시킨다 [33]. 인간의 폐 섬유증과 유사하게 염증과 섬유증이 유발된다. 이 모델은 효과적인 치료법이 없는 특발성 폐 섬유증의 치료법 연구에 사용된다.
Cigarette smoke-induced COPD 모델은 담배 연기를 사용하여 유도하는 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD) 모델이다. 흡연 장치를 사용하여 수개월 노출시켜 유발시킬 수 있다. 기도 염증, 기도 재형성 및 폐기종이 관찰되며, COPD 치료제의 효능 평가에 사용된다 [34]. 2.4.6. 심혈관계 질환 모델 심혈관계 질환은 높은 콜레스테롤과 LDL, 이상 지질혈증이 주요 원인이 되어 발생하며, 전 세계적으로 사망의 주요 원인이다. 죽상 경화증(Atherosclerosis) 모델은 혈장 지질 단백질, 유전적 요인, 동맥 혈류가 원인이 되어 동맥 혈관 내부에 플라크가 축적되어 발병한다. ApoE나 LDLR의 유전자 변형 및 녹아웃을 통해 모델을 제작할 수 있다 [35]. 당뇨 합병증(Diabetes complication) 혈관 질환 모델은 당뇨 합병증으로 유발되는 혈관 질환으로, 관상동맥 심장질환, 뇌졸중, 말초혈관질환과 같은 만성 거대 혈관 합병증과 신 병증, 망막 병증, 신경 병증과 같은 미세혈관 장애가 있다. 이 모델은 혈관 질환성 당뇨 합병증 치료제의 효능 및 안전성 평가에 사용된다 [36]. 심부전(Heart failure) 모델은 심장 박출량이 감소하여 유발되는 증상으로 심근 허혈이나 과부하, 화학적 방법으로 유발이 가능하다 [37]. 심근 허혈 모델은 좌전 하행 동맥(LADL)을 외과적으로 클리핑하여 유발이 가능하다. 수술적 방법은 인간의 심부전과 유사하고 재현성이 높다. 과부하 모델은 대동맥 밴딩에 의해 유발이 가능하며, 좌심실 비대 후 심부전 전환 연구 모델로 적합하다. 화학적 모델은 감수성 랫트에 Dox를 투여하여 유발이 가능하며, 단순하고 비침습적이며 유발 기간이 짧다. 심근 경색(Myocardial infarction)은 심근에 공급되는 혈류가 감소되어 심근의 항상성을 유지할 수 있는 임계 값을 초과하는 허혈 상태에서 발생한다. 외과적 결찰이나 화학적 방법, 유전자 변형을 통해 심근 경색을 유도할 수 있다 [38]. 외과적 방법으로는 좌전 하행 동맥(LAD)을 일정 기간 폐색 후 재 관류하여 유발할 수 있으며, 심근 경색 크기를 줄이기 위한 치료법 연구에 적합하다. 화학적 방법으로는 Isoproterenol을 투여하여 유발할 수 있다. 이 모델은 사망률이 낮고 수술과 관련된 감염 위험이 없다. 유전자 변형 모델은 LDLR, ApoE KO를 통해 유발할 수 있다. 심근 경색에 의한 심장 보호 효과를 평가하는 모델로 적합하다.
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고혈압(Hypertension)은 유전적 방법이나 외과 수술적 방법, 내분비 이상을 통해 유발할 수 있다 [39]. 유전적 모델은 고혈압 Wistar 랫트를 inbreeding하여 유발할 수 있다. 외과 수술 모델은 신장의 한쪽 동맥을 클리핑하여 유발할 수 있다. 내분비 이상 모델은 한쪽 신장을 제거하고
고염식과 Deoxycorticosterone acetate (DOCA) 투여를 통해 유발이 가능하다. 또 다른 방법으로는 angiotensin-2를 고용량으로 infusion 하여 유발할 수 있다. 이 모델은 고혈압 약물의 약리학적 평가에 사용된다.
