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Autoantibodies From Patients With Nonallergic Asthma Cause Cytotoxic Injury To Airway Epithelial Cells.

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분석

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알레

레르

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--국국국문문문 요요요약약약 --

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독성

성 분

분석

비알레르기성 천식 환자의 혈액 검체 안에는 알레르기성 천식 환자나 정 상인에 비해 IgG 자가항체가 증가되어 있다고 보고된 바 있다. 이에 따라 비 알레르기성 천식의 발병기전에서 기도상피세포내의 자가항원에 대한 자가면역기전 이 관여할 가능성이 제시되고 있다.본 연구에서는 비알레르기성 천식의 병인 기전 에서 기도상피세포에 대한 자가면역반응의 기능적인 역할을 확인하기 위해서 정상 인 12명,알레르기성 천식환자 9명,비알레르기성 천식환자 10명의 혈청으로부터 IgG 항체를 분리하여 기도상피세포에 대한 자가항체 매개 세포독성 연구를 시행하 였다. ProteinA column을 이용하여 비알레르기성 천식 환자와 알레르기성 천식 환 자,그리고 정상인의 혈청으로부터 IgG 항체를 순수분리 하였다.사람 기도상피세 포주 (A549)에 대한 IgG 항체 매개 세포독성 실험은 Terasakiplate를 이용하여 microcytotoxicity assay를 시행하였다.기도상피세포에 대한 독성의 정도는 % celldeath로 나타내었다. 비알레르기성 천식 환자에서 분리한 IgG 항체는 농도가 증가함에 따라 용량 의존적으로 기도상피세포에 대한 세포독성이 증가하였다.10명의 비알레 르기성 천식 환자의 IgG 항체에 의한 세포 독성(23.58± 5.0%)은 12명의 정 상인(9.56± 3.2%)과 9명의 알레르기성 천식 환자(12.48± 2.9%)에 비교해 유의하게 높았다 (p<0.05).비알레르기성 천식 환자의 혈액으로부터 순수 분리 한 IgG 항체를 유전자 재조합 사람 cytokeratin 18 단백질과 유전자 재조합 사람 α-enolase단백질에 미리 흡착시킨 경우 기도상피세포에 대한 IgG 항체

(6)

매개에 의한 세포 독성이 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다 (p<0.05). 이러한 결과는 비알레르기성 천식 환자의 자가항체에 의한 병인기전에서 기도상피세포에 대한 세포독성 기전이 관여할 가능성을 시사한다.

(7)

차 례

국문요약 ···i 차례 ···iii 그림차례 ···v 표 차례 ···ⅶ I.서 론 ···1 II.재료 및 방법 ···3 A.대상 환자 및 혈액 검체 수집···3

B.기도 상피 세포 단백에 대한 IgG 자가 항체의 immunoblot검출 ···3 1.기도 상피 세포의 배양 및 단백질 추출 ···3 2.기도 상피 세포 단백에 대한 IgG 자가 항체의 immunoblot 검출 ···4 C.천식 환자 및 대조군의 혈장으로 부터 IgG 항체 단백을 순수 분리 ···5 D.Microcytotoxicity assay를 이용한 세포 독성 측정 ···5 E.유전자 재조합 자가항원 단백질의 정제 및 확인과 기도 상피 세포 독성 반응의 억제 ···6 1.유전자 재조합 사람 cytokeratin 18단백질 정제 ···7 2.유전자 재조합 사람 -enolase단백질 정제 ···8 3.유전자 재조합 단백질의 확인 ···9 4.유전자 재조합 자가항원 단백질을 이용한 기도상피세포 독성 반응의 억제 ···9 F.통계분석 ···10 III.결 과 ···11

(8)

A.연구 대상 환자 및 혈액검체 수집 ···11

B.기도 상피 세포 단백에 대한 IgG 자가 항체의 immunoblot검출 ···11

C.ProteinA column을 이용한 IgG 항체 순수 분리 및 확인 ···16

D.Microcytotoxicity assay방법으로 세포 독성 측정 ···16 E.IgG 항체에 의한 기도상피세포 독성 반응의 억제 ···20 IV.고 찰 ···25 V.결 론 ···32 참고 문헌 ···33 영문 요약 ···38

(9)

그림

림 차

차례

Fig.1.ImmunoblotanalysisofcirculatingIgG autoantibodiestoairway epithelialcell(A549)proteins(A),recombinanthuman

cytokeratin18protein(49kDa)(B)andrecombinathuman

α-enolaseprotein(55kDa)(C)usingserum samplesfrom healthy controls,9patientswithallergicasthmaand12patientswith nonallergicasthma.···13 Fig.2.Analysisofhuman IgG antibodiespurifiedusing protein A

column by SDS-PAGE andCoomassiebluestaining.···17 Fig.3.MeasurementofIgG autoantibody-inducedcytotoxicity to

airway epithelialcellsusing microcytotoxicity assay.···18 Fig.4.MeasurementofIgG autoantibody-inducedcytotoxicity to

airway epithelialcellsusing purifiedIgG autoantibodies from 12healthy controls(CON),9patientswith allergicasthma (AA),and10patientswith nonallergicasthma(NAA)by

microcytotoxicity assay.···19 Fig. 5.Analysisofrecombinanthuman cytokeratin 18and

recombinanthuman α-enolaseprotein by SDS-PAGE

andCoomassiebluestaining.···20 Fig. 6.Immunoblotanalysisofrecombinanthumancytokeratin18

(10)

andrecombinanthuman α-enolaseproteinbyspecific

antibodies.···21 Fig. 7.InhibitionofIgG antibody-mediatedcytotoxicitytoairway

epithelialcellproteinsusingpurifiedhumancytokeratin18and human-enolaseautoantigens.···23

Fig. 8.Microscopicexaminationofculturedairwayepithelialcells (A549)incubatedwithpurifiedIgG antibodiesfrom nonallergic asthmapatients.···24

(11)

표 차

차례

Table 1.Characteristicsofstudysubjects.···11 Table 2.Immunoblotdetection resultsofIgG autoantibodiesto

cytokeratin 18protein and-enolaseprotein in healthy controls,patientswithallergicasthmaandpatientswith nonallergicasthmausing airway epithelialcell(A549)

(12)

Ⅰ.

.

.서

서 론

기관지천식은 기관지 점막 조직의 염증으로 인하여 호흡곤란 증상이 유발되는 만성 염증성질환으로 아직 정확한 발병원인이 규명되지 못하여 완치방법이 없는 상태 이다.기관지천식은 우리나라를 포함하여 세계적으로 대다수의 발전된 국가들에 서 유병율이 전체인구의 5-10%에 이르는 매우 흔한 질환이다.또한 최근 들어 급격한 천식의 유병율 증가와 질병과 관련된 사망의 증가로 국제적으로 심각한 보건 문제로 대두되고 있다 (GlobalInitiativeforAsthma,2002). 기관지천식은 전통적으로 외부에 존재하는 물질에 대한 과민한 면역반응(알레르 기 반응)이 원인이 되어 발생된다고 믿어져 왔다 (Greenberger,1997).그러나 성인 기 관지천식 환자들의 상당 수(약 30-40%)는 알레르기 피부반응 시험 상 외부 물질에 대 한 알레르기 반응 소견을 확인할 수 없는 비아토피성 천식이며 이들 환자의 경우 아 토피성 천식 환자들에 비해서 임상적인 질병의 중증도가 심하고,비용종이나 아스피린 과민성을 보이는 경우가 흔하다고 알려져 있다 (Greenberger,1997). 비아토피성 천식환자들은 천식의 원인이 환자의 내부에 존재할 것이라는 믿음 하에서 ‘내인성 천식’으로도 불리어왔다 (Rackemann,1940).하지만 아직도 ‘내인성 천 식’을 발병시키는 내부적인 원인이 규명되지 못한 상태이며,따라서 이들에서 천식의 원인이 실제로 내부에 존재하는지 확인이 불가능함에 따라 이들 천식을 ‘특발성 천식 (idiosyncraticasthma)’또는 ‘비알레르기성 천식(nonallergicasthma)’으로 분류하자는 주장도 제시되고 있는 상태이다 (McFaddenER Jr,2005). 아토피성 천식에서의 알레르기 면역병인기전에 대해서는 매우 많은 연구가 이루 어져 온 것에 비교해 볼 때 상대적으로 비아토피성 천식의 병인기전에 대한 연구는 매우 드문 형편이다 (Greenberger,1997).과거로부터 여러 연구자들에 의해서 비아토 피성 천식의 병인에 자가면역 기전이 관여할 가능성이 꾸준히 제시되어 왔으며,최근 에 개정된 세계천식기구(GlobalIntitiativeforAsthma,2002)의 천식치료지침서에서도

