Critical C-termical Amino Acids of Hepatitis B Virus Core Proteins for HBV Replication

(1)

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i

-국문요약-

Hepatitis B virus 의

의

의 Replication 에

에

중요한

중요한 Core 단백질의

단백질의

단백질의 아미노산

아미노산

아미노산 규명

규명

B 형 간염 바이러스는 Hepadnaviridae Family 로써, 크기가 3.2kb 인 partieally duplex DNA genome 을 가지고 있으며, 4 개의 open reading frame (ORF)으로부터 core protein, surface protein, DNA polymerase, X protein 을 발현한다. HBV core protein 은 183 개 또는 185 개의 amino acid 로 구성되어있는 22kDa 의 단백질이며, HBV core protein 은 pgRNA 의 encapsidation 및 DNA 합성에 관여하는 것으로 알려져 있다. HBV core protein 은 기능적으로 두 부위로 나뉜다. core particle 조립에 관여하는 core protein 의 N-말단부위와 핵산과 결합하는 부위인 C-말단부위로 나뉜다. Core protein 의 N-말단부위 (amino acid 1-149)만으로도 core particle 을 이루지만 pgRNA 는 encapsidation 을 하지 못한다.

이전 연구는 HBV core protein 의 C-말단을 DHBV core protein 으로 치환한 다양한 mutant 를 이용한 실험을 하였다. 이들 중에 DHBV core 의 242-250 번 9 개의 amino acid 를 HBV core 의 167-175 번으로 치환한 chimeric core HDHD 의 DNA 합성을 확인하였을 때, HBV RC (relaxed circular) DNA 를 합성하는 것으로 관찰되었다. Chimeric core protein HD 221-262 을 기본으로 하여 HDHD chimeric core protein 과 반대로 242-250 번의 9 개 amino acid 를 제외하고 나머지를 HBV core 로 치환한 chimeric core protein HHDH 에서는 HD221-262 와 유사한 양상인

(6)

ii

single strand DNA 를 비롯하여 relaxed circular DNA 와 double strand DNA 가 합성되고, 그 외에 작은 크기 DNA 합성이 관찰되었다. HHDH 의 mutant core protein 의 DHBV 의 부분 (amino acid 243 arginine, alanine, serine, proline, leusine,

proline, arginine, serine 251)과 그 부위에 해당하는 HBV 의 부분 (amino acid 168

arginine, arginine, arginine, serine, glutamine, serine, proline, arginine, arginine 176)을 비교 하였을 때 9 개의 amino acid 중에 4 개의 amino acid (amino acid 168, 171, 174, 175) 가 일치하고 5 개의 amino acid (amino acid 169, 170, 172, 173, 176) 가 달랐다. 따라서 본 연구에서는 5 개의 amino acid 를 하나씩 HBV core protein 의 amino acid 로 치환시켜 5 개의 새로운 chimeric core protein mutant 를 cloning 하여 HBV DNA 복제에 어떠한 amino acid 가 관여하는지 밝히고자 하였다. HHDH 의 DHBV 부분의 9 개 amino acid 중에 HBV core protein 의 amino acid 와 다른 5 개의 amino acid 를 HBV 로 다시 치환하기 하는 point mutation 을 실시하기 위해, PCR 을 이용하여 site-direted mutagenesis 를 실시하였다. 5 개의 DHBV core protein amino acid 중에 첫 번째 amino acid 인 alanine 을 arginine 으로 (A169), 두 번째 amino acid 는 glycine 에서 arginine 으로 (G170R), 세 번째 amino acid 는 proline 에서 glutamine 으로(P172Q), 네 번째 amino acid 는 leusine 에서 serine 으로 (L173S), 다섯 번 째는 serine 을 arginine 으로 (S176R) 전환하는 PCR 를 실시하여, 각각 하나씩 전환시킨 mutant 로 cloning 하여 새로운 chimeric core protein 을 만들었다. 5 개의 새로운 chimeric core protein 의 HBV DNA 합성을 확인한 결과, G170R 과 S176R chimeric core protein 이 각각 HBV wild type 과 비슷한 양상으로 HBV DNA 를 합성하였다.

(7)

iii

결과적으로 HBV DNA replication 에 core 의 말단이 관여 하고, core 의 C-말단에서도 G170R 과 S176R 이 HBV DNA replication 에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

핵심어 핵심어 핵심어

(8)

iv

차

차 례

례

_례

국문 요약 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ ⅰ 차례 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ ⅳ 그림 차례 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ ⅵ Ⅰ. 서론 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 1 A. B 형 간염 바이러스의 증식 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 1 B. B형 간염 바이러스 core protein 및 core particle ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 2 C. Chimeric core protein 에 의한 HBV replication 변화 ‥‥‥‥‥‥‥‥ 3

Ⅱ. 재료 및 방법

A. HBV plasmid DNA construction ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 7 B. 세포 배양 및 transfection ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 8 C. Core particle 의 분리 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 9 D. Encapsidation Assay ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 9 E. Southern blotting ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 10 F. Core particle 의 Western blotting ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 10 G. Endogenous polymerase assay (EPA) ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 11 Ⅲ. 결과 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 12 A. Chimeric core construction 과 core particle 의 형성 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 12 B. HBV pregenomic RNA 의 encapsidation 양상 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 13 C, Chimeric core particle 의 Endogenous polymerase 활성측정 ‥‥‥‥‥ 16 D. Chimeric core protein 에 따른 HBV DNA replication 양상 ‥‥‥‥‥ 17