혈전증(Thrombosis) 모델은 심정맥 혹은 동맥 혈관 내부에 혈류를 방해하는 혈전을 유발시키는 모델이다. 심정맥 혈전증은 하대 정맥(IVC)을 수술적 방법으로 결찰 혹은 협착 시켜 유발할 수 있다. Ferric chloride 유발 혈전증 모델은 Ferric chloride를 국소로 투여하여 생성시킨 자유 라디칼이 지질 과산화와 내피세포 파괴를 유발하고, 혈소판 접착 및 응집을 통해 혈전증이 유발된다 [40]. 2.4.7. 위장 질환 모델 에탄올 유발 위궤양 모델은 에탄올 투여로 위 보호 점막이 가용화되면 위 점막이 염산과 펩신에 노출되어 과도한 염증반응을 통해 위 궤양이 유발된다. 이 모델은 위궤양 기전 연구나 항궤양 치료제의 효능 평가에 사용된다 [41]. Indomethacin 유발 소장 염증 모델은 비스테로이드성 소염 진통제인 indomethacin으로 소장을 손상시켜 염증을 유발하는 모델이다. 이 모델은 인간의 크론병(Crohn’s disease, CD)과 매우 유사한 특성을 가져 크론병 치료제의 효능 평가에 사용된다 [42].
Dextran sulfate sodium (DSS) 유발 대장염 모델은 음이온의 황산화 다당류인 DSS로 결장의 점막을 손상시켜 염증성 인자를 통해 궤양성 대장염(Ulcerative Colitis, UC)을 유발하는 모델이다. 이 모델은 신속하고 쉽게 제작이 가능하고 재현성이 높다. DSS 처리 농도와 빈도에 따라 급성 혹은 만성 UC를 유발할 수 있다. 인간의 UC와 유사하여 IBD 연구에 널리 사용된다 [43].
TNBS/ DNBS 유발 대장염 모델은 Dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS) 혹은
2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)를 직장으로 서서히 투여하여 점막을 감작 시킨 후 Hapten으로 대장염을 유발하는 모델이다. 이 모델은 제작 비용이 저렴하고, 대장염이 빠르게 유발되며, 일관된 국소 손상을 유발한다. TNBS가 DNBS보다 산화 특성이 높아 선호된다 [44].
Oxazolone (OXA) 유발 대장염 모델은 화학 알레르겐 및 hapten 제를 사용하여 Th2 매개 대장염을 유발하는 모델이다. 이 모델은 UC와 조직학적 특성과 염증 반응이 유사하여 UC의 발병 및 치료제 연구에 사용된다 [45].
2.4.8. 간장 질환 모델
간은 글리코겐 저장, 해독, 단백질 및 호르몬 합성 등 다양한 기능을 수행한다. 간장 질환은 바이러스 감염, 불균형한 식사, 중독, 자가면역질환 등으로 조직이 손상되어 발병한다.
비 알코올성 지방간 질환(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 모델은 알코올 과다 섭취와 무관하게 간에 지방이 과도하게 축적되는 간 질환 모델로, 인슐린 저항성과 기타 대사증후군 (2형 당뇨, 비만, 고혈압)과 관련이 있다 [46]. 항바이러스제, 코르티코스테로이드, 타목시펜 등의 약물이나 고농도의 과당 섭취에 의해 발생할 수 있다. DIO와 CCl4를 사용하여 유발할 수 있다.
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비 알코올성 지방 간염(Non-alcoholic steatohepatitis, NASH) 모델은 가장 심각한 NAFLD의 한 유형으로, 간의 염증과 섬유증, 지방간을 유발한다. 원인 불명 간 경변의 주요 원인이 된다. 비만, 대사증후군, 제2형 당뇨, 고콜레스테롤과 중성지방이 NASH의 위험성을 높인다. 사염화탄소(CCl4) 유발 간 손상 모델은 인간의 간질환과 유사하여 널리 사용되는 모델이다. CCl4는 세포 및 세포 소기관의 막 투과성을 변화시켜 급성 혹은 만성 간 손상을 유발하는 간 독성 물질이다. 단회 투여할 경우 지방 간염이 유발되고, 장기간 투여할 경우 간 섬유화, 간 경변 및 간암이 유발된다 [47].
B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)는 circular double-stranded DNA enveloped virus로 급성 혹은 만성 괴사성 간질환을 유발한다. 이 모델은 인간의 만성 HBV 감염과 유사한 특징을 보여 간 경변과 간암 연구, 치료제 평가에 사용된다. Woodchuck hepatitis virus (WHV)는 HBV와 매우 유사한 hepadnavirus로 동물 모델에서 급성 간염 및 만성 간염을 유발하며, 백신이나 항바이러스제 연구에 많이 사용된다.