(13)

비알레르기성 천식의 발병기전에 대한 첫 번째 가설로서 자가면역 기전의 관여 가능 성이 제시되어 있는 상태이다 (GlobalIntitiativeforAsthma,2002).기관지천식의 자 가면역 기전에 대한 기존 연구들의 논리적 근거는 주로 비아토피성 천식환자들에서 아토피성 천식환자들에 비해 평활근 조직,혈관내피세포,기관지점막조직 등에 대한 자가항체가 유의하게 자주 검출된다는 사실들에 근거한다 (Girard,1973; Lidor,1980;Lassalle,1993).하지만 이러한 기도조직이나 혈관내피세포에 대한 자가 항체의 검출만으로는 실제로 자가면역반응이 비알레르기성 천식의 발병기 전에 관여한다고 증명하기에는 논리적으로 부족한 상태이다.일반적으로 자가면 역 기전이 질병의 병인기전에 관여함을 증명하기 위해서는 동물에게 자가면역반 응을 유도하여 이에 따라 그 질병에 합당한 소견들이 동물에게서 발생함을 증명 되어야 한다 (Lipsky와 Diamond,2005).이러한 증명을 위해서는 먼저 실제로 천 식환자들에서 관찰되는 기도염증반응과 논리적인 연계성이 있는 천식과 연관된 자가 항원의 실체가 규명되어야할 것이다.최근에는 기도상피세포에 존재하는 cytokeratin18(CK-18)단백질이 비아토피성 천식 환자들의 혈청 IgG 항체와 반 응하는 기도상피세포 자가 항원 단백임을 규명하여 보고된 바 있다 (Nahm, 2002).또한 성인 천식 환자들에서 혈중 cytokeratin18단백에 대한 IgG 항체가 중등증 및 중증 천식 환자들에서 경증 천식환자들에 비해서 더 유의하게 자주 검출됨을 확인하였다(Shin,2006).또한 기도상피세포에 존재하는 -enolase 단 백질이 중증 천식 환자들의 혈청 IgG 항체와 반응하는 기도상피세포 자가항 원 단백임을 규명하여 보고된 바 있다 (Nahm,2006).

이에 연구자는 세포독성 실험으로 환자들의 혈청에서 IgG 항체를 분리하여 배양된 기관지상피세포와 반응시킨 후 세포독성을 보이는지를 확인하여 IgG 항 체의 기능적 중요성을 실험실 조건(invitro)에서 증명하고자 한다.

(14)

Ⅱ.

.

.재

재료

료 및

및 방

방법

A A A...대대대상상상 환환환자자자 및및 혈및 혈혈액액액 검검검채채채 수수수집집집 연구책임자가 근무 중인 대학병원의 외래 또는 응급실로 내원하여 전형 적인 기관지천식에 합당한 임상증상과 더불어 객관적으로 기관지확장제 흡 입 후 폐기능 검사상 기도폐쇄의 가역성(FEV1의 12% 이상 호전)이 증명되 거나 기도과민증(Methacholine PC20으로 8mg/ml이하)이 확인되어 기관지 천식으로 진단 받은 성인 기관지천식 환자 19명을 대상으로 하였다.모든 기 관지 천식 환자는 50종의 흔한 흡입성 알레르겐 (Bencard Co.Brentford, UK)을 이용한 피부단자시험을 시행하였다.50종의 흔한 흡입성 알레르겐에 대한 피부단자검사 상 어느 한가지의 알레르겐에 대해서 팽진의 평균직경이 3mm 이상인 경우를 아토피성(또는 알레르기성)천식으로 분류하고,상기 알 레르겐에 대해서 음성반응을 보인 경우를 비아토피성(또는 비알레르기성)천 식이라고 분류하였다.대조군으로 건강 검진을 목적으로 본원 검진센터로 내 원하여 시행한 폐기능 검사 상 정상 소견을 보이고,병력상 호흡기 증상이 없으며,흡연력이 없고,기타 만성 질환을 앓은 적이 없는 남녀 12명을 정상 대조군으로 포함시켰다.대상자들의 검체는 연구목적의 혈액기증에 동의하는 환자들과 건강대조군들에서 혈액검체를 수집하였다.환자와 대조군들에서 채 취한 혈청 시료들은 -20℃에 냉동 보관하였다. B B B...기기기도도도 상상상피피피 세세세포포포 단단단백백백에에에 대대대한한한 IIIgggGGG 자자가자가가 항항항체체체의의의 iiimmmmmmuununnooobbblloloottt검검검출출출 1 1 1...기기기도도도 상상상피피피 세세세포포포의의 배의 배배양양양 및및및 단단백단백백질질질 추추추출출출

미국의 ATCC (American Type Culture Collection,VA,USA)로부터 사람과 마우스의 기도상피 세포 중 최근에 가장 많이 사용 되는 A549세포 주를 구입하여 10% fetalbovine serum (Sigma ChemicalCo.,St.Louis,

(15)

MO,USA)이 포함된 DMEM/F-12 medium (Gibco BRL.,Grand.Island, NY)으로 배양하였다.배양된 세포를 10mM tris/HCl,pH 7.2,0.1% SDS, 158mM NaCl,10mM DTT를 함유하는 용해 완충액을 첨가하여 용해시킨 후 aliquot하여 -20℃에 보관하였다. 2 2 2...기기기도도도 상상상피피피 세세세포포포 단단단백백백에에에 대대대한한한 IIIgggGGG 자자가자가가 항항항체체체의의의 iiimmmmmmuuunnnooobbblllooottt검검검출출출 상기 A549세포추출 단백질 175μg,유전자재조합법으로 만들어져 시판 되는 순수 분리된 사람 cytokeratin 18 단백 (Progen In., Heidelberg, Germany)20μg과 제조사에서 권유한 방법에 따라 순수 분리한 유전자 재조 합 사람 -enolase단백 20μg을 불연속적 황산도데실나트륨/폴리아크릴아마 이드 전기영동법(SDS-PAGE)으로 분리하였다. 전기영동 후, 단백질을 polyvinylidine difluoride (PVDF;Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)막으 로 전위시켰다.전위 후,PVDF 막을 먼저 20% 탈지분유 및 10% 우혈청, 0.1% Tween 20이 포함된 tris buffered saline (TBS)과 3시간 반응시켰다. 이후 PVDF 막 스트립을 동일한 완충용액에 1:100(v/v)희석한 혈청과 실 온에서 3시간 동안 반응시켰다.세척 후,상기 막을 alkaline phosphatase가 부착된 염소 항사람 IgG 항체 (SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA) 와 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 최종 세척 후, 상기 막을 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate/nitro bluetetrazolium (BCIP/NBT; SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)용액으로 5분간 발색하였다.양 성대조로 cytokeratin 18 단백에 대한 마우스 단클론 항체 (clone CK5; Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)와 -enolase단백에 대한 염소 다클론 항체 (Santa Cruz, CA, USA)를 동일한 완충용액에 각각 1:10000(v/v),1:5000(v/v)희석하여 사용하였다.실험 간의 자가 항체 검출률 의 기술적인 오차를 최소화하고자 각각의 실험 시마다 양성대조 혈청 및 음

(16)

성대조 혈청을 포함시켰다.대조혈청들에 의한 발색정도와 검체에 의한 발색 정도를 육안으로 비교해서 뚜렷한 양성을 보이는 경우를 양성으로 판독하였 다.판독 시 2명의 실험자가 독립적으로 검사 결과를 판독하였으며,2명의 판독결과가 일치하는 경우에 이를 실험결과에 포함시켰다. C C C...천천천식식식 환환환자자자 및및및 대대조대조조군군군의의의 혈혈혈장장장으으으로로로 부부부터터터 IIIgggGGG 항항항체체체 단단단백백백을을을 순순순수수수 분분분리리리 천식 환자와 대조군의 혈청 또는 혈장으로부터 protein A minispin column kit (Pro-chem Inc, Littleton, MA, USA)를 이용하여 affinity chromatography 법으로 IgG를 순수 분리하였다.분리된 IgG의 순수도는 SDS-PAGE와 Ccoomassie blue를 이용한 단백질 염색을 통해서 상품화된 99% 이상의 순도를 가지는 사람면역글로불린 IgG (IV globulin;녹십자,경 기도,대한민국)를 대조시약으로 하여 분석하였다.또한 각 검체의 사이즈를 확인하기 위해 protein marker(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA)를 사용하였 고,각 검체는 모두 2.5g씩 동일한 양을 사용하였다.

