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의학 박사학위 논문
토끼 실험 모델에서 심낭 유착
방지에 대한 장벽 물질의 효과
아 주 대 학 교 대 학 원
의학과/의학전공
홍 준 화
토끼 실험 모델에서 심낭 유착
방지에 대한 장벽 물질의 효과
지도교수 이 철 주
이 논문을 의학 박사학위 논문으로 제출함.
2011 년 8 월
아 주 대 학 교 대 학 원
의학과/의학전공
홍 준 화
홍준화의 의학 박사학위 논문을 인준함.
심사위원장 김 영 수 인
심 사 위 원 탁 승 제 인
심 사 위 원 김 세 중 인
심 사 위 원 강 현 인
심 사 위 원 이 철 주 인
아 주 대 학 교 대 학 원
2011 년 6 월 23 일
i - 국문 요약 -
토끼 실험 모델에서 심낭 유착 방지에 대한
장벽 물질의 효과
목적: 이 연구의 목적은 hyaluronic acid 의 유도체로 액체의 점성을 지니는 가딕스-SL 과 최근 개발된 열 감응성 액체/겔 물질인 가딕스-SG 의 효능과 안전성을 토끼 심낭 유착모델을 이용하여 비교 분석하는 데에 있다. 방법: 총 60마리의 토끼를 외심막에 찰과상을 유발한 후에 적용시킨 물질의 종류에 따라 세 군으로 나누었다. CO군은 대조군으로 생리 식염수가 도포되었다. SL군은 가딕스-SL이, SG군은 가딕스-SG가 도포되었다. 수술 직후 그리고 수술 2주 후에 심장초음파로 좌심실박출계수, 그리고 심낭삼출의 유무를 관찰하였다. 수술 2주 후에 심낭의 육안적, 그리고 현미경적 유착을 평가 하였다. 결과: SG군 20마리의 토끼 중 10마리의 토끼에서 수술 직후 경도의 심낭 삼출이 발견되었으며 통계학적으로 유의하지 않은 좌심실 박출계수의 감소가 발견되었다. CO군이 SL, SG군에 비해서 현격히 높은 육안적/현미경적 유착 점수를 보였다 (p < 0.001). 또, SL군의 유착 점수가 SG군의 유착 점수에 비해 유의하게 높았다 (p = 0.045). 염증점수와 항대식세포항체 표현정도는 CO군에서 높았으나 통계학적 유의성은 없었다. 결론: 가딕스-SL과 가딕스-SG는 유착을 방지하는데 효과적이었으며 이중 가딕스-SG의 유착방지 효과가 가딕스-SL보다 높았다. 비록 통계학적 의미는ii 없었으나 심낭내의 가딕스-SG는 좌심실 박출계수를 저하시켰다. 앞으로 심장의 운동저하를 유발하지 않으면서 유착방지효과를 극대화 할 수 있는 적절한 용량을 결정하기 위한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다. 핵심어: hyaluronan 용액; poloxamer 용액/겔; 심낭 유착
iii
차
례
국문요약 ... ⅰ 차례 ... ⅱ 그림 차례 ... ⅲ 표 차례 ... ⅳ Ⅰ. 서론 ... 1 Ⅱ. 대상 및 방법 ... 4 A. 실험 동물 ... 4 B. 연구 방법 ... 4 1. 수술 방법 ... 4 2. 심장 초음파 ... 6 3. 육안적 검사 ... 6 4. 조직학적 검사 ... 7 5. 통계분석 ... 8 Ⅲ. 결과 ... 17 A. 심장 초음파 결과 ... 17 B. 육안적 검사 ... 17 C. 조직학적 검사 ... 20 D. 연관성 ... 20 Ⅳ. 고찰 ... 26 Ⅴ. 결론 ... 32 참고문헌 ... 33 ABSTRACT ... 40iv
그림 차례
Fig. 1. Histological examination of inflammation and fibrosis ... 9
Fig. 2. Echocardiogram comparison in group SG ... 13
Fig. 3. Ejection fraction change in group SG ... 15
Fig. 4. Macroscopic adhesion score in all groups ... 19
Fig. 5. The most severe adhesion in each group ... 21
Fig. 6. Fibrosis and inflammation score in all groups ... 24
v
표 차례
Table 1. Adhesion Score System for Macroscopic Evaluation ... 6
Table 2. Microscopic Adhesion Score System ... 8
Table 3. Transthoracic Echocardiographic Evaluation ... 16
1
I.