(9)

v

Ⅳ. 고찰 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 21 참고문헌 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 24 ABSTRACT ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 28

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vi

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례

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례

Fig. 1. Schematic diagram of core protein and HBV replication by chimeric core

protein ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 5

Fig. 2. Encapsidation assay of HBV pgRNA and western blot of core particle ‥‥ 15

Fig. 3. Endogenous Polymerase Assay (EPA) of chimeric core protein ‥‥‥‥‥ 19

(11)

１

I . 서

서

서 론

론

A. B 형형형형 간염간염간염간염 바이러스의바이러스의바이러스의바이러스의 증식증식증식 증식

Hepatitis B virus (HBV)는 작고, envelope 을 가지는 DNA virus 로써, 간세포에서 증식하며, 간암을 일으키는데 관여를 한다 (Wands 와 Blum, 1991). Hepadnavirus 의 원형인 HBV 는 partially double stranded DNA 를 가지고 있고, RNA 역전사 작용을 통해 replication 을 하는 virus 이다. HBV 에 감염되면 세포에 들어간 core particle 이 핵으로 이동하여 세포 내의 DNA polymerase 에 의하여 covalently closed circular DNA (ccc DNA) 가 된 후 바이러스의 mRNA 및 pregenomic RNA (pgRNA)를 합성하여 세포질에서 단백질을 합성한다. pgRNA 는 capsid (C) 와 polymerase (P)의 mRNA 로써 이용되고, 역전사의 주형으로써도 이용된다 (Ganem 과 Schmeider, 2001). 세포질에 있는 pgRNA 는 중합효소와 함께 core particle 내부로 들어가게 된다 (Bertenschlager 등, 1990; Hirsch 등 1990; Bartenschlager 와 Schaller, 1992). Subgenomic 2.4kb RNA 는 커다란 HBV 의 표면 항원(HBs antigen, HBsAg)을 발현시키기 위한 mRNA 이고, 2.1kb mRNA 는 중간크기와 작은 크기의 HBsAg 을 발현시키는 mRNA 이며, 0.7kb mRNA 는 HBx protein 을 발현시키기 위한 mRNA 로써 이용된다. HBV DNA polymerase 가 pgRNA 의 encapsidation (Ű) 신호를 인지하여 RNA-protein 복합체 (RNP, ribonucleoprotein) 를 이룬다 (Tavis 와 Ganem, 1996; Beck 과 Nassal, 1998; Tavis 등, 1998). Core protein dimer 가 삼차원적 구조를 이룬 RNA-protein 복합체를 싸서 core particle 을 이루면서 pgRNA 가 core particle 에 encapsidation 되어 미성숙한 core particle 을 이룬다. HBV DNA replication 는 DNA polymerase 의 말단 단백질(terminal protein, TP)부위의 tyrosine 의 OH 기가

(12)

２

Ű 신호의 bulge 구조를 주형으로 생성된 첫 번째 nucleotide 와 공유결합을 이루며 Ű 신호의 bulge 구조를 주형으로 처음 4 개의 nucleotides 를 합성하는 priming 반응이 일어나면서 이는 미성숙한 core particle 내부에서 시작된다 (Weber 등, 1994; Zoulim 과 Seeger, 1994; landford 등, 1997). 이러한 nucleotides 와 DNA polymerase 복합체는 pgRNA 의 3’말단의 direct repeat I (DR I) 염기서열로 이동되어 pgRNA 를 역전사하는 DNA 합성을 시작하여 완전한 (-) 가닥 DNA 를 합성하여 hepadnavirus 의 DNA 가 복제된다. HBV DNA 를 가지는 성숙한 core particle 은 세포질내의 세포막으로 지질 이중막(lipid bilayer)를 획득하여 virion 을 형성하거나 세포 핵으로 다시 되돌아간다. 세포 핵으로 성숙한 core particle 이 되돌아 가는 것은 세포 핵 내부의 HBV cccDNA 양을 유지시키기 위한 중요한 단계이기도 하다.

B. B 형형형형 간염간염간염 바이러스간염 바이러스바이러스바이러스 core protein 및및및 core particle 및

HBV nucleocapsid 의 조립에는 HBV 의 core protein, polymerase 와 pregenomic RNA (pgRNA)가 필요하다 (Hatton 등, 1992). Core particle 은 183 개 또는 185 개의 amino acid 으로 이루어져 있고, dimer 를 형성하여 core particle 로 조립을 한다 (Zhou 와 Sandring, 1992). Core particle 은 core protein 의 N 말단부위 (amino acid 1-144) 가 약한 결합으로 protein 간의 상호작용에 의해 core particle 조립한다 (Birnbaum 와 Nassal, 1990; Gallina 등, 1989). Core protein 의 C 말단부위는 nucleic acid 과 결합하는 부분으로 arginine 을 많이 가지고 있는 부분이다. 비록 core protein 의 C 말단이 capsid particle 조립에는 관여를 하지 않지만, pgRNA 의 encapsidation 과 관련하여 viral replication 에 관여를 하는 부위로 알려져 있다

(13)

３

(Gallina 등, 1989; Birnbaum 와 Nassal, 1990; Nassal, 1992; Beames 와 Landford, 1993;.Pogam 등, 2005). 하지만 여전히 C 말단의 어느 특정부분이 pgRNA 의 encapsidation 과 DNA replication 에 관여하는지 알려져 있지 않다.