D D

D...MMMiiicccrrrooocccyytyttoootttooxoxxiiiccciiitttyyy aaassssssaaayyy를를를 이이용이용용한한한 세세세포포 독포 독독성성성 측측측정정정

Terasaki plate (Nunc Gmbh & Co. KG, Rheingaustrasse 32, Wiesbaden, Germany)를 이용한 microcytotoxicity assay 법은 1964년 (Terasaki와 Mcclelland,1964)에 검사방법이 개발되었으며 이미 기도상피세 포인 A549에 대한 cytotoxicity를 알아보기 위한 방법(Mistry등,1993)이 보 고된바 있어 이를 변형하여 시행하였다.Terasakiplate에 순수 분리된 IgG 항체를 다양한 농도로 희석하여 well당 1μl씩 quadruplicate하여 분주하였 다.배양된 A549세포를 PBS로 세척하고 trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 떼어낸 후 혈청이 포함되지 않은 DMEM/F12 배지로 3x106세포/ml의 농도

(17)

하고 mineraloil(Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)을 4μl씩 분 주하여 상기 용액이 마르지 않도록 하였다.상온에서 2시간 30분간 반응시킨 후에 5% eosin Y dye(Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)를 5 μl 씩 분주하고 다시 formalin (Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)을 5μl씩 분주하여,상온에서 1-2시간 동안 반응 시킨다.Coverglass를 덮고 1시간 상온에 둔 후에 4oC에서 하룻밤 보관하고,광학 현미경으로 모든 well

의 1/4인 오른쪽 위를 촬영하여 각 well의 전체 세포수와 세포막이 intact한 상태인 세포의 수를 세어서 전체 세포수에 대비하여 세포막이 intact한 상태 인 세포수를 % cytotoxicity로 기록한 후,각 검체마다 quadruplicate 한 % cytotoxicity의 평균값을 구했다.음성 대조군으로 DMEM/F-12 medium만을 포함하도록 하였고,각 well의 순수 분리된 IgG 항체에 의한 기도상피세포 독성 은 아래의 식에 따라 % cytotoxicity로 나타냈다.

% cytotoxicity (celldeath)= [(각 well의 전체 세포수- 세포막이 intact한 상태의 세포수)/각 well의 전체 세포수]x100 E E E...유유유전전전자자자 재재재조조조합합합 자자자가가가항항항원원원 단단단백백백질질의질의의 정정정제제제 및및및 순순순수수수도도 확도 확확인인인과과과 기기기도도도 상상상피피피 세 세 세포포포 독독독성성성 반반응반응응의의의 억억억제제제 비알레르기성 천식 환자의 IgG 항체가 cytokeratin 18 단백질과 α -enolase 단백질에 대해 cytotoxicity를 갖는다는 것을 증명하기 위해 cytokeratin 18 단백질과 α-enolase단백질을 억제하였을 때 cytotoxicity가 줄어드는지를 확인하였다.우선 pDEST15벡터에 유전자 재조합 cytokeratin 18 단백질을 발현하는 사람유전자를 삽입하고, Glutathion Sepharose Transferase (GST)를 tag으로 사용한 클론 (RZPD Co., Heidelberg, Germany)을 구입했다.대조군으로 같은 RZPD에서 pDEST15 벡터에 유전 자 재조합 -enolase단백질을 발현하는 사람 유전자를 삽입한 클론과 음성

(18)

대조군으로 녹십자에서 제조한 순수한 정맥주사용 사람 알부민 (human serum albumin;녹십자,경기도,대한민국)을 사용하였다.

1 1

1...유유유전전전자자자 재재재조조조합합합 사사사람람람 cccyyytttoookkkeeerrraaatttiiinnn 111888단단단백백백질질질 정정정제제제

단일 콜로니를 LBA (Luria-Bertani/ampicillin) 액체 배지 (bacto tryptone10g/L,yeastextract5g/L,NaCl10g/L,100mM ampicillin)에 접종 한 후 37℃에서 밤새 배양한다.이 배양액에서 plasmid DNA purification kit(Intron Inc.,Seoul,Korea)를 이용하여 DNA를 추출한 후,E.coilcell 인 BL-21 competentcell에 전기 충격으로 넣어준 후 37℃에서 1시간의 배 양시간을 갖고 LBA 고체 배지 (bacto tryptone10g/L,yeastextract5g/L, NaCl10g/L,bacto agar15g/L,100mM ampicillin)에 도말해 주었다.이 고 체 배지에 자란 단일 콜로니를 LBA 액체 배지 3ml에 넣고 37℃에서 밤새 배양한 후,2x YTA 액체 배지 (bactotryptone16g/L,yeastextract10g/L, NaCl5g/L,100mM ampicillin)200ml에 전날의 배양액 2ml을 접종하여 3 7℃에서 OD= 0.6이 되도록 키우고 1ml씩 harvest해 놓았다.Induction을

위해 상기 배양액에 100mM IPTG (isopropyl-β-D- thiogalactopyranoside) 200l를 넣고 다시 30℃에서 3시간 동안 배양한 후,induction 유무를 확인하 기 위해 100mM IPTG를 넣기 전과 후의 배양액을 1ml씩 덜어 각각 harvest해 놓고 SDS-PAGE gel에 걸어서 확인해 주었다.배양액은 4℃, 6500rpm에서 5분 동안 원심분리 한 후 상층액은 제거하고,침전물은 lysis buffer (50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 5mM β -mercaptornol,1mg/mllysozyme,pH 8.0)로 현탁해 주었다.이 현탁액을 30분 동안 4℃에 보관한 후 sonicater(Sonics & Materials Inc.,Danbury, CT,USA)에서 amplitude25%,pulseon 9",off9"조건으로 10분 동안 세 포를 깨고 4℃,13000rpm으로 15분 동안 원심분리 하였다.상층액을 조심히

(19)

따라 버리고 침전물은 high saltbuffer(50mM Tris-HCl,2M Nacl,10mM EDTA,5mM beta-mercaptornol,1% NP-40,pH 8.0)로 현탁해 준 후 4℃, 6500rpm으로 5분 동안 원심분리하는 과정을 2번 반복했다.그 후 이 침전물 을 lysis buffer로 현탁하여 4℃,6500rpm으로 5분 동안 원심분리한 뒤,2M urea를 포함한 lysis buffer로 침전물을 현탁 한 후,4℃,6500rpm으로 5분 동안 원심분리 하는 과정을 2회 반복했다.다시 이 침전물을 8M의 urea를 포함한 lysis buffer로 현탁한 후 4℃,13000rpm으로 15분 동안 원심 분리 하여 상층액만 분리하였다. 2 2 2...유유유전전전자자자 재재재조조조합합합 사사사람람람 ---eeennnooolllaaassseee단단단백백백질질질 정정정제제제

상업적으로 구입한 fullopen reading frame(ORF)을 발현하는 클론을 구입하여 제조사가 권장한 방법대로 BL-21 competent cell에 형질전환 (transformation)하여 상기와 동일한 방법으로 induction 하였다.Induction 후 배양액을 4℃,6500rpm에서 5분 동안 원심분리 한 후 차가운 TE buffer (50mM Tris-HCl, 2mM EDTA, pH 8.0)로 침전물을 현탁 한 후 4℃, 6500rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 상층액은 따라 버린다.여기에 NETN buffer(20mM Tris-HCl,100mM Nacl,1mM EDTA,1.5% NP-40,pH 8.0) 를 넣고 침전물을 현탁 한 후 amplitude25%,pulseon 9",off9"조건으로 10분 동안 sonicater에서 세포를 깨고 4℃,13000rpm으로 15분 동안 원심분 리하여 상층액을 NETN buffer로 3회 세척한 Glutathione sepharoseTM 4B

bead (Amersham Pharmacia Inc.,Uppsala,Sweden)와 섞어 4℃에서 밤새 흔들어 주었다.다음날 이것을 4℃,500xg에서 5분 동안 원심분리 한 후,상 층액은 따로 모아두고 bead 만 NETN buffer로 3회 세척하고 난 후,PBS (phosphatebuffered saline)로 다시 3회 세척해 주었다.그리고 bead :PBS = 1 :1 이 되게 넣고 thrombin (Sigma Aldrich Inc,StLouis,MO,USA)

(20)