서 론
심장 수술과 관련된 여러 요소의 발전으로 심장수술을 시행 받은 환자들의 예후가 개선되어 수술 후 생존기간이 길어 지면서 심장수술 후 다시 심장수술을 시행 받는 소위 심장 재수술의 빈도가 점차 증가하고 있다. 그런데, 심장 재수술을 할 때 생명유지에 중요한 해부학적 구조인 대혈관, 관상동맥 우회로 이식편, 그리고 심장 자체 등에 손상이 발생하여 심각한 출혈을 야기할 수 있기 때문(Dobell 등, 1984; schaff 등, 1983)에 많은 위험부담을 수반한다고 하겠다. 비록 심장 재수술에 따른 위험성이 근래 수 십 년간 많은 발전과 더불어 줄었다(Luciani 등, 2006; Sabik 등, 2005; O’Brien 등, 2001)고는 하나 심장 재수술은 아직도 기술적으로도 어려울 뿐 아니라 시간도 많이 소모되는 수술임에 틀림없다. 위에 언급한 높은 위험부담과 기술적인 어려움은 주로 이전 수술 후에 발생한 흉골, 심낭과 같은 심장 주위 조직과 심장의 유착에 의한 것이다. 이러한 심장 재수술의 유착에 따른 문제는 반복적인 흉골 절개를 통한 단계적 수술을 몇 차례 시행 받아야 완치가 되는 선천성 심장질환에만 적용되는 것은 아니다. 비록, 그 숫자는 선천성 심장질환에 비해 상대적으로 작을 지라도 최근 심장 재수술을 받는 성인 환자가 점차 늘고 있으며 이들에게도 유착으로 인한 위험성은 간과할 수 없는 문제라 할 수 있다. 유착에 따른 문제를 해결하기 위하여 유착 형성을 방지하는 물질을 개발하려는 많은 노력들이 다양한 신체 부위에 적용되도록 진행되어 왔다(Duncan 등, 1988; Becker 등, 1996; Ghellai 등, 2000; Yaacobi 등, 1993; Seifer 등, 1990; Laks 등, 1981; Meus 등, 1983; Revuelta 등, 1985;2
Heydorn 등, 1987; Wiseman 등, 1992; Mitchell 등, 1994). 그러나, 최근까지 개발된 물질들은 다른 신체부위의 유착 방지에는 크고 작은 효과를 보여 왔으나 심낭 유착 방지를 위한 이상적인 물질과는 거리가 있다고 하겠다(Naito 등, 2008). 최근 십여 년 사이에 InterceedTM (oxidized regenerated cellulose), PRECLUDE Peritoneal MembraneTM (expanded polytetra-fluoroethylene), SurgiWrapTM (polylactic acid film)과 SeprafilmTM (sodium hyaluronate and carboxymethylcellulose membrane) 등의 막형 장벽(film type barrier)물질이 개발, 시판되어 이용 가능해 졌다(Becker 등, 1996; Ghellai 등, 2000; Park 등, 2009). 그러나, 위에 나열된 물질들 대부분은 복부 수술 후 유착 방지에 대한 연구가 주로 진행되고 사용되어 왔으며 그 결과 역시 기대에 못 미쳤다(Fazio 등, 2006; Hayashi 등, 2008; Tingstedt 등, 2007). 더욱이, 막형 장벽물질은 조직에 너무 쉽게 들러붙거나, 또는 반대로 너무 쉽게 이동하여 원하는 위치를 벗어나기도 한다. 따라서, 비교적 움직임이 적은 복강내의 해부학적 구조와는 달리 심장과 같은 삼차원적인 입체 구조, 지속적으로 움직이는 해부학적 구조에 발생하는 유착을 방지하는 목적으로 사용하기에는 기술적으로 불편한 점이 적지 않아 그 사용에 제한점이 있다. 이러한 점에 있어서, 유착 방지를 위한 용액형 장벽물질(solution type barrier)은 막형 장벽물질에 비해 심낭 유착 방지에 사용하기에 이점이 있다고 할 수 있다.
가딕스-SL (Guardix-SLTM, Biorane, Seoul, Korea)은 sodium hyaluronate 와 sodium carboxymethylcellulose (HA CMC)의 복합 물질로 용액형 장벽물질이며 다양한 신체 부위의 수술 후 유착을 현격히 줄이는 것으로 보고되어 왔다(Becker 등, 1996; Ghellai 등, 2000; Park 등, 2009; Kim 등, 2007; Moll 등, 1992; Seeger 등, 1997). 가딕스-SG (Guardix-SGTM, Biorane, Seoul, Korea)는 열 감응성 poloxamer/Alginate/CaCl2 혼합물로 역시
3 유착을 방지하는 장벽물질로 개발되었다. 이 물질은 노출 온도에 따라 그 점도가 변하는데 실온에서는 용액과 같은 낮은 점도(21℃에서 약 3000 cP)를 갖는 반면 체온에 가까운 온도에서는 겔과 같은 높은 점도(37 ℃ 에서 90,000-95,000 cP)를 갖는 특성이 있다(Kwon 등, 2006). 이 연구의 목적은 hyaluronic acid 의 유도체로 액체의 점성을 지니는 가딕스-SL 과 최근 개발된 열 감응성 액체/겔 물질인 가딕스-SG 의 효능과 안전성을 토끼 심낭 유착모델을 이용하여 비교 분석하는 데에 있다.
4
II.
대상 및 방법
A.