C. Chimeric core protein 에에에 의한에 의한의한의한 HBV replication 변화변화변화변화

많은 연구들을 통해서 retrovirus 나 avian hepadnavirus 의 chimeric virus 들의 protein 부분의 기능과 virus 의 cis-acting 조각에 대해서 알려져 있다 (Berkowitz 등, 1995; Kaye 와 Lever, 1998; Certo 등, 1999; Kristin 등, 2004). 본 연구에서는 HBV replication 에 관여하는 nucleic acid binding 부위를 확인하기 위해, duck hepatitis B virus (DHBV) 를 이용하여 chimeric core protein 을 제작하였다. HBV 와 DHBV 는 상동성이 낮은 반면에, woodchuck HBV (WHBV)와는 60%의 상동성을 가진다. WHBV 와 달리 DHBV core protein 은 HBV 증식을 할 수 없다. 이전 실험에서 core protein 의 C 말단 일부를 DHBV 로 치환시킨 chimeric core protein 에 의해서 HBV 증식이 회복되는 것을 확인하였다. HBV core 단백질의 C 말단을 DHBV core 단백질로 치환한 다양한 chimeric core 단백질들 중에 HBV core 의 146 에서 185 번 아미노산 부분을 DHBV core 의 221-262 번 아미노산으로 치환한 chimeric core 단백질 HD 221-262 는 HBV single strand DNA 를 비롯하여 double strand DNA 와 relaxed circular DNA 를 합성하며 single strand DNA 보다 작은 크기의 DNA 도 합성하였다. Chimeric core protein HD 221-262 를 기본으로 하여 DHBV core 의 242-250 번 9 개의 아미노산을 HBV core 의 167-175 번으로 치환한 HDHD chimeric core protein 을 가진 HBV DNA 합성은 HBV wt (wild type) core protein 에서처럼 HBV RC (relaxed circular) DNA 가 합성 되는 것으로 관찰되었다. HDHD 와는 반대로 HBV core 의 168-176 번을 DHBV core 의 242-250 번으로 치환한 chimeric core

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４

protein 인 HHDH 에서는 HD 221-262 와 유사한 양상으로 HBV DNA level 이 낮게 나타났으며, HHDH 의 경우에는 모든 amino acid 가 HBV 이고 단지 168-175 번 9 개의 amino acid 만이 DHBV 였으나, HBV replication 은 현저하게 감소하였다. HHDH 의 mutant core protein 은 서로 다른 9 개의 아미노산 중 4 개의 아미노산이 일치하고 5 개의 아미노산이 서로 달랐다(Fig. 1.). 즉, 이 5 개의 다른 amino aicd 가 HBV replication 을 현저히 감소시킬 것으로 생각 되어진다.

따라서, 본 연구에서는 chimeric core protein HHDH 에서 HBV core 와 DHBV core protein 간의 서로 다른 5 개의 amino acid 를 하나씩 HBV core protein 으로 치환시켜 5 개의 새로운 chimeric core protein 을 cloning 하여 HBV DNA replication 에 어떠한 amino acid 가 관여하는지 밝히고자 하였다.

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５

A.

B.

(16)

６

Fig. 1. Schematic diagram of core protein and HBV replication by chimeric core protein. (A) Core and chimeric core proteins for trans –complementation. HBV and DHBV sequences are depicted as blue and red, respectively, and the Ű sequences at 3’-ends are marked. (B) In the previous study, we constructed the series of chimeric core proteins which contain various lengths of corresponding DHBV sequences and found that the replication of core-protein deficient HBV was rescued by chimeric core proteins with different efficiencies. Small sized HBV DNA than the full length of single stranded HBV DNA was synthesized by chimeric core particles with HD221-262 chimeric core protein. Relaxed circular HBV DNAs were synthesized by chimeric core particles with HDHD chimeric core protein. However, small sized DNAs were synthesized HHDH. (C) HHDH contains the most of HBV core proteins sequences except the 9 amino acids from the corresponding DHBV sequences. Among these 9 amino acids of DHBV sequences from HHDH, 5 amino acids were actually different with the corresponding sequences of HBV core protein.

(17)

７

.

Ⅱ

재

_{재 료}

재

료

_{료 및}

_{및 방}

및

방

_{방 법}

방

법

_법

법

A. HBV plasmid DNA construction

Chimeric core protein 을 C deficient mutant 와 co-transfection 하는 방법으로 실험을 진행하기 위해 정상적인 core protein 을 형성하는 pHCP 를 wild type 으로 사용하였다.

C deficient mutant 는 core protein 을 발현하지 못하는 mutant 로써, core protein 의 8 번째 amino acid Glu (GAA)을 fusion PCR 방법을 이용하여 stop codon 으로 (TAA) 전환 한 mutant 이다. 이 C deficient mutant 는 core protein 을 제외한 다른 HBV protein 들과 pgRNA 는 발현을 한다.