을 처리하여 4℃에서 밤새 흔들어 준 후 4℃,500xg에서 5분 동안 원심 분 리 한 후 상층액을 조심히 옮겨 담는다. 3 3 3...유유유전전전자자자 재재재조조조합합합 단단단백백백질질질의의의 확확확인인인 상기 방법으로 분리,정제한 유전자 재조합 사람 cytokeratin 18 단백 5μg과 유전자 재조합 사람 -enolase 단백 5μg의 순수도는 SDS-PAGE와 Coomassieblue를 이용한 단백질 염색을 통해서 상품화된 99% 이상의 순도 를 가지는 사람 알부민 (human serum albumin)5μg을 대조시약으로 하여 분석하였다.또한 상기에서 분리,정제한 유전자 재조합 사람 cytokeratin 18 단백과 유전자 재조합 사람 -enolase단백이 기도 상피세포 내에 존재하는 자가항원 단백과 같은 유전자 재조합 단백임을 확인하기 위해 유전자 재조 합 사람 cytokeratin 18 단백질과 유전자 재조합 사람 -enolase 단백질에 대해 특이적인 항체를 사용하여 immunoblotting을 시행하였다. 4 4 4...유유유전전전자자자 재재재조조조합합 자합 자자가가가항항항원원원 단단단백백백질질질을을을 이이이용용용한한한 기기기도도도상상상피피세피세세포포포 독독독성성성 반반반응응응의의의 억 억 억제제제 상기에서 분리한 유전자 재조합 사람 cytokeratin 18 단백질과 유전자 재조합 사람 -enolase단백질,그리고 음성대조군으로 사람 알부민을 모두 동량 (25g)으로 준비하고 2x samplebuffer를 넣고 끓여 SDS-PAGE gel에 전기영동을 한 후,polyvinylidine difluoride (PVDF; Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA)막으로 전위시켰다.전위된 단백질을 Ponceau-S dye (Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)를 이용하여 단백질의 위치를 확인한 후 PVDF 막을 strip으로 절단한 후에 다시 3x 3mm 정도의 사각형 절편으로 만 들어 eppendorftube에 넣고 기도상피세포에 대해서 뚜렷한 독성반응을 보인 비 알레르기성 천식환자로부터 분리한 IgG 항체 125g과 혼합하여 4oC에서 16시

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간 동안 반응시켜 주었다.다음날 원심 분리한 상층액을 이용하여 다시 상기 와 같은 방법으로 기도상피세포에 대한 독성을 검사하였다.이에 음성 대조 군인 알부민에 대한 세포독성 정도와 비교하여 세포독성반응의 억제정도를 % inhibition으로 표현하였다. F F F...통통통계계계분분분석석석

각 군 간의 세포독성의 차이의 비교는 Chi-square test와 Student's t-test를 이용하였다.실험 결과는 평균 및 표준편차로 표시하고 p값이 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의하다고 판정하였다.

(22)

Ⅲ.

.

.결

결 과

A A A...연연연구구구 대대대상상상 환환환자자 및자 및및 혈혈혈액액액검검검체체체 수수수집집집 연구 대상자들 중 연구목적의 혈액기증에 동의한 알레르기성 천식 환자 9명,비알레르기성 천식 환자 10명,그리고 정상대조군 12명으로부터 정맥 혈을 20mL씩 채혈하였다.헌혈에 참가한 환자 및 대조군들로부터 연구윤리 위원회의 심의를 통과한 양식에 따라서 서면동의를 받아서 보관하였다 (Table.1). T T Taaabbbllleee111...CCChhhaararraaacccttteeerrriiissstttiiicccsssoooffsfsstttuuudddyysyssuuubbbjjjeeeccctttsss...

Data are expressed as mean (95% confidence interval for mean; lower bound-upperbound). *Significantdifferencecomparedtohealthycontrolsand nonallergic asthma (p<0.05).†††Significant difference compared to healthy controls(p<0.05).

B B

B...기기기도도도 상상상피피피 세세세포포포 단단단백백백에에에 대대대한한한 IIIgggGGG 자자가자가가 항항항체체체의의의 iiimmmmmmuununnooobbblloloottt검검검출출출 Immunoblot 실험 결과 사람 기도 상피 세포(A549) 단백들 중 cytokeratin 18 단백과 -enolase단백이 IgG 자가항체와 반응하는 주요 자 가 항원 단백질임이 이미 보고된 바 있다 (Nahm etal,2002;Nahm etal,

N N N AAAgggeee((y(yyeeeaaarrrsss))) SSSeeexxx (((FFF///MMM))) FFFEEEVVV111(((%%% ppprrreeedddiiicctctteeeddd))) H H Heeeaaalllttthhyhyycccooonnntttrrrooolllsss 111222 444777(((22200-0--777444))) 5/55//777 11100088.8..444(((88844-4--111333999))) A AAlllllleeerrrgggiiicccaaassstththhmmmaaa 999 252255(((111999---333444)))*** 4/44//555 777777...333(((222888---999666)))††† N NNooonnnaaallllleleerrrgggiiicccaasaststthhhmmmaaa 101100 444444(((222000---666777))) 666///444 55599.9..222(((33333-3--777888)))†††

(23)

2006).

A549세포 안에 존재하는 cytokeratin 18단백질에 대한 IgG 항체가 비 알레르기성 천식 환자 10명 중 5명 (50%)에서 검출 되었으며,알레르기성 천식 환자 9명 중 1명(11.1%),정상인은 12명 중 0명(0%)을 보여 비알레르 기성 천식 환자들에서 유의하게 높은 검출률을 보였으며 (p=0.01),  -enolase 단백질에 대한 IgG 항체가 비알레르기성 천식 환자 10명 중 5명 (50%)에서 검출 되었으며,알레르기성 천식 환자 9명 중 1명(11.1%),정상 인은 12명 중 1명(8.3%)을 보여 역시 마찬가지로 비알레르기성 천식 환자들 에서 유의하게 높은 검출율을 보였다 (p<0.05)(Fig.1.(A)).유전자 재조합 사람 cytokeratin 18단백에 대한 IgG 항체 검출 시도 결과 비알레르기성 천 식 환자 10명 중 8명 (80%)에서 검출 되었으며,알레르기성 천식 환자 9명 중 0명 (0%),정상인 12명 중 0명 (0%)을 보여 비알레르기성 천식 환자들에 서 유의하게 높은 검출률을 보였다(p<0.001)(Fig.1.(B)).그리고 유전자 재 조합 사람 -enolase단백질에 대한 IgG 항체 검출 시도 결과 비알레르기성 천식 환자 10명 중 6명 (60%)에서 검출 되었으며,알레르기성 천식 환자 9 명 중 2명 (22.2%),정상인 12명 중 2명 (16.7%)을 보여 비알레르기성 천식 환자들에서만 유의하게 높은 검출률을 보이진 않았다(p<0.08)(Fig. 1.(C))(Table.2.).유전자 재조합 단백에 대한 IgG 항체 검출은 A549 세포 안에 존재하는 cytokeratin 18단백과 -enolase단백을 이용한 결과와 유사 한 소견을 보였으나,A549 세포 단백을 이용한 실험 결과가 유전자 재조합 단백을 이용한 경우에 비해서 천식 환자와 정상 대조군간의 차이가 더 뚜렷 하였다.이에 본 연구에서는 A549 세포 전체 추출 단백질을 항원으로 하여 cytokeratin 18 단백과 -enolase 단백에 대한 IgG 항체 검출 결과를 분석 하였다.

(24)

F F Fiiiggg...111...IIImmmmmmuuunnnooobbbllloootttaaannnaaalllyyysssiiisossoofffccciiirrrcccuuulllaaatttiiinnnggg IIIggGgGG aaauuutttoooaaannnttitiibbbooodddiiieeessstttoooaaaiiirrrwwwaaayyy e e epppiiittthhheeellliiiaaalllccceeellllll((A(AA555444999)))ppprrrooottteeeiiinnnsss(((AAA)))aaannnddd rrreeecccooommmbbbiiinnnaaannnttthhuhuummmaaannn cccyyytttoookkkeeerrraaatttiiinnn 1 1 1888 ppprrrooottteeeiiinnn (((444999kkkDDDaa)a))(((BBB))) uuusssiininnggg ssseeerrruuummm sssaaammmpppllleeesss fffrrrooommm hhheeeaaalllttthhhyyy cccooonnntttrrrooolllsss,,,999 p p paaatttiiieeennntttsss wwwiiittthhh aaalllllleeerrrgggiiiccc aaasststthhhmmmaaa aaannnddd 111222 pppaaatttiiieeennntttssswwwiiittthhh nnnooonnnaaalllllleeerrrgggiiiccc aaasssttthhhmmmaaa. Results form serum samples of healthy controls (lane 1-3),patients with allergic asthma (lane 4-12),and patients with nonallergic asthma (lane 13-22),monoclonalantibody to cytokeratin 18 (lane 23),goat antibody to alpha-enolase(lane24).