실험 동물
이 연구는 중앙대학교병원 동물실험 위원회의 심의를 거쳐 중앙대학교 병원 동물 실험실에서 시행되었다. 이 연구에서 동물을 다루는 모든 행위는 미국 국립 보건원의 실험동물 처치 및 사용에 관한 지침 (National Institute of Health’s guide for the care and use of laboratory animals)에 따라 시행 되었다. 총 60 마리의 체중 2.5-3.0 Kg 의 뉴질랜드 흰 토끼 (Dayoon, Seoul, Korea)를 실험동물로 사용하였다. 모든 토끼는 온도가 일정하게 유지(22°C) 되는 실내 사육장에서 한 우리당 두 마리씩 사육되었다. 토끼에게는 일반 실험실 사료와 수돗물이 공급되었고, 12 시간 점등, 12 시간 소등 주기가 유지되는 환경에서 사육되었다.B.
연구 방법
1.
수술 방법
모든 수술적 처치는 같은 수술 팀에 의하여 무균요법 하에 실시되었다. 토끼에게 체중당 25 mg 의 케타민(Ketamine HclTM, Huons, Seoul, Korea)을 근육주사 하여 진정상태를 유도하였다. 적절한 진정상태가 유도되었다고 판단되었을 때 말초 정맥을 확보하였다. 확보된 정맥을 통하여 체중당 30 mg 의 예방적 항생제(Cefazolin, Chong Kun Dang pharmaceutical corp., Seoul, Korea)를 주사하였다. 이후 기관삽관을 시행하였고, 이를 통하여 1-2 vol%의 isoflurane 을 기계호흡시켜 전신마취를 수술하는 동안 유지하였다.5 아이오다인 용액으로 소독하였다. 모든 동물에 있어서 4-5 번째 늑간을 통해 수술을 진행하였다. 피부절개와 늑간근육 절개, 흉막 절개를 통해 심낭을 노출하였다. 노출된 심낭에 약 3 cm 의 종절개를 가해 좌실심을 노출하였다. 노출된 좌심실의 외심막 표면에 3 분간 거즈를 이용하여 문질러(Naito 등, 2008) 약 1.5 x 1.5 cm2 크기의 찰과상을 유발하였다. 찰과상을 유발한 후 찰과상 부위에 주사기를 사용하여 세 종류의 물질을 도포하였다. 도포된 물질의 종류에 따라 토끼는 세 그룹으로 나뉘었다. CO 군은 대조군으로 체중(Kg)당 1.0 ml 의 생리 식염수가 도포되었다. SL 군은 가딕스-SL 이 사용된 군으로 체중(Kg)당 1.0 ml 의 가딕스-SL 이, SG 군은 가딕스-SG 이 사용된 군으로 체중(Kg)당 1.0 ml 의 가딕스-SG 가 도포되었다. 각 군의 토끼 수는 20 마리였다. 각각의 토끼에 물질이 주입, 도포된 후에 절개된 심낭을 5-0 Prolone 봉합사를 사용하여 두 바늘 꿰매었다. 이 봉합사는 2 주 후 재수술 시에 찰과상을 유발한 부위를 나타내는 표지로도 사용되었다. 10 Fr 의 흉관을 개흉을 통해 절개된 늑골 사이에 위치 시키고 수술 상처를 층층이 봉합하였다. 삽입된 흉관을 흡입기에 연결한 상태에서 앰부백(Ambu bag)을 사용하여 기도와 폐에 양압을 가하는 방법으로 흉강의 공기를 배액한 다음 공기가 삽입되지 않도록 주의하여 흉관을 제거하였다. 이후 면밀히 관찰하여, 자가 호흡이 돌아오는 것이 확인되었을 때 기관삽관을 제거하였다. 수술 후 실험 토끼는 전술한 방법과 환경에서 2 주간 사육되었다. 유착이 가장 심한 것으로 알려진(Connors 등, 2007) 2 주 후 유착의 평가를 위한 두 번째 수술을 시행하였는데, 두 번째 수술은 임상에서 흔히 사용되는 심장수술과 같은 접근으로 수술하며 육안적으로 유착을 평가하고, 그 후 조직을 얻어 현미경적으로 유착을 평가하기 위한 수술로 토끼는 치사량의 케타민으로
6
Table 1. Adhesion score system for macroscopic evaluation.
Score Description
0 No adhesion
1 Mild adhesion, easy to dissect manually
2 Moderate adhesion, cohesive and can be dissected manually 3 Severe adhesion, cohesive and sharp dissection required 4
Very severe adhesion, cohesive adhesion requiring aggressive dissection that damages adherent tissue
희생시켰다. 심장은 정중흉골절개를 통해 노출되었으며 심낭과 심장 사이의 유착을 육안으로 평가하여 점수를 매겼다. 심장과 심낭은 일괄절제(En bloc resection)하여 조직검사를 하였다.
2.
심장 초음파 검사
모든 토끼의 경흉부 심장 초음파 검사가 수술 전, 수술 20 분 후 숙련된 초음파 기사에 의해 시행되었다. 또, 수술 2 주 후, 심장이 적출되기 직전에, 생존한 모든 토끼의 경흉부 초음파 검사가 같은 초음파 기사에 의해 다시 시행되었다. 모든 초음파 결과는 한 명의 순환기 내과 의사에 의해 다시 검토 되었다. 좌심실 박출계수를 M 모드로 측정하여 기록하였으며, 심낭 삼출의 발생 여부와 양도 기록하였다.3.