Chimeric core protein 중에 HBV 서열을 대부분 차지하지만 HBV replication 효율이 낮았던 HHDH mutant 의 DHBV 부분을 HBV 와 비교하였을 때, 9 개의 amino acid 중에 5 개의 amino acid 가 서로 달랐다. 서로 다른 5 개의 amino acid 를 각각 DHBV 서열에서 HBV 서열로 하나씩 전환시키기 위해 site-directed mutagenesis 방법을 이용하였다. Site-directed mutagenesis 방법을 하기 위해 각각 amino acid 에 대한 PCR 을 실시하였다. 5 개의 DHBV core protein amino acid 중에 첫 번째 amino acid 인 alanine 을 arginine 으로 바꾸기 위해 HHDH 를 주형으로 하여 primer HBV 127 (5’-GCCTCGCCGTCGCGGCTCCCCTCTCCCAC-3’) / primer HBV 19 (5’-GTGCGCAGACCAATTTATGC-3’) 과 primer HBV 128 (5’-GAGGGGAGC CGCGACGGCGAGGCGAGG-3’) / primer HBV 20 (5’-GCAACTATTGTGGTTTCATAT ATCTTGCC-3’) 를 사용하여 95℃에 30 초, 55℃에 30 초, 72℃에 30 초씩 30cycle 로 PCR 을 한 후 생성물을 primer HBV 20/ HBV 19 로 다시 같은

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８

조건으로 PCR 을 수행하여 최종 산물을 얻었다. 두 번째 amino acid 인 alanine 을 glycine 으로 바꾸기 위해 primer HBV 129 (5’-TCGCCGTGCGA GATCCCCTCTCCC AC-3’) / primer HBV 19 와 primer HBV 130 (5’-AGAGGGGATCTCGCACGG CGAGG CGAG-3’) / primer HBV 20 으로 각각 PCR 후 생성물을 HBV 20/ HBV 19 로 다시 PCR 을 수행 하여 최종 산물을 얻었다. 세 번째 amino acid proline 은 primer HBV 131 (5’-GCGGGCTCCCAA CTCCCACGTAGTAGAAG-3’) / primer HBV 19 와 primer HBV 132 (5’-TACGTGGGA GTTGGGAGCCCGCACGGC-3’) / primer HBV 20 를 사용하여 각각 PCR 후 생성물로 두 번째 PCR 을 실시하여 glutamine 으로 전환을 하였다. 네 번째 amino acid leusine 을 serine 으로 바꾸기 위해 primer HBV 168 (5’-GGGCTCCCCTTCGCCACG TAGTAGAAGATCTC AATCTCGGGAATC-3’) / primer HBV 19 와 primer HBV 134 (5’-TACTACGTGGCG AAGGGGAGCCCGCACG-3’) / primer 20 으로 PCR 하여 얻은 생성물로 2nd PCR 을 통해 최종 산물을 얻었다. 마지막 다섯 번째 amino acid serine 을 arginine 으로 바꾸기 위해 PB 를 주형으로 하여 primer HBV 135 (5’-TCTCCCACGTCGCAGAAGATCTCAATC-3’) / primer HBV 21 (5’-GCTCCGAATGCA GGGTCCAACTGATG-3’) 과 HHDH 를 주형으로 하여 primer HBV 136 (5’-GAGAT CTTCTGCGACGTGGGAGAGGGGAG-3’) / primer HBV 20 을 사용하여 각각 PCR 후 두 번째 PCR 로 최종 산물을 얻었다. 이러한 방법으로 다섯 개의 새로운 chimeric core protein 을 만들었다. 모든 구조들은 특정 mutant 임을 확인하기 위해 서열화 하였다.

(19)

９

HuH7 cell 은 HBV wt 과 chimeric core construct 들을 transfection 하는데 이용하였다. HuH7 cell 은 penicillin 과 streptomycin, 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, invitrogen) 이 첨가되어있는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco, invitrogen) 으로 배양 하였다. HuH7 cell 에 HBV wt plasmid 8 ㎍을 transfection 하였고, C deficient mutant 와 여러 가지 chimeric core protein construct plasmid 를 각각 2 ㎍, 6 ㎍ (1 : 3)으로 transfection 하고, trnasfection reagent 로는 polyethylenimine (PEI) 를 사용하였다. 각각의 plasmid 와 PEI 의 비율은 1 : 1 로 하고, 10 분 동안 실온에서 반응 후 cell 에 co-transfection 하였다. Transfection 한 다음 1 일 후에 10% FBS DMEM 을 5% FBS DMEM 으로 바꿔 주었다.

C. Core particle 의의의의 분리분리분리분리

Transfection 을 한 3 일 후, HuH7 cell 을 1ml 1% Nonidet P-40(Sigma)이 첨가되어있는 TNE (10mM Tris-HCl [pH 8.0], 50mM NaCl, 1mM EDTA) buffer 를

사용하여 lysis 하였다. Lysate 는 12000rpm 으로 원심분리 하여 10mM MgCl2, 8mM

CaCl2, 20U DNase I, 60U micrococal nuclease(Fermentas) 와 37℃에서 1 시간 30 분

이상 반응하였다. Core particle 은 6.5% polyethylene glycol 로 ice 에서 1 시간 30 분 이상 침전한 후 13000rpm 으로 4℃ 에서 15 분 동안 원심 분리 하였다.

D. Encapsidation Assay

Encapsidation 된 RNA 를 확인하기 위해, HuH7 cell 에 여러 가지 chimeric core protein construct plasmid 와 core protein 을 발현하지 못하지만 다른 HBV RNA 만을

(20)

１０

합성하는 C deficient–RT YMHA 를 transfection 하고 세포에서 core particle 을 앞서 설명과 같이 분리하였다. 분리한 core particle 을 1% native agarose gel 에 전기영동을 한 후, nytron membrane(Whatman)으로 transfer 하였다. Membrane 상에서 core particle 을 0.2M NaOH 로 denaturation 시키고 0.2M Tris-cl(pH 7.5) 로

neutralization 를 거쳐 HBV 서열에 특이적인 α 32P-labeled random-primed probe 를

사용하여 68 ℃ _{에서 hybridization 하였다.}

E. Southern blotting

Southern blotting 으로 HBV DNA 합성을 확인하기 위해 core particle 을 분리 한 후, proteinase K (100 ㎍/ml) 를 이용하여 core particle 을 제거하였다. HBV core DNA 는 400 ㎕ phenol/chloroform/Isoamylalcohol (25 : 24 : 1)과 섞은 후 13000rpm 으로 5 분 동안 원심 분리를 한 다음, 3M NaAc 와 섞고 100% EtOH(Merck) 함께 -20℃에서 침전하여 분리 하였다. 분리된 HBV core DNA 는 0.9% native agarose gel 전기영동 한 후, nytron membrane(Whatman) 으로 transfer 하여 HBV 서열에

특이적인 α32

P-labeled random-primed probe 로 hybridization 하였다.