*Arrow indicatescytokeratin18protienlocalizedbythemononclonalantibody. **Arrow indicatesalpha-enolaseproteinlocalizedbygoatantibody.

(25)

F F Fiiiggg... 111... IIImmmmmmuuunnnooobbblllotoott aaannnaaalllyyysssiiisss ooofff ccciiircrrccuuulllaaatttiiingnngg IIIgggGGG aaauuutttoooaaannntttiiibbbooodddiiieeesss tttooo r r reeecccooommmbbbiiinannaattthhhuuummmaaannn αααα---eeennnooolllaaassseee ppprrrooottteeeiininn (((555555kkkDDDaaa)))(((CCC)))uuusssiiingnngg ssseeerrruuummm ssasaammmpppllleeesss f f frrrooommm hhheeeaaalllttthhhyyy cccooonnntttrrrooolllsss,,,999 pppaatattiiieeennntttsss wwwiiittthhh aaallllllereerrgggiiiccc aaasssttthhmhmmaaa aaannnddd 111222 pppaaatttiiieeennntttsss w w

wiiittthhh nnnooonnnaaalllllleeerrgrggiiiccc aaasssttthhhmmmaaa.Results form serum samples ofhealthy controls (lane 1-3),patients with allergic asthma (lane 4-12),and patients with nonallergicasthma (lane13-22),monoclonalantibody to cytokeratin 18 (lane 23),goatantibodytoalpha-enolase(lane24).

*Arrow indicatescytokeratin18protienlocalizedbythemononclonalantibody. **Arrow indicatesalpha-enolaseproteinlocalizedbygoatantibody.

(26)

T T Taaabbbllleee 222.. I.IImmmmmmuuunnnooobblbllooottt dddeeettteeeccctttiiiooonnn rrreeesssuuullltttsss oofoff IIIgggGGG aaauuuttotooaaannntttiiibbbooodddiiieeesss tttooo c c cyyytttoookkkeeerrraaatttiiinnn 111888 ppprroroottteeeiiinnn aaanndndd ---eeennnooolllaaassseee ppprrrooottteeeiiinnn iiinnn hhheeeaaalllttthhhyyy cccooonnntttrrrooolllsss,,, p p paaatttiiieeennntttsss wwwiiittthhh aaallllleleerrrgggiiiccc aaasssttthhhmmmaaa aaannnddd pppaaatttiiieeennntttsss wwwiiittthhh nnnooonnanaalllllleeerrrgggiicicc aaasssttthhhmmmaaa u u usssiiinnnggg aaaiiirrrwwwaaayyy eeepppiiittthhheeellliiiaaalllccceeellllll(((AAA555444999)))ppprrrooottteeeiiinnnsss...

Groups No. Sex Age FEV1% Cytotoxi

-city(%)

Immunoblotdetectionof autoantibodiestoA549cells Cytokeratin18 -enolase Healthy controls 1 M 24 104 12.7 - -2 M 20 89 14.3 - -3 M 24 107 15.8 - -4 M 64 139 11.7 - -5 M 63 121 7.9 - -6 M 51 120 6.2 - -7 M 27 103.2 6.7 - + 8 F 74 112 7.7 - -9 F 35 125 9.2 - -10 F 66 98 7.1 - -11 F 57 99 7.5 - -12 F 60 84 7.4 - -Allergic asthma 13 M 19 73 11.3 - -14 M 23 78 14.6 - -15 M 20 76 9.5 - -16 M 27 93.7 13.3 - -17 M 19 28 11.9 - -18 F 31 96.5 6.7 - -19 F 34 82 15.3 - + 20 F 21 82.8 16.3 + -21 F 29 85.8 13 - -Nonallergic asthma 22 M 20 56.8 20.3 - ++ 23 F 67 46.7 28.2 +++ -24 M 34 41.9 19.3 ++ -25 F 22 71.4 22.7 - +++ 26 M 33 89 29.2 ++ -27 M 62 50.5 19.9 + -28 F 67 33.6 33.4 ++ -29 F 36 46.7 18.7 - + 30 F 39 78.5 22.6 - +++ 31 F 64 77 20.8 +++ +++

(27)

(- :negative,+ :weak positive,++ :positive,+++ :strong positive) C

C

C...PPPrrrooottteeeiiinnnAAA cccooollluuummmnnn을을을 이이이용용용한한한 IIIgggGGG 항항항체체체 순순순수수수 분분분리리리 및및및 확확확인인인

연구 대상 환자들의 혈청이나 혈장으로 부터 protein A mini spin column을 이용하여 분리한 IgG 항체의 순수도를 사람면역글로불린 IgG를 표준 시약으로 하여 SDS-PAGE와 Coomassieblue염색을 통해서 분석한 결과 약 90%이상의 순도를 지니는 것을 확인할 수 있었다(Fig.2). 또한 분 리된 IgG의 총량을 단백질 정량을 통해서 계산한 결과 전체 투입된 IgG의 40-50%가 회수되었음을 확인할 수 있었다.최종적으로 분리된 IgG 항체의 농도는 검체마다 조금씩 차이가 있으나 대략 10-15mg/ml의 농도로 분리되 었다.일부 5 mg/ml이하의 IgG 농도를 보이는 검체의 경우 centrifugal filterdevices(Millipore,Bedford,MA)을 이용하여 20mg/ml이상의 농도가 되도록 농축하였다. D D D...TTTeeerrraaasssaaakkkiiippplllaaattteee를를를 이이이용용용한한한 mmmiiicccrrroooccycyytttoootttoooxxxiiiccciiitttyyy aasasssssaaayyy방방방법법으법으으로로로 세세세포포포독독독성성성 측 측 측정정정

Terasakiplate를 이용한 microcytotoxicity assay 법을 이용하여 천식 환자 및 정상대조군으로부터 분리된 IgG 항체를 이용하여 세포독성을 측정 하였다.먼저 정상인 2 명과 알레르기성 천식 환자 2명,비알레르기성 천식 환자 2 명의 순수 분리된 IgG를 이용하여 적정 IgG 희석배수를 정하기 위 해서 실험한 결과 IgG에 의한 세포독성의 경우 1mg/ml,0.2mg/ml에서 정 상인과 비알레르기성 천식환자간의 유의한 차이를 보였다 (p<0.05)(Fig.3). 순수한 IgG 항체 농도가 1mg/ml조건에서 정상인과 비알레르기성 천 식간의 차이가 극대화되는 것에 근거하여 이 조건으로 실험을 진행하였다. 12명의 정상대조군,9명의 알레르기성 천식 환자,그리고 10명의 비알레르기

(28)

F F Fiiiggg...222... AAAnnnaaalllyyysssiiisssooofffhhhuuummmaaann InIIgggGGG aaannntttiibibbooodddiiieeessspppuuurrriiifffiiieeeddd uuusssiiinnnggg ppprrrooottteeeiiinnn AAA c c cooollluuummmnnn bbbyyy SSSDDDSS-S--PPPAAAGGGEE aE aannnddd CCCoooooommmaaassssssiiieee bbbllluuuee sesstttaaaiiinniniinnnggg...Purified human IgG (lane1),IgG antibodiespurified from nonallergicasthmaserum (lane 2-3)andIgG antibodiespurifiedfrom healthy controlserum (lane4-5).

(29)

F F Fiiiggg... 333... MMMeeeaaasssuuurrreeemmmeeennnttt ooofff IIIgggGGG aaauuutttoooaaannnttitiibbbooodddyyy--i-iinnnddduuuccceeedd cd ccyyytttoootttoooxxixiiccciiitttyyy tttooo a a aiiirrrwwwaaayyy eeepppiiittthhheeellliiiaaalllccceeellllllsssuuusssiiinngngg mmmiiicccrrrooocccyyytttoootttooxoxxiiiccciiitttyy ayaassssssaaayyy...