육안적 검사
이 실험의 설계에 대해 인지하고 있지 않은 두 명의 흉부외과 의사가 모든7 토끼의 유착 점수를 개별적으로 채점하였고, 각각의 토끼에 대해 유착 점수를 합의하여 도출해 내었다. 유착의 정도를 결정하기 위한 유착도 점수 시스템은 Table 1 에 나타낸 바와 같다.
4.
조직학적 검사
육안적 검사가 시행된 후에 5-0 prolene 으로 표시된 찰과상이 유발된 부위의 심낭과 심장 조직을 위주로 조직절편을 만들어 10% 중성 완충 포르말린에 24 시간 동안 고정하고 H-E 염색을 시행하였다. 면역조직화학 분석은 자동 면역염색 기기(Autostainer 480, Labvision, Fremont, CA, USA)를 사용하여 시행 하였다. 5 μm 두께의 조직을 10mM 의 구연산 완충제 (pH 6.0)에 넣고 20 분간 수조에서 가열하여 항원 노출(antigen retrieval)을유도하였다. 조직절편은 60 분간 토끼 대식세포에 대한 단일클론
항체(clone:3H2617, dilution 1:100, Santa Cruz biotechnology Inc., CA, USA)에 배양하였다. 항체결합은 HRP polymer conjugate (TL-125-HL kit, Labvision, Fremont, CA, USA)를 사용해 검출하였고 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) chromogen 으로 시각화 하였다. 조직절편은 Gill’s hematoxylin solution 으로 대비염색하였고 aqueous mounting medi 에
장착하였다. 섬유화와 염증 점수를 평가하기 위해 반정성적 점수
시스템(semi-quantitative scoring system)을 사용하였고 이는 Fig. 1 에 나타내었다. 섬유화 점수와 염증 점수 시스템은 Table 2 에 나타내었다. 면역염색에 양성을 보인 세포의 숫자는 200 배 현미경하에서 3 번 검토되었고 그 수들의 평균을 내어 값으로 삼았다.
8
Table 2. Microscopic adhesion score system.
Score Fibrosis grade Inflammation grade
0 None None
1 Minimal, loose Giant cells, lymphocytes, plasma cells 2 Moderate Giant cells, eosinophils, neutrophils 3 Florid dense Many inflammatory cells, microabscess
5.
통계 분석
자료의 표시는 평균값과 표준편차로 나타내었다. 얻어진 자료의 정상분포는 Shapiro-Wilk test 로 검사하였다. 정상분포를 보이는 자료는 parametric test 로, 비정상분포를 보이는 자료는 nonparametric test 로 분석하였다.
수술 전, 그리고 수술 2 주 후 좌심실 박출계수는 analysis of variance (ANOVA) with Tukey post test 로 평가하였다. 수술 후 좌심실 박출계수, 육안적 유착 점수, 섬유화와 염증 점수, 그리고 항대식세포항체 표현 정도는 다성비교를 위해 Kruskal-Wallis and Bonferroni post test 로 교정하였다.
육안적 유착 점수, 섬유화와 염증 점수 그리고 항대식세포항체 표현 (anti-macrophage antibody expression)정도는 Spearman rank correlation coefficient (ρ)로 평가하였다. p 값이 0.05 미만일 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 판단하였다. 통계 분석은 SPSS version 15.0 (SPSS, USA)를 이용하여 시행하였다.
9
Fig. 1a. Histologic examination of inflammation and fibrosis. Inflammation grade 1: numerous foreign-body giant cells and some lymphocytes are identified in adhesion site (H and E, ×100).
10
Fig. 1b. Histologic examination of inflammation and fibrosis. Inflammation grade 3: many eosinophils and neutrophils are infiltrated in adhesion site (H and E, ×100).
11
Fig. 1c. Histologic examination of inflammation and fibrosis. Fibrosis grade 1: mild fibroblastic proliferation rather than thick collagen band is formed in adhesion site (H and E, ×100).
12
Fig. 1d. Histologic examination of inflammation and fibrosis. Fibrosis grade 2: young fibroblastic proliferation admixed with collagen deposition is found in adhesion site (H and E, ×100).
13
Fig. 2a. Echocardiogram comparison in group SG p SG. Immediate postoperative echocardiogram showing pericardial effusion (arrows)
14
Fig. 2b. Echocardiogram comparison in group SG p SG. Echocardiogram follow-up in 2 week.
15
Fig. 3. Ejection fraction change in group SG. Ejection fraction decreased on immediate postoperative echocardiogram, but recovered in 2 weeks. Pre Op = before operation; Immediate Post OP=immediate after operation; 2 weeks Post Op = 2 week after operation.
16
Table 3. Transthoracic Echocardiographic Evaluation. Group CO (n=19) Group SL (n=19) Group SG (n=20) p value Ejection fraction (%) Preop 68.41 (6.77) 67.75 (6.35) 68.53 (6.89) 0.927 Immediate 69.24 (8.55) 66.06 (7.76) 63.95 (7.55) 0.085 Postop 2wk 69.45 (8.27) 67.18 (6.10) 68.45 (7.32) 0.632
Data are given as mean with SD in parentheses. Preop=before operation; Immediate=immediate after operation; Postop 2wk=2 weeks after operation. ANOVA test because of normal distribution.