F. Core particle 의의의의 Western blotting

분리한 core particle 을 1% native agarose gel 에서 전기영동 하였다 (Koschel et al., 2000). Core particle 은 polyvinylidene fluoride (PVDF, Milipore) membrane 으로 transfer 하였다. Immunoblotting 은 5% skim milk 로 1 시간 동안 blocking 후, anti-HBc antibody (DAKO, Glostrup, Denmark) 로 1 : 1000 으로 희석 한 후 1 시간 반응

(21)

１１

하였고, 1XPBST 로 membrane 을 10 분 동안 3 번 반복하여 씻은 다음 Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody(DAKO, Glostrup, Denmark)를 1 : 2000 으로 희석 한 후 1 시간 반응 시켰다. 1XPBST 로 membrane 을 15 분 동안 3 번 반복하여 씻은 후에 ECL (Enhanced Chemical Luminescence) 로 1 분간 반응을 시켜 HBV core particle 을 시각화 하였다.

G. Endogenous polymerase assay (EPA)

분리한 core particle 을 0.5mM dCTP, dGTP, dTTP(Takara)와 10 ㎍ α-32

P-dATP (specific activity, 3000Ci/mmol), EPA reaction buffer (50mM Tris-HCl [pH 7.5], 75mM

NH4Cl, 1mM EDTA, 25mM MgCl2, 0.1% β-mercaptoethanol, 0.5% Nonidet P-40) 와 함께

37℃ _{에서 overnight 반응하였다. EPA reaction 하고 있는 core particle 일부에서}32

P-labeled HBV DNA 를 분리하였다. RadioP-labeled HBV DNA 는 앞서 core DNA 를 분리하는 방법과 동일하게 분리하였고, EPA reaction 하는 core particle 과 분리한 HBV DNA 를 각각 1% agarose gel 에서 전기영동을 하고, agarose gel 을 gel dryer 에서 말린 후 필름에 노출 시켜 확인하였다.

(22)

１２

Ⅲ

Ⅲ. 결

결

_{결 과}

결

과

_과

과

A. Chimeric core construction 과과과 core particle 의과 의의의 형성형성형성 형성

HBV replication 에서 HBV core protein 의 nucleic acid binding 부위가 관여를 한다는 보고가 있었고, 이 nucleic acid binding 부위에서도 어떤 amino acid 가 영향을 끼치는지 알아보기 위해, chimeric core HHDH 의 DHBV core amino acid 를 HBV core amino acid 와 비교하여 서로 다른 5 개의 amino acid 를 각각 HBV core amino acid 로 바꾸어 새로운 chimeric core protein 을 만들었다. HHDH 를 vector 로 사용하여 각각의 amino acid 의 mutant 를 가진 primer 로 PCR 을 이용하여 site-directed mutagenesis 를 실시하였다.

서로 다른 5 개 amino acid 에 대한 각각의 mutant 를 가진 새로운 5 개 chimeric core 의 core particle 형성을 확인하기 위하여, HBV core particle 에 대한 Western blot 을 실시하였다. Anti-HBc antibody 와 Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody 로 확인하고, ECL (Enhanced Chemical Luminescence) 로 HBV core particle 을 시각화 하였다. 새롭게 만든 5 개 chimeric core 들은 모두 HBV core particle 을 형성하고 (Fig 2A), 그 중에서 L173S 과 S176R 으로 바뀌었을 때, HBV core particle 의 형성 양상이 높아지는 것을 확인하였고, 이로 인해 HBV core particle 이 형성에 있어서 HBV C 말단의 L173S 과 S176R 이 관여를 하며, HBV core particle 형성이 다른 mutant 에 비해 더욱 잘 이루어 진다는 것을 알 수 있었다. L173S 과 S176R 가 HBV core particle 을 잘 형성 하는 반면에 P172Q 는 HBV core particle 형성은 하지만 낮은 level 로 형성 되는 것을 보았다. 각각의 mutant 에 대한 차이는 있지만 새롭게 제작되어진 chimeric core protein 과 기존에

(23)

１３

존재 하던 chimeric core protein 모두 HBV core particle 을 형성을 하는 것으로 확인하였다.