(30)

성 천식 환자의 혈청을 이용하여 세포독성을 측정하였더니 정상대조군이나 알레르기성 천식환자들에 비해서 비알레르기성 천식 환자의 혈청 IgG 항체 에 의한 기도상피세포 독성이 유의하게 높음을 확인할 수 있었다 (p<0.01)(Fig.4).또 한 가지,최초에 항체 뿐 아니라 보체를 첨가할 경우 IgG 항체에 의한 상피세포독성이 항진될 것으로 추정하였으나,현재까지의 반복된 실험결과로는 보체를 첨가하는 것이 유의하게 세포독성을 증가시킨 다는 차이를 증명하기 어려워 여러 가지 방법으로 이를 재검증하고 있는 중 이다. F F Fiiiggg... 444... MMMeeeaaasssuuurrreeemmmeeennnttt ooofff IIIgggGGG aaauuutttoooaaannntttiiibbbooodddyyy iiinnnddduuuccceeeddd cccyyytttoootttoooxxxiiiccciiitttyyy tttooo a a aiiirrrwwwaaayyy eeepppiiittthhheeellliiiaaalll ccceeellllllsss uuusssiiinnnggg pppuuurrriiifffiiieeeddd IIIgggGGG aaauuutttoooaaannntttiiibbbooodddiiieeesss fffrrrooommm 1 1 1222 hhheeeaaalllttthhhyyy cccooonnnttrtrrooolllsss (((CCOCOONNN))) ,,, 999 pppaaatttiiieeennntttsss wwwiiittthhh aaalllllleeerrrgggiiiccc aaasssttthhhmmmaaa ( ( (AAAAAA))),,, aanannddd 111000 pppaatattiiieeennntttsss wwwiiittthhh nnnooonnnaaalllllleeerrrgggiiiccc aaasssttthhhmmmaaa (((NNANAAAAA))) bbbyyy m m miiicccrrroooccycyytttoootttoooxxixiiccciiitttyyy aaassssssaaayyy...

(31)

E E

E...IIIgggGGG 자자자가가가 항항항체체체에에에 의의의한한한 기기도기도도상상상피피피세세세포포포 독독성독성성 반반반응응응의의의 억억억제제제

대장균에서 대량으로 분리,정제한 유전자 재조합 단백질 cytokeratin 18과 α-enolase의 특이도를 알아보기 위해 음성 대조군으로 사람 알부민을 사용하여 전기영동(SDS-PAGE)과 immunoblot을 통해서 분석한 결과 약 90%이상의 순 도를 갖는다는 것을 알 수 있었다 (Fig.5). F F Fiiiggg... 555... AAAnnnaaalllyyyssisiisss ooofff rrreeecccooommmbbbiiinnanaannnttt hhhuuummmaaannn cccyyytttookokkeeerrraaatttiininn 111888 aaannnddd r r reeecccooommmbbibiinnnaaannnttt hhhuuummmaaannn αααα--e-eennnooolllaaassseee ppprrroootteteeiiinnn bbbyyy SSSDDDSSS---PPPAAGAGGEEE aaannnddd C C

Coooooommmaaassssssiiieee bbbllluuueee ssstttaaaiiinniniinnnggg...Result form HSA (human serum albumin, 67kDa) (lane 1), recombinant human α-enolase protein (55kDa)(lane 2), recombinant human cytokeratin 18 and glutathione-S-transferase(GST) fusion protein(75kDa)(lane3).

(32)

또한 대장균에서 분리,정제한 유전자 재조합 단백질이 기도상피세포 추출 단백질과 동일한 것인지를 확인하기 위해 cytokeratin18단백과 α-enolase단백 에만 결합하는 특이적 항체를 사용하여 immunoblot을 시행한 결과 유전자 재조 합 단백이 기도상피세포 추출 단백과 동일한 단백임을 확인할 수 있었다 (Fig. 6) F F Fiiiggg... 666... IImImmmmmuuunnnooobbblllooottt aaannnaaalllyyysssiiisss ooofff rrereecccooommmbbbiiinannaannnttt ppprrrooottteeeiiinnn bbbyyy sssppepeeccciiifffiiiccc a a

annntttiiibbbooodddiiieeesss...Mouse monoclonalantibody to cytokeratin 18 protein (A),Goat polyclonalantibodyto-enolaseprotein (B).

(33)

비알레르기성 천식 환자의 혈액으로부터 분리한 IgG 항체를 GST가 결합 된 상태의 유전자 재조합 사람 cytokeratin 18 단백질과 유전자 재조합  -enolase단백질 25μg으로 미리 흡착시킨 경우,대조 항원인 동량의 사람 알부 민(human serum albumin)과 GST가 결합된 상태의 유전자 재조합 사람 cytokeratin 8 단백질 25μg에 흡착시킨 경우에 비해서 IgG 항체 125μg에 의한 세포독성을 유의하게 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다 (p<0.05)(Fig.7,8).

이러한 실험 결과는 비알레르기성 천식환자의 IgG 항체에 의한 기도상피 세포독성이 cytokeratin18단백질과 -enolase단백질에 대한 자가항체에 의함 을 증명하는 결과로 판단된다.

(34)

F F Fiiiggg... 777... IIInnhnhihiibbbiiitttiiionoonn ooofff IIIgggGGG aaannntttiiibbbooodddyy-y--mmmeeedddiiiaaatteteeddd cccyyytttoootttooxoxxiiiccciiitttyyy ttotoo aaaiiirrrwwwaaayyy e e epppiiittthhheeellliiaiaalllccceeellllll(((AAA555444999)))ppprrrooottteeeiiinnnsssuuusssiiinnnggg pppuuurrriiifffiiieeeddd hhhuuummmaaannn ccycyytttoookkkeeerrraaatttiiinnn 111888aaannnddd h h

huuummmaaannn ---eenennooolllaaassseee aaauuutttoooaaannntttiiigggeeennnsss...Inhibition ofIgG-mediated cytotoxicity to airway epithelialcellby preadsorption ofpurified IgG antibodies from four patientswith nonallergicasthmawho haveIgG autoantibodiestocytokeratin 18protein (A,B)and-enolase protein (C,D)using human serum albumin (HSA),recombinanthuman α-enolaseprotein,recombinanthuman cytokeratin 8protein(CK-8)andrecombinanthumancytokeratin18protein(CK-18). *Significantdifferencescomparedtoadsorptionsbyotherproteins(p<0.05, t-test).Datawerepresentedasmeanandstandarddeviationsofquadruplicated measurements.

(35)

F F Fiiiggg... 888... MMMiiicccrrrooossscccooopppiiiccc eeexxxaaammmiiinnnaaatttiiiooonnn ooofff cccuuullltttuuurrreeeddd aaaiiirrrwwwaaayyy eeepppiiittthhheeellliiiaalall ccceeellllllsss ( ( (AAA555444999))) iiinnncccuuubbbaaattteeedd wd wwiiittthhh pppuuurririifffiiieeeddd IIIggGgGG aaauuutttoooaaanntnttiiibbbooodddyyy fffrrrooommm nnnooonnnaaalllllleeerrrgggiiiccc a a

asssttthhhmmmaaa pppaaatttiiieeennntttsss...Inhibition ofhuman serum albumin (HSA)(A,E),inhibition ofα-enolaseprotein(B,F),inhibitionofcytokeratin8protein(CK-8)(C,G)and inhibition ofcytokeratin 18 protein (CK-18)(D,H).Sample ofcytotoxicity to recombinanthumancytokeratin18protein(A,B,C,D),sampleofcytotoxicityto recombinanthuman α-enolaseprotein(E,F,G,H).

(36)

Ⅳ.

.