*Kruskal-Wallis test because of abnormal distribution. There were no significant differences among groups.
17
III.
결 과
총 2 마리의 토끼가 각각 CO 군과 SL 군에서 사망하였다. CO 군에서 사망한 토끼의 사망원인은 감염에 의한 농흉이었다. SL 군에서 사망한 토끼는 기관 삽관의 실패로 인한 저산소증으로 사망하였다. 나머지 총 58 마리의 토끼가 첫 번째 수술 후 2 주간 생존하였다.A.
심장 초음파
CO 군이나 SL 군에 있어서 수술 직후 심장 초음파에서 심낭 삼출이 발견된 토끼는 없었다. SG 군에는 20 마리의 토끼 중 10 마리의 토끼에서 경도의 심낭 삼출이 발견되었다(Fig. 2a). 평균 좌심실 박출계수는 SG 군에 있어서 CO 군이나 SL 군에 비해 낮았다. 그러나, 이 차이의 통계학적 의미는 발견되지 않았다 (p=0.085). 2 주 후, 2 차 수술 직전에는 모든 군의 토끼의 심장 초음파에서 심낭 삼출이 발견되지 않았다. SG 군의 토끼 10 마리에서 보였던 심낭 삼출은 2 주 후 심장 초음파 검사에서는 모두 사라졌다(Fig. 2b, Fig. 3). 각 군 간의 좌심실 박출계수에는 차이가 없었다. 심장초음파 검사 결과는 Table 3 에 나타난 바와 같다.B.
육안적 검사
CO 군에서는 육안적 유착 점수가 2.79(0.79)였다. SL 군과 SG 군의 육안적 유착 점수는 각각 0.74(0.65)와 0.20(0.41)이었다. 즉, CO 군이 SL, SG 군에 비해서 현격히 높은 유착 점수를 보였다 (p<0.001). 또, SL 군의 유착18
Table 4. Macroscopic and Microscopic Adhesion Score. Group CO (n=19) Group SL (n=19) Group SG (n=20) p value Macroscopic 2.79 (0.79) 0.74 (0.65) * 0.20 (0.41) *† < 0.001 Inflammation 1.74 (0.65) 1.47 (0.70) 1.30 (0.47) 0.087 Fibrosis 1.63 (0.50) 0.68 (0.48) * 0.35 (0.49) * <0.001 Anti-macrophage antibody level 14.00 (10.62) 10.68 (6.48) 9.00 (5.79) 0.372
Data are given as mean with SD in parentheses. Kruskal-Wallis test because of abnormal distribution. * p<0.05 vs group CO
19
Fig. 4. Macroscopic adhesion score in all groups. Group CO > group SL > group SG (p=0.001)
20 점수가 SG 군의 유착 점수에 비해 유의하게 높았다 (p=0.045, Table 4, Fig. 4). 각 군에서 유착 점수가 가장 높게 평가되었던 토끼 개체의 사진을 Fig. 5 에 나타내었다.
C.
조직학적 검사
섬유화 점수와 염증 점수의 결과는 Table 4 에 표시되어 있다. CO 군의 섬유화 점수가 SL, SG 군에 비해 유의하게 높았다. SL 군과 SG 군 간에는 섬유화 점수의 차이가 없었다. 염증 점수는 모든 군 간에 유의한 차이가 발견되지 않았다(Fig. 6). 항대식세포항체 표현 정도는 Table 4 에 나타나 있다. CO 군의 항대식세포항체 표현 정도가 SL, SG 군에 비해 높았으나 통계학적인 유의성은 없었다(Fig. 7).D.
연관성
육안적 유착 점수와 섬유화 점수 사이에 밀접한 연관관계가 발견 되었다(ρ=0.653, p<0.001). 또, 염증 점수와 항대식세포항체 표현 정도 사이에도 밀접한 연관관계가 있는 것으로 나타났다(ρ=0.341, p=0.009). 그러나, 염증 점수와 육안적 유착 점수 사이의 연관관계는 유의하지 않았다(ρ = 0.168, p=0.208).21
Fig. 5a. The most severe adhesion in each group. Group CO with macroscopic grade 4.
22
Fig. 5b. The most severe adhesion in each group. Group SL with macroscopic grade 3.
23
Fig. 5c. The most severe adhesion in each group. Group SG with macroscopic grade 2.
24
Fig. 6. Fibrosis and inflammation score in all groups. (* p<0.05 vs group CO)
25
Fig. 7. Anti-macrophage antibody expression in all groups. There was no difference between all groups.
26
IV.