B. HBV pregenomic RNA 의의의의 encapsidation 양상양상양상양상

HBV pgRNA 는 core protein 의 nucleic binding 부위에 결합하여 core particle 로 encapsidation 되기 때문에 chimeric core protein 에 의한 HBV pgRNA 의 encapsidation 양상을 알아보기 위해, core particle 을 분리하여 HBV pgRNA 에 대한 encapsidation assay 를 실시하였다. Core particle 내의 HBV pgRNA 만을 확인하기 위해, RT 의 기능이 상실되어 있는 YMHA 와 core 를 발현하지 못하는

plasmid 인 C deficient-RT YMHA (▵C-RT YMHA) 를 제작하여 다양한 chimeric core

protein 들과 함께 HuH 7 cell 에 co-transfection 하였다. Transfection 한 후, 3 일 뒤에 core particle 을 분리하여 전기 영동 하여, membrane 으로 core particle 을 transfer 한 후, membrane 상에서 core particle 을 0.2M NAOH 로 분해하여 RNA 를 노출시켰다. 노출 된 RNA 를 HBV 에 특이적으로 결합하는 probe 와 결합시켜 분석 하였다. 분석된 결과를 이전 연구의 HBV replication 양상과 비교하면 기존의 HHDH 경우에 encapsidaition 이 되지 않아서 HBV replication 이 일어나지 않은 것으로 확인되었고, 반면에 HD221-262 의 경우는 encapsidation 은 잘 일어나지만 HBV replication 의 양상이 낮게 나타났다. 이 결과를 통해서 HHDH 의 duck 서열이 HBV pgRNA 의 encapsidation 에 관여 하는 것을 예측 할 수 있었다. Duck 서열에서 어떤 amino acid 가 관여하는지 정확하게 알기 위해 새롭게 만든 5 개의 chimeric core protein 들은 L173S 를 제외한 4 개의 chimeric core protein 들이 encapsidation level 이 HHDH 에 비해 높은 것으로 확인 되었다(Fig. 2B). 이로

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１４

인해, amino acid 하나가 달라짐에 따라 encapsidation 의 양상이 wild-type 의 level 만큼 뚜렷하게 좋아지는 것을 알 수 있었고, HBV replication 의 양상 또한 각각 amino acid 에 의해 서로 다르게 나타날 것으로 예상 할 수 있었다.

(25)

１５

Fig. 2. Encapsidiation assay of HBV pgRNA and Western blot of core particle. (A) Isolated core particles were electrophoresed on a 1% native agarose gel. Core particles were transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. Immunoblotting was performed using an anti-HBc antibody. (B) Encapsidation assay was performed to detect encapcidated pregenomic RNA(pg RNA) into core particle. Core particles were isolated, separated, transferred to nylon membranes, nutralization, denaturenation on membrane, hybridized with a random-primed 32P-labeled HBV specific probe, and subjected to autoradiography.

(26)

１６

C. Chimeric core particle 의의의 Endogenous polymerase 활성측정의 활성측정활성측정활성측정

Core particle로 encapsidation 된 pgRNA를 DNA로 전사하는데 있어서 core particle 내의 endogenous 한 polymerase가 얼마나 활성을 가지는지 측정하기 위해,

endogenous polymerase assay (EPA) 를 실시하였다. 다양한 chimeric core protein 들과

새롭게 만든 chimeric core protein 들을 C deficient mutant 함께 HuH7 cell에 각각 co-transfection 한 후, 3일 뒤에 core particle 로 EPA 반응을 하였고, EPA 반응 후 core particle 에서 HBV DNA 를 분리하여 EPA 반응을 한 core particle 과 HBV DNA를 분리한 것을 각각 전기영동 하여 분석하였다. 앞선 encapsidation assay에 대한 결과로 EPA 결과를 예상하기로는 L173S 를 제외한 나머지 chimeric core protein 들은 EPA 반응이 잘 이루어졌을 것이라 생각하였다. 먼저 chimeric core protein 의 core particle 을 Western blot 하였을 때, 모두 chimeric core particle 을 형성 한다는 것을 확인 하였고(Fig. 3C), EPA reaction 후 core particle 의 endogenous polymerase 의 활성은 G170R 과 S176R 이 HHDH 에 비해서 HBV wild-type 의 활성과 비슷하게 회복 되는 것을 확인 하였다(Fig. 3A). Core particle EPA 반응 후 HBV DNA 를 분리하여 HBV DNA의 replication 을 확인 하였을 때, G170R 의 경우 single strand DNA 의 level이 높게 나타났고 double strand DNA와 relaxed DNA 합성도 HBV DNA level 보다 낮지만 합성하는 것을 알 수 있었다. S176R 도 single strand DNA 를 합성하고 double strand DNA 와 relaxed DNA 합성도 일어나지만 single strand DNA 보다 작은 크기의 DNA를 많이 합성 하였다(Fig. 3B). HHDH chimeric core protein 에서 amino acid 하나만을 바꾼 G170R 과 S176R 의 HBV DNA replication 양상은 HHDH 에 비해 HBV DNA replication 이 잘 일어났다.

(27)

１７

상관없이 HBV replication의 회복은 다른 것으로 알 수 있었다.

새롭게 만들어진 chimeric core protein 각각의 amino acid 들은 L173S 를 제외하고 4개의 chimeric core protein 들은 encapsidation에 관여는 하지만 HBV replication에는 G170R 과 S176R 이 관여하는 것으로 나타났다.