.고

고 찰

본 연구에서 연구자는 비알레르기성 기관지 천식 환자의 혈청 내에 존재 하는 기도상피세포 단백질에 대한 IgG 항체가 정상인이나 알레르기성 천식 환자 들 보다 더 유의하게 실험실 조건에서 배양된 기도상피세포 (A549세포주)에 대 한 독성 반응을 일으킨다는 것을 확인 할 수 있었다.이러한 세포 독성 반응이 비알레르기성 천식 환자에게 기도상피 조직의 손상과 기도점막조직의 만성 염증 반응을 유발하는데 기여할 수 있을 것으로 판단된다. 또한 본 실험은 비알레르 기성 천식이 자가항체에 의한 자가면역질환이라는 것을 시사하는 근거를 제공할 수 있을 것으로 판단된다. 기관지 천식은 기관지 점막 조직의 염증으로 인하여 호흡 곤란 증상이 유 발되는 만성 염증성 질환으로 아직 정확한 발병 원인이 규명되지 못하여 완치 방법이 없는 상태이다.알레르기성 천식은 원인 알레르겐에 대한 노출을 회피하 거나 이에 대한 면역 반응을 조절하는 알레르겐 면역치료를 시행하여 근본적으 로 질병을 조절할 수 있다고 알려져 있으나,비알레르기성 천식은 임상적으로 중 증인 경우가 많고 더 강도 높은 약물 치료를 요구함에도 불구하고 현재로서는 원인적인 치료가 불가능한 상태이다 (GlobalInitiativeforAsthma,2002). 비알레르기성 천식의 병인은 과거 여러 연구자들에 의해 자가면역기전이 관여할 것이라는 가능성이 제시되어 왔다 (GlobalInitiativeforAsthma,2002).또 한 비알레르기성 천식의 자가면역 병인가설을 뒷받침하는 근거로는 유전자 분석 상 전형적인 비알레르기성 천식 환자의 임상 양상의 하나인 아스피린-과민성 천 식 환자(아스피린 복용시 급성천식 발작이 발생하는 천식 환자)들의 유전자를 분 석한 결과 HLA-DPB1*0301유전자의 빈도가 정상인이나 알레르기성 천식 환자 들에 비해 유의하게 높았다 (Dekker,1997).동일한 유전자는 이미 자가 면역 질 환으로 알려진 제 1형 당뇨병,다발성 경화증(multiplesclerosis),원발성 담도 경

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화증(primary biliary cirhosis),류마티스 관절염(rheumatoidarthritis)등의 질환 들에서 주요 연관 유전자로 밝혀진 상태이다.그리고 기관지천식이 있는 환자들 에서 제 1형 당뇨병,갑상선염,류마티스 관절염 등과 같은 자가면역질환이 같이 발병될 위험이 높다고 보고되었다 (Sheikh,2003).또한 이러한 염증 반응은 비알 레르기성 천식환자의 기도뿐만 아니라 폐실질 (lung parenchyma),혈관 (blood vessels),침샘 (salivary glands),장점막 (intestinalmucosa)에서도 나타난다 (Kraft,1996;Saetta,1991;Wallaert,1994;Wallaert,1995).기관지천식 환자들 중의 일부는 호중구 세포질 단백에 대한 자가 항체 (antineutrophilcytoplasmic autoantibody: ANCA)와 연관된 전신성 혈관염의 일종인 Churg-Strauss syndrome으로 진행됨이 밝혀져 있다 (Ramakrishna,2001).또한 T세포 및 cytokine연구에서 비알레르기성 천식 환자들에게 시행한 기관지폐포 세척액 내 T세포 및 cytokine에 대한 분석 결과 알레르기성 천식과는 다른 면역 활성의 양 상(활성화된 CD8+ T세포 수의 증가,IL-2농도의 증가)을 보이고 있으며,이는 자가면역질환에서 관찰되는 양상과 가장 유사하다고 보고되었다 (Virchow, 1996).그리고 비알레르기성 천식 환자의 기관지폐포 세척액내에 존재하는 T세 포의 TCR 유전자를 분석한 결과 clonalexpansion소견을 보여 특정 항원에 의 한 활성화가 시사되었다 (Umibe,2000).또한 기존의 기관지천식 환자들의 혈청 검체를 이용한 연구들 대부분에서 비알레르기성 천식에서 알레르기성 천식에 비 해 혈청내 평활근 조직,혈관내피세포,기관지점막 조직 등에 대한 자가항체의 양성율이 유의하게 증가 되어 있음이 보고되었다 (Lidor,1980;Lassalle,1993; Girard,1973).그리고 치료적 측면에서 보았을 때 비알레르기성 천식 환자들에 서 자주 관찰되는 난치성 중증 66h천식의 경우 정맥용 면역글로불린 제재, cyclosporinA 그리고 methotrexate,혈장교환술(plasmapheresis)등과 같은 자가 면역질환에서 사용되는 면역조절 약물이나 치료법이 임상적으로 효과가 있음이 보고되었다 (Lock,1996).또한 기도 상피 조직이외에 다른 인체의 상피조직에

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만성 염증반응을 보이는 대부분의 질환들(atrophic gastritis,ulcerative colitis, pemphigus,primary biliary cirrhosis등)에서 상피세포에 존재하는 단백질 항원 에 대한 자가면역 반응이 병인기전에 관여함이 증명되었다 (Roitt,1991). 하지만 이러한 근거들만을 바탕으로 실제로 자가면역 반응이 비알레르기 성 천식의 발병기전에 관여한다고 증명하기에는 논리적으로 부족한 상태이다.일 반적으로 자가면역기전이 질병의 병인기전에 관여함을 증명하기 위해서는 동물 에게 자가항원을 주사하여 자가면역반응을 유도하고,이에 따라 그 질병에 합당 한 소견들이 동물에게서 발생됨을 증명하여야한다 .그런데 최근 비알레르기성 천식 환자에서 기관지상피세포 단백에 대한 IgG 항체가 검출되며,비알레르기성 천식환자들의 병인기전에 관여할 것이라고 생각되는 자가항원인 cytokeratin 18 단백과 중증 천식을 진단 할 수 있는 새로운 생물학적 지표인 -enolase 단백 이 밝혀졌다 (Nahm,2002;Nahm,2006).비알레르기성 천식 환자들의 혈액 에서 검출되는 cytokeratin 18단백질과 -enolase단백질에 대한 IgG 항체 는 2가지 다른 관점으로 해석될 수 있다고 생각된다.첫째,기관지 천식의 임상적인 중증도와 기도 조직에 대한 자가항체의 검출간의 연관성에 대한 과거의 보고들을 고려하여 보았을 때, 기관지 천식 환자의 혈청 내 cytokeratin 18 단백과 -enolase단백에 대한 IgG 항체는 기도의 염증반응 에 의한 기도상피세포의 손상을 반영하는 일종의 부수적인 동반 현상 (epiphenomenon)으로 해석될 수 있다.둘째,비알레르기성 천식 환자들 중 일부에서 cytokeratin 18 단백과 -enolase 단백에 대해 IgG 항체 반응을 보이며,이들 환자에서 기도상피세포 단백질에 대한 자가면역반응이 기관지 천식의 병인기전에 관여할 가능성이 있다고 해석될 수 있다.이러한 자가항 체-자가항원의 면역복합체가 염증세포를 활성화 시키고 기도상피세포에 대 해 세포 독성을 나타냄으로서 기관지천식 환자들에게 만성 염증을 유발할 것으로 판단된다.또한 최근에는 본 실험자가 시행한 방법과는 조금 다르지

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만 혈청을 이용하여 세포 독성을 측정한 SARS (severe acute respiratory syndrome)의 병인기전도 자가항체에 의한 자가면역반응이라는 문헌이 이미 발표된바 있다 (Yang,2005).SARS 역시 coronavirus에 감염되고 나면 상 피,내피세포와 결합한 자가항체가 보체를 활성화 시키며,이들에 의해 폐의 상피와 혈관이 손상될 뿐만 아니라 보체와 자가항체에 의한 세포 독성으로 인해 세포가 사멸되기도 한다 (Bordron,2001;Lin,2003;Worda,2003).이 러한 자가항체는 다른 상피 및 내피세포에도 손상을 줄 것이라 생각되며,이 러한 반응은 SARS 뿐 아니라 다른 자가면역질환을 이해하는데 있어 중요 한 면역학적 실마리를 제공할 것으로 생각된다.이에 본 연구자는 이러한 논 란점에서 자가면역기전이 비알레르기성 천식의 병인에 관여한다는 가설을 증명하기 위한 수단으로서 비알레르기성 기관지 천식 환자 혈청에서 순수 분리한 IgG 항체에 의한 cytotoxicity를 확인하였다.