고 찰
그간 외과 영역에서 수술 후 유착을 방지하기 위한 여러 시도가 있었다. 수종의 물질이 개발되어 복강과 골반강의 수술 후 유착방지에 사용되었다. 이 물질들 중 약리적 작용을 하는 물질로는 섬유용해성 물질(fibrinolytic agent), 항응고 물질(anticoagulant), 항염증 물질(anti-inflammatory agent)과 항생제 등이 사용되어 왔으나 그 효과는 확실치 않았다(Diamond 등, 1987). 또, 생체에서 획득된 장벽물질들을 유착 방지에 사용하고자 하는 시도도 있어 왔는데, 복막, 장간막, 양막 등이 이에 해당된다(Edward 등, 1997; Young 등, 1991; Mathisen 등, 1982). 또한, 합성 장벽물질들도 개발되어 유착 방지의 효과가 연구되었고 이에는 실리콘, PTFE(polytertafluoroethylene), 셀룰로즈, polyvinyl alcohol 과 다양한 폴리에스터 유도체 등이 있다. 이들 중 일부는 개심술 후 심낭의 유착방지에도 사용되었다(Duncan 등, 1988; Becker 등, 1996; Ghellai 등, 2000; Yaacobi 등, 1993; Laks 등, 1981; Meus 등, 1983; Revuelta 등, 1985; Heydorn 등, 1987; Mitchell 등, 1994; Gallo 등, 1978; Iliopoulos 등, 2004; Okuyama 등, 1999; Connors 등, 2007).
물리적 장벽물질의 유착방지 효과의 기본적인 작용 기전은 손상 받은 조직의 표면을 주변 조직과 분리시켜 주는 것이다(Seifer 등, 1990). 물리적 장벽물질을 사용하여 수술 후 유착을 방지하고자 하는 시도는 수십 년간 있어왔다(Duncan 등, 1988; Becker 등, 1996; Ghellai 등, 2000; Yaacobi 등, 1993; Laks 등, 1981; Meus 등, 1983; Revuelta 등, 1985; Mitchell 등, 1994; Gallo 등, 1978; Iliopoulos 등, 2004; Okuyama 등, 1999). 지금까지 연구된 물리적 장벽물질에는 막형 장벽물질, 용액형 장벽물질 그리고 최근에 개발된
27 용액-겔형 장벽물질이 있다. 이중 막형 장벽물질은 가장 다양하게 여러 소재로 만들어져 판매되고 있다. 하지만, 막형 장벽물질의 가장 큰 단점은 실제 임상에 사용하는 데에 기술적인 어려움이 있다는 점이다. 일부 막형 장벽물질은 표면이 미끄러워 적용 하였을 때 실제 필요한 위치에서 다른 곳으로 이동하는 문제가 있어 이를 고정하기 위한 봉합 등의 다른 시술이 추가적으로 필요하다. 또 다른 막형 장벽물질은 생체 조직과 잘 늘러 붙는 특징이 있어 한번 위치 시켰을 때 위치를 재조정 하기가 무척 어려운 것들도 있다(Park 등, 2009; Connors 등, 2007; Oh 등, 2005). 더욱이, 심장, 대혈관, 관상동맥 이식편 등과 같이 격렬하게 움직이는 삼차원적인 해부학적 구조의 유착을 방지하기 위한 목적으로 사용될 때는 막형 장벽물질의 이러한 단점들이 심각한 문제가 된다. 심지어는 막형 장벽물질로 유착 방지를 원하는 해부학적 구조를 모두 포함시키기가 불가능해 지기도 한다. 용액형 장벽물질은 심장과 같은 장기에 사용하기에 막형 장벽물질에 비해 기술적으로 용이하다(Park 등, 2009). 그러나, 용액형 장벽물질은 중력에 의해 아래로 흐르기도 하고 실제 임상에서 심장수술 후와 같이 배액을 위한 다양한 형태의 관을 넣어 놓을 경우 미처 유착 방지작용을 하기도 전에 배액관으로 배액되어 그 효과가 현저히 떨어질 수 도 있다(Oh 등, 2005). 따라서, 실제 임상에서 사용될 때의 용액형 장벽물질의 유착방지 효과는 그 점도와 깊은 연관이 있다고 하겠다(Iaco 등, 1998). 가딕스-SL 의 점도는 노출 온도와 상관 없이 비교적 일정하여 꿀이나 시럽과 비슷한 정도로 약 2,500 에서 3,500 cP 이다. 임상적으로는 유착이 예상되는 손상 받은 조직에 스프레이로 뿌려 주게 된다. 비교적 점도가 높기 때문에 조직에 달라붙어 장벽을 형성, 유착을 방지하게 되고 수일 후에 가수분해되어 흡수되고 콩팥을 통해 배출된다(Young 등, 1991).