D. Chimeric core protein 에에에에 따른따른따른따른 HBV DNA replication 양상양상양상 양상

EPA 로 polymerase 의 활성을 측정하여 HBV DNA replication level 의 변화를 볼 수 있었지만 정확하게 chimeric core protein 에 의해 HBV DNA replication 이 회복 되는 지 확인 하기 위해, HBV wt 과 chimeric core protein 들을 C deficient 와 co-transfection 한 HuH7 cell 에서 core particle 을 분리하여 Western blot 을 하고, HBV DNA 를 분리하여 Southern blot 을 하였다. Core particle 의 형성을 확인 하기 위한 Western blot 의 결과는 모든 chimeric core particle 이 형성 되는 것을 확인 하였고 (Fig. 4B), HBV DNA replication 을 확인 하기 위한 Sourthern blot 의 결과는 앞서 확인 한 EPA 결과가 유사하게 G170R 과 S176R 에서 HHDH 에 비해 single strand DNA 가 합성 되었고 낮은 level 이지만 double strand DNA 와 relaxed circular DNA 를 합성 하였다(Fig, 4A). HBV pgRNA 가 encapsidation 되는 level 과 HBV DNA replication 과의 관련성을 확인 하기 위해, 앞서 나온 pgRNA 의 encapsidation 양상과 비교를 해 보면 A169R 과 P172Q 는 pgRNA 를 HBV core particle 내부로 encapsidation 을 잘 일어나게 하지만 HBV DNA replication 에는 크게 관여 하지 않았고, 이는 A169R 과 P172Q 가 nucleic acid 와 결합은 잘 일어나지만, HBV DNA replication 에는 관여를 하지 않으며, 반면에 G170R 과 S176R 은 nucleic aicd 와 결합이 잘 일어나서 pgRNA 의 encapsidation 에 관여하고, HBV DNA replication

(28)

１８

에도 관여하였다. 이로 인해 HBV core particle 의 C 말단 amino acid 가 HBV DNA replication 과 관련이 있다는 것을 확인하였다.

(29)

１９

Fig. 3. Endogenous Polymerase Assay (EPA) of Chimeric core protein. (A) Isolated core particles were incubated with EPA reation buffer supplemented with 0.5mM each of dCTP,

dGTP, dTTP and 10uCi α 32P-dATP (3000Ci/mmol) at 37℃ for overnight incubation.

Reaction mixtures were electrophoresed on 1% agarose gel and subjected to autoradiography. (B) After EPA reaction, 32P-labeled DNA was estracted, separated by 1% agarose gel electrophoresis and subjected to autoradiography. Single-, double-stranded, and partially double-stranded relaxed circular forms of HBV DNA are marked as ssDNA, dsDNA, and RC, respectively. (C) Isolated core particles were electrophoresed on a 1% native agarose gel. Core particles were transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. Immunoblotting was performed using an anti- HBc antibody.

(30)

２０

Fig. 4. HBV replication by Chimeric core protein. (A) Southern blot analysis to detect HBV DNA replication. HBV DNA was extracted from isolated core particles, separated,

transferred to nylon membranes, hybridized with a random-primed 32P-labeled HBV specific

probe, and subjected to autoradiography. Single-, stranded, and partially double-stranded relaxed circular forms of HBV DNA are marked as ssDNA, dsDNA, and RC, respectively. (B) Isolated core particles were electrophoresed on a 1% native agarose gel. Core particles were transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. Immunoblotting was performed using an anti-HBc antibody.

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.

Ⅳ

고

_{고 찰}

고

찰

_찰

찰

HBV core protein 의 C 말단은 arginine 을 많이 가지고 있는 부위로써, nucleic acid 가 결합 하는 부위로 알려져 있고, C 말단이 capsid particle 조립에도 관여한다. 그러나 많은 연구를 통해서 core protein 의 C 말단이 pgRNA encapsidation 과 DNA replication 에도 관여 한다는 보고가 있었다. 이전 연구에서 chimeric core protein 을 발현하는 여러 가지 plasmid 를 제작하였고, 이 chimeric core protein 들은 HBV core 와 DHBV core 로 이루어져있다. 그리고 이전 연구를 통해 다양한 chimeric core protein 들 중에 HBV core 의 C 말단이 전부 DHBV 로 이루어져 있는 HD 221-262 는 HBV DNA 를 합성하지만, HBV genomic DNA 보다 작은 크기의 DNA 를 합성하는 것으로 나타났고, encapsidation level 은 높게 나오는데 비해 DNA 합성이 이루어지지 않는 것을 확인하였다. HD 221-262 는 nucleic acid 를 core particle 내로 encapsidation 하는 것이 쉽게 일어나지만 core particle 내에서 HBV DNA replication 하는 것은 DHBV 서열을 가지기 때문에 어려운 것으로 예상되었다. 반면에 HBV core 의 C 말단이 대체적으로 DHBV 서열로 이루어진 HDHD 는 double strand DNA 와 relaxed circular DNA 및 single strand DNA 를 합성하며, 대부분 HBV core 의 C 말단이 Human 서열로 이루어진 HHDH 는 HD 221-262 와 마찬가지로 작은 크기 HBV DNA 를 합성 하는 것을 확인하였다(Fig. 1). 그래서 chimeric core protein HHDH 의 DHBV 서열이 HBV pgRNA encapsidation 과 HBV DNA replication 에 관여 할 것으로 생각하여 HHDH 의 DHBV 서열을 HBV WT 과 비교하였다. 두 서열을 비교한 결과, HBV chimeric core protein HHDH 에서 DHBV 에 해당하는 부분은 단지 9 개의 amino acid (amino acid 168-176)으로 이루어져 있고, 9 개 amino acid 중에서도 5 개의 amino acid 만이

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HBV WT 과 서로 달랐다. 이 5 개의 amino acid 에 의해서 HBV DNA replication level 차이가 크게 나타난 것이었다. 이전 보고에 따르면 HBV core protein 의 amino acid 165-173 번이 HBV DNA 합성에 중요한 반면 174-183 은 중요하지 않은 것으로 알려졌다(Nassal, 1992). 그리고 최근 연구 보고에 의하면 HBV core protein amino acid 172, 173 번에 해당하는 arginine 이 HBV DNA 를 합성하는데 필요하다고 알려져 있으며(Pogam 등, 2005), 본 그룹에서 제작한 chimeric core protein HHDH 의 DHBV 서열은 amino acid 168-176 에 해당하여 HHDH 의 DHBV 서열이 HBV DNA 합성에 중요한지 중요하지 않은지를 알 수 있을 것으로 생각하였다.