2.4.9. 비뇨기계 질환 모델
사구체신염(Glomerulonephritis) 모델
GBM (Anti- Glomerular basement membrane) 신염 모델은 사구체 신염 중에서 가장 심각한 유형 중 하나로, IV형 collagen에 대한 항체가 신장의 GBM에 결합하여 염증을 유발하는
자가면역질환이다. 사구체 신염과, 혈뇨, 단백뇨가 특징이며, 가장 널리 연구된 신염 모델이다. 마우스에 토끼 IgG와 complete Freund’s adjuvant (CFA)를 복강으로 투여하여 감작시키고, 5일 후에 토끼 anti-GBM 혈청을 정맥으로 주사하면 2-3주 이내에 신염이 발병된다. 랫트는 Wistar Kyoto (WKY), 마우스는 BUB/BnJ, DBA/1J, 129/svJ가 감수성이 높다. 이 모델은 사구체신염의 발병 기전과 치료제 효능 평가에 사용된다 [48].
랫트 Thy-1 신염 모델은 Thy-1 항체를 포함하는 토끼 anti-thymocyte serum (ATS) 이나 마우스 anti-Thy 1 단클론 항체를 꼬리 정맥에 투여하여 유발시킨다. Thy-1 항체는 사구체 간질 세포(glomerular mesangial cells, GMC)에 존재하는 Thy-1 항원에 결합하여 면역반응을 일으킴으로써 신염이 유발된다. 이 모델은 사구체 간질 증식 사구체 신염(MsPGN) 모델로 신염 치료제의 효능 평가에 사용된다 [49].
급성 신부전(Acute kidney failure, ARF) 모델
Gentamicin 유발 급성 신부전 모델은 aminoglycoside 항생제인 Gentamicin을 7일 이상 처리하면 급성 신부전이 유도된다. 발병 기전은 명확하지 않으나, gentamicin이 세뇨관과 리소좀에 먼저 축적된 후 미토콘드리아 기능 억제, 라디칼 생성, 글루타티온 고갈과 항산화 방어기전 감소를 통해 유발된다. 혈중 요소 및 혈청 크레아티닌 증가, 세뇨관 괴사가 유발된다 [50]. Cisplatin 유발 급성 신부전 모델은 폐암 치료제인 cisplatin을 고농도(75 mg/m2)로 투여하여 세포 독성으로 신장을 손상시켜 신부전을 유발하는 모델이다 [51]. DNA 손상, 자유 라디칼 생성, 세뇨관 간질 염증 및 세포 사멸을 통해 신장 기능 손상 및 급성 신부전이 유발된다. 이 모델은 급성 신장 손상의 초기 병리 연구나 신장 보호제의 효능 평가에 사용된다.
인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 17 / 31 Glycerol 유발 급성 신부전 모델은 Glycerol (50%)을 8 ml/ kg 용량으로 랫트 뒷다리 근육에 투여하면 횡문근 융해로 미오글로빈, 독성 세포질 성분, 사이토카인이 전신 순환계로 방출된다. 미오글로빈은 세뇨관 신 독성을 유발하고 사이토카인은 신장에 작용하여 신부전을 유발한다. 이 모델은 인간의 횡문근 융해로 유발된 신부전과 유사하며, 화학치료제의 신독성으로부터 신장을 보호하는 약물의 스크리닝에 널리 사용된다 [52]. 신장 허혈 재관류(Ischemia-reperfusion, IR) 신부전 모델은 양쪽 혹은 한쪽 신장 동맥을 clamping 하여 허혈 상태를 만든 후 재관류하는 방식으로 급성 신장 손상을 유발하는 모델이다. 마취하여 개복한 후 체온을 유지하면서 신 동맥을 clamping하여 30-45분 동안 허혈 상태를 유지한 후 재관류하여 유발한다. 유발 재현성이 높아 발병 및 치료 기전 연구에 사용된다 [53].