28 이 실험에서 우리는 가딕스-SL 을 주사기를 사용하여 심장 표면에 도포하였다. 수술 직후 심장초음파 소견에서 심낭 삼출을 보이는 토끼가 없었던 것으로 미루어 볼 때 대부분의 가딕스-SL 이 심낭의 절개부위를 통해 배액되어 흉강 내로 흘러 들어간 것으로 판단된다. 그러나, 비록 수술 직후 심장 초음파 소견에서 가딕스-SL 이 보이지 않았다고 해도 가딕스-SL 의 유착방지 효과는 남아 있었다. 이는 가딕스-SL 이 심장 표면에 얇게 도포된 상태로 남아 있어 유착방지 효과를 나타낸 것으로 판단된다. 가딕스-SG 는 유착 방지효과가 알려져 있는 poloxamer 를 기본으로 하여 만들어진 물질이다(Leach 등, 1990; Steinleitner 등, 1991; Vlahos 등, 2001;
Rice 등, 1993). 가딕스-SG 의 poloxamer 는 알긴산(alginate)과
염화칼슘(CaCl2)과 가교되어 있다. 유착 방지제로서 poloxamer 의 가장
치명적인 단점은 너무 빨리 흡수되어 유착방지 효과를 나타내야 할 시기까지 남아 있지 않을 수 있다는 것이다(Shim 등, 2002). 그러나, 가딕스-SG 의
poloxamer 의 알긴산(alginate)과 염화칼슘(CaCl2)의 가교가 유착 방지제로서
가지는 poloxamer 의 가장 큰 단점이라 할 수 있는 지나치게 빠른 흡수를 보완해 주는 역할을 한다. 가딕스-SG 는 중력에 의해 아래로 흘러 버리는 가딕스-SL 의 단점을 극복하기 위해 개발된 물질이다. 가딕스-SG 의 점도는 실온(22℃) 에서 약 2,960 cP 로 가딕스-SL 과 유사하다. 그러나, 체온과 유사한 온도(37℃)에서는 점도가 훨씬 더 높아져 약 90,000-95,000 cP 에 이르게 된다. 이러한 가딕스-SG 의 특성에 의해 가딕스-SG 가 적용되어 체온에 노출되었을 때 그 점도가 높게 변하여 흐르거나 하지 않고 남아 있어 원하는 위치에 유착방지 효과를 나타내는 데에 용이할 것이라고 판단되었다. 이 가설은 우리의 실험을 통해 같은 조건에서 가딕스-SL 보다 가딕스-SG 가 더 우세한 유착방지 효과를 나타냄으로써 증명되었다.
29 이 실험의 계획 단계에서 세운 또 하나의 가설은 심장에 도포되었을 때 높은 점도의 가딕스-SG 가 심장을 압박하여 심장의 운동을 저해할 수 도 있을 것이라는 것이었다. 실험 결과에 의하면 수술 직후 SG 군의 심장 초음파 검사에서 20 마리의 토끼 중에 10 마리에서 소량의 심낭 삼출이 남아 있음을 발견할 수 있었다. 또, 통계학적 유의성은 없을지라도 수술 직후 심장 초음파 상의 좌심실 박출계수는 SG 군에서 SL, CO 군에 비해 다소 낮은 소견을 보였다. 만일 표본의 크기가 더 컸다면 이 차이가 통계학적인 의미를 나타낼 수 도 있었을 것이다. 수술 직후에 보인 이 차이는 아마도 심낭 삼출에 의한 것으로 판단된다. 그러나, 소량의 삼출액 만이 남아 있었으며 이 차이가 임상적으로 의미가 있을 것으로 생각되지는 않는다. 게다가, 실제 임상적으로 사용되는 양보다 비교적 많은 용량의 가딕스-SG 가 실험에 사용되었음에도 불구하고 이 심낭 삼출은 2 주 후 심장 초음파 검사에서 모두 사라졌다. 더 작은 용량의 가딕스-SG 를 사용했다면 좌심실 박출계수를 저하시키는 단점은 매우 미비했을 것으로 판단된다. 그러나, 장기 추적 결과, 수술 후 배액관을 통한 가딕스-SG 의 배출, 혈액과 혼합되었을 때 발생할 수 있는 점도의 변화, 심근 운동을 저하하는 부작용은 최소화 하면서도 충분한 유착 방지 효과를 나타낼 수 있는 적절한 용량의 결정을 위한 연구가 더 진행되어야 하겠다. 이 동물 실험을 통하여 생체 흡수성 용액인 HA/CMC (가딕스-SLTM)와 poloxamer/alginate/CaCl2 로 이루어진 열 감음성 졸-겔 물질(가딕스-SGTM)의 심낭내 주입이 효과적으로 수술 후 유착을 방지할 수 있음을 밝힐 수 있었다. SL 군과 SG 군의 육안적 유착 점수는 CO 군의 육안적 유착 점수보다 유의하게 낮았다. 이 결과는 조직 검사에서 관찰되었던 것과 같이 SL 군과 SG 군에서 CO 군에 비해 섬유화 점수가 낮았던 점에 의해 설명될 수 있기도 하다.