앞서 말한 SARS 환자의 자가항체에 의한 세포독성에 대한 논문과 마찬가 지로 과거의 기도 및 폐 조직을 이용한 자가항체 연구들에서 자가항체가 보체를 활성화 시키며, 이런 보체 활성화를 유도하는 자가항체(complement-fixing autoantibodies)를 정량적으로 측정할 경우 자가항체의 역가가 높을수록 천식의 임상적인 중증도가 높다고 보고되었다.이에 연구자는 최초에 자가항체 뿐 아니 라 보체를 첨가 할 경우 IgG 항체에 의한 기도 상피 세포 독성이 항진 될 것으 로 추정하였으나,현재까지의 반복된 실험 결과 워낙에 붙어 자라는 A549세포 에 trypsin-EDTA를 처리하여 떼어낸 후,보체를 농도 별로 처리 하였더니 보체 만 넣어도 세포가 죽어서 보체를 첨가하는 것이 유의하게 세포 독성을 증가시킨 다는 차이를 증명하기가 어려웠다.또한 비알레르기성 천식 환자의 혈청으로부터 분리한 IgG 항체를 유전자 재조합 사람 cytokeratin 18단백질과 유전자 재조합 사람 -enolase단백질을 이용하여 미리 흡착시킨 경우가 대조 항원인 동량 의 사람 알부민(human serum albumin)에 미리 흡착시킨 경우에 비해서

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IgG 항체에 의한 세포 독성을 유의 하게 억제할 수 있었다.이것은 기도상 피세포 단백질인 cytokeratin18단백질과 -enolase단백질이 IgG 항체와 반 응하는 비알레르기성 천식과 연관된 주된 기도 상피세포 자가항원 단백질임 과 더불어 IgG 항체가 비알레르기성 천식 환자의 기도상피세포에 독성을 일 으킬 수 있다는 것을 다시 한 번 증명하는 결과라 생각된다. 그리고 immunoblot검사법을 이용한 실험 결과가 Terasakiplate를 이용하여 세포 독성을 실험한 결과와 일치하는 것으로 보아 역시 비알레르기성 천식 환자 에게 기도상피세포 단백질에 대한 IgG 항체가 정상인이나 알레르기성 천식 환자에 비해 유의하게 높음을 알 수 있었다.이에 본 연구자를 포함한 많은 연구자들은 비알레르기성 천식에서 기도상피세포 단백질에 대한 항체 반응이 자 가면역반응의 병인기전일것이라 판단한다.하지만 아직 이러한 기관지천식의 “자 가 면역 병인 가설”을 뒷받침할 만한 명확한 실험적 근거가 없는 상태이다.천식 의 병리 소견 중 기관지 과민증 역시 기도상피세포의 탈락으로 인한 증후군으 로 생각되지만 아직 명확한 실험적 근거가 없는 상태이다.하지만 본 실험에서 비알레르기성 천식 환자의 IgG 항체가 실험실내의 기도상피세포 (A549세포주) 에 독성을 일으키는 것은 비알레르기성 천식의 자가면역 가설을 지지하는 증거 를 제시한다고 판단된다.그러나 이러한 항체 반응 만으로는 비알레르기성 천식 이 기도상피세포에 대한 자가 면역질환이라는 것을 증명하기가 어렵고 향후 동 물실험을 통해서 기능적 중요성이 증명되어야 할 것이다. 본 연구자는 방법론적으로 microcytotoxicity assay를 시행하였다.최근에 는 LDH (lactate dehydrogenase) assay나 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol -2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay로 자가항체에 의한 세포독성을 정량적으로 측정하는 추세이다.그러나 연구자가 예비 실험을 시행한 결과 LDH assay나 MTT assay는 seeding되는 cell수가 많아 많은 양의 자가항체가 필요 했으며,매 실험마다 결과의 재현성이 떨어져 microcytotoxicity assay방법을 사

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용하기로 했다.Terasakiplate를 이용한 microcytotoxicity assay 법은 1964 년(Terasaki와 Mcclelland,1964)에 검사방법이 개발된 이후 현재까지 장기 이식 전에 시행하는 필수 HLA cross-matching 검사의 하나로서 대다수의 병원에서 실제적으로 사용되고 있다.예를 들어 콩팥 이식 수술 전에 공여자 (donor)의 lymphocyte에 존재하는 HLA 항원에 대한 IgG 항체를 수여자 (recipcent)가 가지고 있을 경우 신장 이식시 항체에 의한 급성 거부반응이 일어날 가능성이 있어 이를 미리 예측하기 위한 방법으로 사용된다.문헌조 사결과 이미 이러한 microcytotoxicity 검사법을 응용하여,혈청을 이용하여 기도상피세포인 A549에 대한 cytotoxicity를 알아보기 위한 방법(Mistry, 1993)이 보고되어 있었다.하지만 이 방법은 눈으로 판독해야 해서 LDH assay나 MTT assay 보다 객관적이지 못하지만 본 실험은 quadruplicate를 시행하여 실험간 오차 (2-5% 미만)가 적으며,재현성이 높아 판단된 실험결 과를 믿을 수 있었다.

앞서 설명한 SARS 문헌에서는 방법론적으로 환자의 혈청을 사용하여 세포 독성을 보았기 때문에 세포 독성 여부가 IgG 항체에 의한 것인지 IgM 또는 IgA 항체에 의한 것인지를 감별하기가 힘들었다.그래서 본 실험자는 IgM 과 IgA 항체의 영향을 줄이기 위해 IgG 항체만 순수 분리하여 사용하 였다.그리고 대장균에서 정제한 유전자 재조합 자가 항원 단백을 사용하여 IgG 항체를 미리 흡착시켜본 결과 세포 독성이 줄어드는 것을 확인할 수 있 었다. 본 연구자는 실험 결과 비알레르기성 기관지 천식 환자의 혈청 내에 존재 하는 기도상피세포 단백질에 대한 IgG 항체가 기도상피세포에 대한 독성 반응을 일으킨다는 것을 확인 할 수 있었으며,이것은 비알레르기성 천식이 자가항체에 의한 자가면역질환이라는 것을 시사하는 중요한 계기가 될 것으로 생각된다.또 한 대장균에서 정제한 유전자 재조합 자가 항원 단백인 사람 cytokeratin 18

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단백질과 유전자 재조합 사람 -enolase단백질을 사용하여 IgG 항체를 억제 해본 결과 세포 독성이 줄어드는 것을 확인할 수 있었고,이것은 기도상피세 포 단백질인 cytokeratin18단백질과 -enolase단백질이 IgG 항체와 반응하 는 비알레르기성 천식과 연관된 주된 기도 상피세포 자가 항원 단백질임과 더불어 IgG 항체가 비알레르기성 천식 환자의 기도상피세포에 독성을 일으 킬 수 있다는 것을 확인한 결과로 판단된다.

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Ⅴ.

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.결

결 론

이상의 결과로 보아 비알레르기성 기관지천식 환자의 혈청 내에 존재하는 기도상피세포 단백질에 대한 IgG 항체가 기도상피세포에 대해 독성 반응을 일으 킨다는 것을 확인 할 수 있었다.또한 대장균에서 정제한 유전자 재조합 자가 항원 단백인 사람 cytokeratin18단백질과 유전자 재조합 사람 -enolase단백 질을 사용하여 IgG 항체와 반응시켜본 결과 세포 독성이 줄어드는 것을 확 인할 수 있었고 이것은 기도상피세포 단백질인 cytokeratin 18 단백질과  -enolase 단백질이 IgG 자가항체와 반응하는 비알레르기성 천식과 연관된 주된 기도 상피세포 자가항원 단백질임과 더불어 각각의 자가 항원에 대한 IgG 항체가 기도상피세포에 독성을 일으킬 수 있다는 것을 다시 한 번 증명 하는 결과라 생각된다.또한 이러한 결과들은 비알레르기성 천식이 자가항체 에 의한 자가면역질환이라는 것을 시사하는 것으로 판단되며,이것은 in vitro 상에서 비알레르기성 천식을 진단하고 근본적으로 치료하는데 있어 중요한 자료가 될 것으로 생각된다.하지만 이것은 향후 동물실험을 통해서 기능적 역할이 입증되어야 할 것이다.

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참고

고 문

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ByulKwon

DepartmentofMedicalSciences TheGraduateSchool,AjouUniversity

(SupervisedbyAssociateProfessorDongHoNahm)

RATIONALE:IncreasedlevelsofIgG autoantibodiestoairway epithelial cells in serum samples ofnonallergic asthma compared to allergic asthma and healthy controls have been reported. And a possible involvement of autoimmune response against bronchial epithelial cell antigen in the pathogenesis of nonallergic asthma has been suggested. To evaluate a functionalsignificance ofautoimmune response to airway epithelialcells in the pathogenesis ofnonallergic asthma,we examined autoantibody-mediated cytotoxicity to airway epithelial cells using purified IgG antibodies from patientswithnonallergicasthma.

METHODS: IgG antibodies were purified from patients with nonallergic asthma using by protein A column.IgG antibody-mediated cytotoxicity to cultured human airway epithelial cells (A549) was examined by microcytotoxicity assay using Terasaki tray. The cytotoxicities were

수치

그림 림 림 차 차 차례 례 례
표 차 차 차례 례 례

참조

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