만성 신장질환(Chronic kidney disease, CKD) 모델
만성 신장질환은 수개월 또는 수년에 걸쳐 신장기능이 상실되는 질환이다.
Unilateral ureter obstruction (UUO) 모델은 신장 섬유증이 유발되는 가장 널리 사용되는 만성 신장질환 모델이다 [48]. 이 모델은 설치류에서 쉽게 유발되고 재현성이 좋아 세뇨관 간질의 기전 연구에 널리 사용된다. 부분 및 가역적 UUO 모델은 신생아 쥐와 랫트의 신장을 폐쇄한 며칠 후에 폐쇄를 완화시키는 모델이다. 이 모델은 인간의 UUO와 많은 부분에서 유사하고, 발병이 느려 신장 섬유증 기전 연구나 치료제 연구에 사용된다. 5/6 신장 절제(Nephrectomy) 모델은 랫트를 사용하여 한쪽 신장을 절제하여 제거하고 1-2주 후에 나머지 신장의 약 50%를 제거하여 신부전을 유발하는 모델이다 [54]. 다른 방법으로는 한쪽 신장을 절제하여 제거하고 나머지 신장 동맥을 결찰하는 방법으로도 유발이 가능하다. 결찰법은 랫트를 사용하고, 절제법은 마우스와 랫트 모두 가능하다. 마우스는 129/Sv, Swiss-Webster가 주로 사용된다. 이 모델은 신부전, 고혈압, 신장 기능 손상 상태의 약물 대사 연구에 사용된다.
Adriamycin 유발 신증 모델은 세포독성 항암제인 Adriamycin (Doxorubicin)을 신장 손상 유도제로 사용하여 신부전을 유발하는 모델이다 [55]. 사구체 손상, 단백뇨, 신장 섬유증, 염증 세포 침윤이 유발된다. 인간의 국소 신증후군 및 사구체 경화증과 유사하여 신부전 치료 약물 스크리닝에 사용된다.
방광염(Cystitis) 모델
Cyclophosphamide (CYP) 유발 방광염 모델은 CYP를 방광 내에 점적하여 방광염을 유도하는 모델이다. CYP는 간에서 대사되어 세포독성 물질인 acrolein을 형성하여 방광염을 유발한다. 이 모델은 방광염으로 인한 통증과 염증 기전, 치료제 발굴에 사용된다 [56, 57]. Lipopolysaccharides (LPS) 유발 방광염 모델은 LPS를 복강이나 방광 내에 점적하여 방광 염증을 유발하는 모델이다. 마우스는 LPS를 방광 내에 점적하여 유발할 수 있으며, 랫트는 protamine sulfate로 점막 투과성을 변경시킨 후 LPS를 방광 내 주입하여 유발한다. 이 모델은 인간의 간질성 방광염과 병리학적 증상이 유사하여 방광염 비임상 연구에 사용된다 [58].
인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 18 / 31 2.4.10. 근골격계 질환 모델
골관절염 모델은 화학적, 수술적 방법으로 제작할 수 있다. Monosodium Iodoacetate (MIA)-유발 골관절염 모델은 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 저해제인 MIA를 관절 내에 투여하여 chondrocyte 사멸과 proteoglycan 손실을 통해 연골을 손상시켜 골관절염을 유발하는 모델이다 [59]. 자연적인 골관절염 진행과는 차이가 있지만, 인간의 골관절염과 유사한 관절 손상을 보여 관절염 통증 기전이나 치료제 효능 평가 모델로 적합하다. 외과적 수술을 통한 골관절염 모델은 관절을 역학적으로 불안정화시켜 연골을 손상시키고 염증을 유발하는 모델로, 수술이 용이한 랫트를 주로 사용한다. 화학적인 방법에 비해 유발 기전이 인간의 골관절염 진행과 보다 유사하다. 전방 십자 인대 절개(Anterior cruciate ligament transection, ACLT) 모델은 관절낭을 열어 ACL을 절개하는 방법으로 관절을 불안정화시켜 시간이 지남에 따라 관절이 손상되어 골관절염이 유발되는 모델이다. 내측 반월판(Medial meniscal tear, MMT) 모델은 무릎 내측 측부의 인대를 절개하여 골관절염을 유도하는 모델이다. 