그래서 본 연구에서는 HHDH 에서 DHBV 의 서로 다른 5 개의 amino acid 를 각각 HBV 서열로 치환하여 새로운 다섯 개의 chimeric core protein 을 제작하여 각각의 HBV DNA replication 을 확인 하였다. 먼저 새로운 chimeric core protein 에 의해서 pgRNA 의 encapsidation level 이 어떻게 달라지는지 확인 하였을 때(Fig. 2), 하나의 amino acid 만 바뀌었음에도 불구하고 HHDH 에 비해서 L173S 만 제외하고 pgRNA 의 encapsidation level 이 확연히 회복되는 것을 알 수 있었다. 이 결과를 통해서 하나의 amino acid 에 의해서 pgRNA 와 core particle 간의 결합력이 높아지고, core particle 내로 pgRNA 의 encapsidation level 도 높아지는 것을 알았다. 새로운 chimeric core protein 을 HuH7 cell 에 transfection 하여 각 mutant 에 대한 chimeric core particle 내에 있는 polymerae 의 활성 (Endogeneous polymerase assay, EPA)을 측정하였다(Fig. 3). EPA 를 실시한 결과 5 개의 아미노산 중 G170R 과 S176R mutant 에서 endogenous polymerase activity 를 가지는 것으로 확인하였고, 이 결과를 통해 G170R 과 S176R 이 완벽한 HBV DNA 를 합성하는 것인지 알 수는 없지만 HBV DNA replication 에 관여 할 것으로 예상하였다. 더욱 정확한 HBV

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DNA replication 양상을 확인 하기 위해, HBV DNA 에 대한 Southern blot 을 실시하였다(Fig. 4). 그 결과, 앞서 나타난 EPA 결과와 유사하게 G170R 과 S176R 이 single strand DNA 와 함께 약하지만 double strand DNA 및 relaxed circular DNA 도 합성하는 것으로 나타났다.

최근 연구에서는 HBV core 의 C 말단에서 인산화가 일어났을 때, core particle 내에서 HBV DNA replication 이 일어난다는 보고가 있다(Suresh 등, 2006). 이 연구에서는 HBV core 의 C 말단의 serine 과 threonine 이 인산화가 되면 HBV DNA 가 합성되고, 성숙한 core particle 이 형성 되면 C 말단에서 탈인산화가 일어난다고 하였다. 이 연구에서 나타내어진 인산화가 되는 C 말단은 본 연구에서는 HBV core 의 171 번 amino acid 에 해당하는 serine 이 포함된다. 본 연구에서 보여지는 HBV core chimeric core protein 뿐만 아니라 인산화 또한 HBV DNA replication 에 관여를 하고, HBV core protein 의 arginine-rich domain 에 해당하는 G170R 과 S176R 이 HBV DNA replication 에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

이로 인해 이전에 보고 된 HBV core protein 172, 173 번의 arginine 이외에 170 번 amino acid arginine 과 176 번의 arginine 도 HBV DNA replication 에 관여 하고, HBV C 말단인 arginine rich-domain 이 nucleic acid binding 역할 뿐만 아니라 HBV DNA replication 에 관여 하는 것으로 추측 되어진다.

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참

참 고

고

_{고 문}

문

_{문 헌}

헌

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-ABSTRACT-

Critical C-terminal Amino Acids of Hepatitis B virus Core Proteins

for HBV Replication

Shin Bo-Hye

Department of Biomedical Sciences The Graduate School, Ajou University

(Supervised by Associate Professor Kyongmin Kim)

Hepatitis B virus (HBV) core proteins are involved in pregenomic RNA encapsidation and viral DNA replication. C-terminal domain of core protein is nucleic acid binding domain, while N-terminal domain is involved in capsid particle assembly. DHBV core protein has low homology with that of HBV. The replication of core protein-deficient HBV can not be rescued by the trans-complementation of DHBV core protein. In the previous study, we constructed the series of chimeric core proteins which contain various lengths of corresponding DHBV sequences and found that the replication of core-protein deficient HBV was rescued by chimeric core proteins with different efficiencies. Small sized HBV DNA than the full length of single stranded HBV DNA was synthesized by chimeric core particles with HD221-262 chimeric core protein. Relaxed circular HBV DNAs were synthesized by chimeric core particles with HDHD chimeric core protein. However, small

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sized DNAs were synthesized HHDH which contain the most of HBV core proteins sequences except the 9 amino acids from the corresponding DHBV sequences, which were similar to those by HD221-262. Among these 9 amino acids of DHBV sequences from HHDH, 5 amino acids were actually different with the corresponding sequences of HBV core protein. In this study, the respective amino acid was changed to the corresponding HBV sequence. Then, replication of core protein-deficient mutant was examined by the trans-complementation of new chimeric core proteins. We found that the replication of core protein-deficient HBV were rescued by some of new chimeric core proteins, indicating that these residues in C-terminal domain of core protein are the critical residue for HBV DNA replication.