30 SG 군의 육안적 유착 점수는 SL 군보다 낮았으나, SL 군과 SG 군 간의 섬유화 점수, 염증 점수에는 의미 있는 차이가 없었다. SG 군에 있어서 수술 직후 심장 초음파 검사에서 심낭 삼출이 있었던 10 마리 토끼들과 삼출이 보이지 않았던 10 마리 토끼들의 좌심실 박출계수는 비록 통계학적 의미를 가지지는 않았으나 (p=0.086) 다소의 차이를 보였다. 그러나, 유착, 섬유화, 염증 점수는 차이가 없었다(각각 p=0.660, 0.660, 0.722). 이 결과로 미루어 볼 때 심장 초음파에서 심낭 삼출이 보이지 않은 것과는 상관 없이 얇은 가딕스-SG 의 층이 남아 유착을 방지하는 작용을 지속적으로 했던 것으로 판단된다. 이 결과 역시 심낭 삼출을 유발하지 않고, 즉 임상에서 사용되었을 때 심근의 운동에 부정적 영향은 없이 장벽물질의 효과를 나타내는 적절한 가딕스-SG 의 용량이 연구를 통해 더 밝혀져야 함을 시사한다. 이 연구에 의하면 각 군간의 유착 점수에는 차이가 있었지만 염증 정도와 항대식세포 항체 표현 정도에는 차이가 없었다. 이 결과는 가딕스-SL 을 이용한 다른 연구의 결과와도 일치한다(Becker 등, 1996). 따라서, 가딕스-SL 과 가딕스-SG 의 유착 방지 효과는 항염증 효과 보다는 주로 조직간의 유착을 막는 장벽을 형성하는 데에서 비롯된다고 볼 수 있다. 이 실험에는 몇 가지 제한점이 있다고 하겠다. 첫째로, 비교적 작은 동물인 토끼가 실험동물로 사용된 것이다. 만일 더 큰 동물이 사용되었다면 좀 더 정확한 유착의 분석을 위한 현실적인 모델이 되었을 것이다(Iliopoulos 등, 2004). 둘째로, 심낭 유착에 관한 한 정형화된 동물 실험 모델이 없어 이 실험에도 사용될 수 없었다는 점이다. 일정한 정도의 유착을 유발할 수 있는 표준화된 모델의 개발이 시급한데 여러 이유로 개발에 어려움이 있다. 이 실험 역시 한 명의 외과의사가 같은 물질을 사용하여 같은 시간 동안 조직을
31 문지르는 것으로 유착을 유발하였다. 이 방법으로 실험동물간에 일정한 정도의 찰과상과 유착을 유발할 수 있었는지는 의문이 있다. 셋째로, 실제로 병원의 수술실에서 일어날 수 있는 다양한 조건들이 이 실험 환경에는 반영되지 않았다. 예를 들면, 이 실험에는 거의 출혈이 발생하지 않았으며, 인공심폐기도 사용되지 않았다(Cliff 등, 1973; Nkere 등, 1993). 넷째로, 실험 물질들이 비록 2 주 후의 유착에는 탁월한 효과를 나타내었으나 이 유착방지 효과가 실제 임상에서 중요한 수년 후의 유착방지 효과로도 이어질 수 있는가에 대한 대답을 이 실험이 줄 수 없다는 점이다. 다섯째로, 비록 실험자들이 최대한 객관적인 관찰과 기록을 할 수 있도록 실험을 설계하였으나 유착, 섬유화 그리고 염증 점수의 책정은 주관적인 판단에 의존할 수 밖에 없었다.
32
V.
결 론
가딕스-SL 과 가딕스-SG 는 유착을 방지하는데 효과적이었으며 이중 가딕스-SG 의 유착방지 효과가 가딕스-SL 보다 높았다. 그러나, 비록 통계학적 의미는 없었으나, 가딕스-SG 는 심장의 운동을 방해하여 좌심실 박출계수를 저하시켰다. 앞으로 심장의 운동저하를 유발하지 않으면서 유착방지효과를 극대화 할 수 있는 적절한 용량을 결정하기 위한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.33
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- ABSTRACT -
The Effects of Barrier Materials on
Reduction of Pericardial Adhesion Formation in Rabbits
Joonhwa Hong
Department of Medical Sciences The Graduate School, Ajou University
(Supervised by Professor Cheol Joo Lee)
Objective: This study was performed to examine the efficacy and safety of a hyaluronan solution (Guardix-SL) and a temperature sensitive poloxamer solution/gel material (Guardix-SG) on the prevention of pericardial adhesion in rabbits.
Methods: A total of 60 rabbits were divided into three groups according to material applied after epicardial abrasion: the control group (group CO), the Guardix SL group (group SL), and the Guardix SG group (group SG). The ejection fraction and the presence of pericardial effusion were evaluated by echocardiograms at the immediate postoperative period and 2 weeks after the surgery. The adhesion was evaluated macroscopically and microscopically 2 weeks after the surgery.
41
the immediate postoperative period in 10 out of 20 rabbits with an insignificant reduction of the ejection fraction. Group CO had a significantly higher macroscopic adhesion and fibrosis score than did groups SL and SG (P<0.001), and group SL had a significantly higher adhesion score than did group SG (P=0.045). Inflammation score and the expression of anti-macrophage antibody in group CO were higher than those in groups SL and SG, although the differences were not significant.
Conclusions: Guardix-SL and Guardix-SG effectively reduced the adhesion formation, and Guardix-SG is more effective than Guardix-SL for preventing adhesion. However, Guardix-SG showed a potential disadvantage of decreasing the ejection fraction, although this was statistically insignificant. Further study to verify the appropriate dosage to maximize the therapeutic effect without decreasing the heart function is needed.
Key Words: hyaluronan solution; poloxamer solution/gel; pericardium, surgical adhesion