이 모델은 수술 후 7-14일 이내에 관절 불안정과 연골 손상, 연골 proteoglycan 감소, 기질 손실이 유발된다. 인간의 관절염과 유사하여 치료제 평가 모델로 적합하다. 골다공증은 뼈 질량 감소와 뼈 조직 악화로 뼈가 약해져 골절에 취약하게 되는 질병이다. 골다공증 모델은 수술적 방법으로 제작이 가능하다. 정소 적출(Orchiectomy) 골다공증 모델은 수컷의 정소를 수술로 적출하여 골다공증을 유발하는 모델이다. 성선 기능이 저하된 안드로겐 결핍 남성 골다공증을 모방한 모델로 대퇴골 및 요추 골밀도 감소를 보이며, 뼈 손실 속도는 느리다. 골다공증 치료제 효능 평가에 사용된다. 난소 절제(Ovariectomy, OVX) 골다공증 모델은 암컷의 난소를 수술로 적출하여 골다공증을 유발하는 모델이다. 난소 절제 후 약 3개월 후 대퇴골 및 요추 골밀도가 감소하여 골다공증이 유발된다. 이 모델은 폐경기 후 에스트로겐 감소로 인한 여성 골다공증과 매우 유사하며, FDA 승인 골다공증 비임상 모델로 골 손실 예방 및 치료제의 효능 평가에 사용된다. 뼈 치유 모델은 골절 혹은 뼈 결함을 유도하여 뼈 치유에 미칠 수 있는 의약품의 효능과 안전성을 평가하기 위한 모델로 사용된다. 폐쇄 골절 모델은 마취한 동물의 다리뼈에 핀을 삽입하여 고정한 후 다리뼈 중간 지점에 외부 충격을 가하여 단순 횡단 골절을 유도하는 모델이다. 이 모델은 낙상이나 외상성 골절 후 고정 방법과 유사하여 뼈 치유력이나 연골 내 뼈 형성 연구에 사용된다. 임계 크기 결함(Critical size-defect, CSD) 모델은 일생 동안 자연적으로는 치유되지 않는 최소 크기의 결함을 유도한 모델이다. 골절 치유 경로나 골절 치료 강화 연구에 사용되며, 두개골, 대퇴골, 악안면 골 결손 모델이 있다. 2.4.11. 신경계 질환 모델 신경계질환은 뇌, 척수 및 신경의 손상으로 삼키기, 말하기, 호흡, 학습, 운동 기능에 장애를 일으키는 질환이다.
파킨슨병 모델(Parkinson’s disease model)은 떨림과 강직, 보행 장애를 유발하는 신경 퇴행성 질환이다 [60]. 6-OHDA, MPTP를 사용하여 유발할 수 있다. 중뇌 동맥 폐색 모델(Middle cerebral
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occlusion (MCAO) model)은 뇌 동맥을 폐색시켜 유발하는 국소 뇌 허혈 표준 동물 모델로, 대측 안면과 팔의 감각 상실, 마비 및 약화, 실어증 등이 특징이다. 척수 손상 모델(Spinal cord injury (SCI) model)은 척수 손상을 통해 일시적 혹은 영구적 기능 장애를 유발한 모델이다. 압착, 타박, 절개와 같은 물리적인 방법이나 화학적인 방법으로 유발이 가능하다. 뇌경색 모델(Cerebral infarction model)은 미세신경외과수술(microneurosurgery)로 뇌에 혈액과 산소를 공급하는 동맥을 좁게 만들거나, 막히도록 하여 뇌 조직 일부에 괴사를 유발하는 모델이다. 뇌졸중 모델(Cerebral stroke model)은 미세신경외과수술로 뇌에 공급되는 혈류량을 줄여 뇌 조직의 세포 사멸을 유도함으로써 뇌 기능 일부를 손상시킨 모델이다. 2.4.12. 감염 질환 모델 감염 질환은 세균, 바이러스와 같은 감염원에 노출된 후 면역시스템에 의해 효과적으로 제거되지 않을 경우 발병한다. 감염 질환은 감염원에 따라 감염 경로와 발병 기전이 다르다. 인간의 감염 질환을 동물 모델에 적용하기 위해서는, 첫째, 동일한 감염 경로가 존재하고, 재감염이 가능해야 하며, 둘째, 면역시스템에 의한 반응과 그에 따른 증상도 유사해야 한다. 감염 질환 동물 모델은 두 가지 조건을 만족하는 감수성 동물 종이나, 인간의 감염 경로를 유전적으로 조작한 동물을 사용하여 모델로 사용할 수 있다. 표 2. 감염 질환 동물 모델.
Infectious Disease Sensitive/Commonly Used Resistant
Tuberculosis DBA2, C3H BALB/c, C57BL/6
Salmonella BALB/c, C57BL/6, C3H
DBA2 (weak) 129S6, B6129F1, A/J
Lyme Borreliosis SJL, C3H, C57BL/6
Anthrax DBA2, C3H most susceptible; BALB/c, C57BL/6 somewhat
susceptible CBA, DBA2, FVB
Influenza BALB/c, C57BL/6 (requires adaptation of virus to the mouse); DBA2 is highly sensitive and does not require adaptation
Zika virus SJL C57BL/6
HIV Humanized PBL SCID mouse,
Humanized BLT SCID mouse Normal mouse
MERS Rhesus Macaque (NHP)
SARS-CoV-2 Cats, Ferrets
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감수성 감염질환 모델은 감염원에 감수성인 동물 종을 사용하는 모델이다. 낙타를 통해 전파되는 것으로 알려진 MERS Coronavirus는 비인간 영장류인 Rhesus Macaques 원숭이가 감수성이며, 감염 및 항바이러스제 평가에 사용할 수 있다 [61]. 최근 전 세계적인 팬데믹으로 주목받고 있는 SARS-CoV-2의 경우 고양이와 족제비과 동물이 감염과 전파가 가능한 모델로 보고되었다 [62, 63]. 인간화 마우스 감염질환 모델은 감염이 인간에게 특이적인 경우에 면역결핍 마우스에 인간의 시스템을 도입하여 감염 평가가 가능하게 만든 모델이다. 예를 들면, HIV는 인간의 helper T (CD4+) 세포 특이적으로 감염된다. 면역결핍 마우스에 인간의 면역 시스템(helper T 세포 포함)을 도입한 인간화 마우스 모델을 사용하여 HIV 감염 및 치료제 평가가 가능하다 [64]. SARS-CoV-2의 경우 감염 경로인 인간의 ACE2 형질전환 마우스를 사용하여 항바이러스 치료제나 백신 연구에 사용할 수 있다 [65]. 2.4.13. 인간화(Humanized) 마우스 모델 최근, 항암제 개발은 항체, CAR-T/ -NK, 면역 관문 억제제와 같은 면역 치료제의 비중이 커지고 있다. 면역 치료제는 면역 시스템에 직접 작용하거나 상호작용을 통해 효능을 나타내며, “Cytokine storm”과 같은 과도한 면역 부작용을 일으키기도 한다. 이종 이식 모델은 면역 결핍 마우스를 사용하여 인간의 암세포 이식과 암세포에 직접 작용하는 항암제의 효능 평가를 가능하게 하였다. 그러나, 면역 치료제의 효능과 독성을 평가를 위해서는 인간의 면역 시스템이 필요하다. 인간화 마우스 모델은 마우스에 인간 시스템의 일부를 도입하여 인간의 질병이나 약물의 평가를 가능하게 만든 모델이다. 면역 치료제 평가를 위한 인간화 마우스 모델은 면역 결핍 마우스에 인간의 면역세포를 이식하여 면역 시스템을 재구성한 것이다. 실험 동물에서 인간의 면역 시스템을 보완하기 위해 성장 인자와 cytokine을 도입한 인간화 마우스 모델이 개발되고 있다.
Humanized PBL SCID 마우스 모델은 B, T 세포가 존재하지 않아 adaptive immune system이 결여된 severe combined immunodeficiency (SCID) 마우스에 인간의 peripheral blood lymphocyte (PBL)를 이식하여 보완한 동물 모델이다. 인간의 B, T 세포와의 상호작용을 확인할 수 있다 [66].
Humanized SRC SCID 마우스 모델은 SCID 마우스에 인간의 hematopoietic stem cell (HSC)을 이식하여 인간의 면역 세포를 재구성(SCID-repopulating cell, SRC)한 모델이다 [67]. 인간의 B, T 세포와 APCs, myeloid cells, NK 세포를 포함하는 인간 면역 시스템이 보완된 모델이다. 다만, 인간의 T 세포가 조직에서는 거의 발견되지 않아 관련 면역 반응을 확인하는 데는 한계가 있다.
Humanized BLT SCID 마우스 모델은 SCID 마우스에 인간 태아의 간(liver)과 흉선(thymus) 조직 단편을 마우스의 신장 캡슐 하에 이식한 후, HSC를 정맥으로 이식한 모델이다 [67]. 인간의 HSC를 이식하는 경우 골수 유래 면역세포의 발달에는 문제가 없으나, 흉선에서 발달하는 T 세포의 재구성에는 한계가 있다. 이를 보완하기 위해 인간의 태아 간과 흉선 조직을 이식하여 T 세포 발달을 가능하게 한 모델이다. 현재까지는 가장 완전한 인간의 면역 시스템을 구성하는 동물 모델이다. 이 모델은 HLA 특이적인 T 세포와 점막 면역계를 포함하고 있어 감염 질환과 종양의 면역 시스템이나 치료제 연구에 활용될 수 있다.
인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 21 / 31 표 3. 인간화 마우스 모델. Mice Deficiency (Genetic) Dysfunction (Phenotypic) Modification (Human) Characteristics (Human) Nude Foxn1nu T cells, Thymus,
Hair None No human immune cells
NOD Idd3 (IL-2)
CTLA-4 T cells, NK cells None No human immune cells
SCID PRKDC T cells, B cells None No human immune cells
IL-2R-/- IL-2R T cells (XSCID) None No human immune cells
Rag2-/- Rag2 T cells, B cells None No human immune cells
PBL
SCID PRKDC T cells, B cells
Transplantation
Human peripheral blood lymphocytes ( PBL)
Human DCs, B cells, T cells
SRC
SCID PRKDC T cells, B cells
Transplantation
Human hematopoietic stem cell s (HSCs)
Human APCs, B cells, NK cells, Myeloid cells, T cells (No T cells in tissues)
BLT
SCID PRKDC T cells, B cells
Transplantation
Human HSCs, fetal liver & thymus fragments
SRC SCID features HLA specific T cells Mucosal immune systems NOG NOD/SCID IL-2R T cells, B cells, NK cells M, DCs, Complement hIL-2+HSC hIL-6+HSC hGM-CSF/hIL-3 hPBMC
Human T cells, NK cells Human monocytes (M) Myeloid, HSC engraftment T cells (effector/memory) NSG NOD/SCID IL-2R T cells, B cells, NK cells M, DCs, Complement hIL-7/hIL-15+HSC hMHC-I/II Human NK cells Human MHC –I/II BRG IL-2R Rag2
T cells, B cells, NK cells DCs hIL-3/hTPO/hGM-CSF/ hM-CSF+hPB/BM/CB Human CD45+, myeloid cells, monocytes Normal Immune checkpoints Knock-In immune checkpoints Knock-In
Human PD-1, PD-L1, CTLA4, etc.)
Human immune checkpoints
(PD-1, PD-L1, CTLA4, etc.)
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Humanized Immune Checkpoint Knock-In 마우스 모델은 정상 마우스에 인간의 면역 관문(Immune checkpoint) 유전자를 녹인(KI) 혹은 형질전환(Tg) 형태로 도입한 모델이다. 면역 관문 단백질은 면역 세포의 표면에서 발현되어 면역 세포와 주변 세포들과의 상호작용을 통해 면역 세포의 활성을 정교하게 조절한다. 암세포는 CD8+ T 세포의 공격을 회피하기 위해 면역 관문 억제 단백질을 발현한다 [68]. 암세포가 발현하는 PD-L1은 T 세포의 PD1과 결합하여 활성을 억제한다 [69]. 최근 항암 면역을 활성화하기 위해 면역 관문 단백질(PD-1, PD-L1, CTLA4)을 표적으로 하는 면역 치료제가 출시되었다. 인간의 면역 관문을 표적으로 하는 의약품의 평가 모델에 대한 수요가 증가하면서 인간의 면역 관문 단백질을 도입한 인간화 마우스 모델들이 개발되었다. 예를 들어, 인간의 PD-L1, CTLA-4 Knock-in 마우스 모델은 이를 표적으로 하는 단클론 항체 치료제의 단독 혹은 병용 요법에 의한 항암 효능이나 면역 활성 평가에 사용된다. 그림 5. 면역 관문 단백질(좌) 및 FDA 승인 저해제(우). 2.4.14. 미래의 인간 질병 모델 고도화된 인간화(Humanized) 동물 모델 이종인 인간의 세포를 도입하기 위해 만든 면역결핍 마우스 모델은 줄기세포의 배양 및 분화 기술의 발달로 인간의 면역시스템을 재구성하는 것이 가능하게 되었다. BLT 인간화 마우스 모델은 태아 조직을 사용하여 T 세포 발달 문제를 어느 정도 해결할 수 있었다. 하지만, ‘이러한 동물 모델을 제작하기 위해 태아 조직을 지속적으로 이용 가능한가’라는 질문에는 부정적이다. HLA type이 일치하고 자가 항원에 대한 면역 관용을 획득한 T 세포를 가진 인간화 동물 모델을 안정적으로 확보하기 위해서는 아직도 해결해야 할 숙제가 많다.
인간의 질병을 가진 동물 모델 이제욱 Page 23 / 31 보다 효율적인 줄기세포 배양 및 분화 기술이 개발되고 있고, 보다 정교한 nuclease 기반의 유전자 조작 기술도 발전을 거듭하고 있다. 이러한 기술 발전을 바탕으로 가까운 미래에 우리가 원하는 상당 부분을 인간의 것으로 교체한 인간화 동물 모델을 이용할 수 있게 될 것이다. 인간의 면역 시스템, 면역 시스템의 발달을 지원하는 조직과 cytokines, 약물의 표적, 약물이 상호 작용하는 시스템들이 그 대상이 될 것이다. 동물 모델을 대체할 인공 장기 평가 모델 동물 모델, 그 중에서도 유전적으로 가장 가까운 영장류조차도 인간과는 분명한 차이가 있다. 동물 모델을 아무리 인간화한다고 해도 모든 시스템을 인간의 것으로 대체하는 것은 불가능하다. 실험 동물의 인간화 수준을 높이는 것보다 인공 조직으로 구성된 새로운 대체 시험계를 개발하는 것이 보다 빠른 방법이 될 수 있을 것이다. 최근 배아, 중간엽, 역분화 줄기세포의 배양 및 분화 기술이 급속도로 발달하면서 환자의 특성을 가진 세포를 보다 손쉽게 이용할 수 있게 되었다. 3D 프린팅 및 배양 기술을 접목한 오가노이드(Organoid) 제작 기술은 2D 배양 시스템에 비해 훨씬 정교하게 인간의 조직과 장기를 모방할 수 있게 하였다. 인간의 순환계를 모방한 미니 장기 칩은 동물 모델 사용의 필요성을 감소시킬 것이다 [70]. 오가노이드 평가 시스템은 인간의 생리적 특성을 잘 나타내고 유전자 조작도 가능하여 PDX 모델을 대체할 수 있는 차세대 평가 기술이 될 수 있을 것이다. 단순히 동물 윤리 차원이 아니라, 인간의 신체를 좀 더 가깝게 모방할 수 있는 대체 기술로써 오가노이드 평가 시스템에 대한 관심이 증가하고 있다. BT-IT 기술이 결합된 인공 장기 제작 및 배양 기술은, 인체 시스템을 보다 가깝게 모방하여 환자 맞춤형 정밀 의료를 가능하게 할 것이다. ‘인공 장기 제작 기술의 발달로 면역 거부반응 문제가 해결된다면, 문제가 발생한 장기를 기계 부품처럼 교체하는 시대가 도래하지 않을까?’ 2005년에 개봉된 영화 “아일랜드”에는 대체 장기를 사용할 목적으로 만든 복제 인간이 등장한다. 예술가들의 상상력이 과학자들보다 수십 년은 앞서 왔음을 생각하면, 인공 장기 시대의 도래도 머지않았다. 그림 6. 인간 오가노이드 미니 장기 전자 칩 모식도 [71].
