3차원 세포배양 기술의 연구 및 상용화 동향

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3차원 세포배양 기술의 연구 및 상용화 동향 최재원, 이동우 Page 1 / 20 BRIC View 2018-T38

3차원 세포배양 기술의 연구 및 상용화 동향

최재원, 이동우

건양대학교 의공학부 / 건양대학교 의공학부 E-mail: zeak3659@naver.com / dw2010.lee@gmail.com 요약문

3차원 세포배양기술은 기존 2차원 세포배양기술에 비해 생체 대응성이 뛰어나 1990년대부터 현재까지 꾸준하게 연구되어 왔으며, 최근에는 생체대응성을 더욱 높인 오가노이드 배양기술로 발전하고 있다. 90년도 초반 Eric Simon이 NIH SBIR Grant Report를 통해서 인공적인 스케폴더(Scaffold)에 인간 세포주를 3차원으로 배양하는 것을 소개한 이후에 생체대응성을 높이는 3차원 세포배양기술은 질병의 연구, 맞춤형 의학, 신약개발 등의 다양한 분야의 니즈로 인해 기술개발이 활발하게 이루어지고 있으며, 일부 기술들은 제품으로 상용화되었다. 본 동향조사리포트는 최근까지 개발되어온 3차원 세포배양기술을 소개/분류하고, 현재 활발하게 진행되고 있는 3차원 세포배양기술의 연구/상용화 동향을 소개함으로써, 3차원 세포배양기술의 저변확대에 기여하고자 한다.

Key Words: 3차원 세포배양(3D cell culture), 오가노이드(Organoid), 세포배양모델(Cell culture model), 세포외기질(Extracellular Matrix), 스케폴더(Scaffold), 세포기반 분석(Cell-based assay)

목 차

1. 서론 2. 본론 2.1 3차원 세포배양모델이란? 2.2 2차원과 3차원 세포배양모델의 장단점 분석 2.3 3차원 세포배양모델 분류 2.4 3차원 세포배양모델의 최신연구동향 2.5 3차원 세포배양모델의 상용화 동향 2.6 3차원 세포배양모델의 응용분야 3. 결론 BRIC View 동향리포트

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3차원 세포배양 기술의 연구 및 상용화 동향 최재원, 이동우 Page 2 / 20 4. 참고문헌

1. 서론

동물세포의 배양은 90년도 초반 Harrison이 올챙이의 척색에서 취한 신경선유, 세포를 개구리의 응고 림프액에 배양함으로써 시작되었다. 이후, 증식 재연성이 좋은 세포주의 개발, 세포 배양액의 확립, 세포배양 기구 및 장비의 발전으로 동물세포를 체외에서 안정적으로 배양할 수 있게 되었다. 동물세포의 배양은 주로 플라스틱 접시(Dish)에 세포부착용 화학물질을 코팅하고, 동물세포를 부착시켜 키우는 방식으로 동물세포를 증식 시켰다. 이러한 동물세포배양은 새로운 생리활성물질의 발견, 생리활성물질의 생산, 여러 질병모델 개발, 독성분석, 신약개발 등 생명공학과 의료분야 전반에서 널리 사용되고 있다. 하지만, 동물세포를 플라스틱 접시(Dish)에 부착시키면 단일 층으로 증식하여 생체에서 동물세포가 3차원으로 증식하는 것과 형태적으로 차이가 나며, 이러한 이질적인 환경은 세포의 유전자 발현에도 영향을 미쳐 체외의 동물세포배양은 생체내 동물세포와의 대응성이 떨어지는 문제점을 가지고 있다. 미국 브라운대 연구진이 2007년도에 Tissue Engineering 국제저널에 기고한 논문에 따르면, 동물세포는 생체 대응성이 높은 3차원 세포배양모델로 자랄 경우, 2차원적 세포배양모델과 상이한 유전자 발현을 보고하고 있다 [1]. 이러한 연구결과는 세포를 이용한 실험결과를 기초생명과학연구와 의학의 질병모델에 응용할 시 주의가 필요함을 시사한다. 특히, 약물의 효능 분석 또는 독성 분석을 위해 동물세포를 이용할 경우, 3차원 세포배양 모델이 기존의 2차원 세포배양 모델의 약물 반응성과 큰 차이를 보이는 것이 국내외적으로 많이 보고되었다 [2-6]. 특히, 암 환자에서 유래된 세포를 3차원으로 배양하면 세포, 세포-세포외기질(ECM, Extracellular Matrix)의 상호작용으로 세포의 형태(morphology)뿐만 아니라 발현되는 주요 유전자의 종류와 발현 정도가 달라진다 [2-4]. 이 때문에 3차원 세포배양모델과 2차원 세포배양모델에서 세포의 약물 반응이 다르다는 보고가 많다 [5,6]. 최근에는 암환자의 개인 맞춤형 치료를 위한 정밀의료에도 3차원으로 배양된 세포의 약물반응 데이터를 유전자 데이터와 더불어 임상의 보조 자료로 사용하려는 시도가 활발하다 [7,8]. 생체 대응성이 뛰어난 3차원 세포배양모델은 2차원 세포배양모델과 달리 세포, 세포외기질, 세포배양용기, 세포 성장인자 등의 조합으로 만들어져 다양한 조합에 따라서 세포배양모델이 달라지는 다양성을 가지고 있다. 최근 20-30년의 연구 기간 동안 다양한 아이디어로 3차원 세포배양모델이 개발되었고, 이중 일부는 상용화 되었지만 아직도 기술이 표준화되지 못하고 있는 실정이다. 또한 기존 모델보다 더 생체대응성을 높이려는 시도들이 최근까지도 꾸준히 발표되고 있다. 따라서, 본 보고서는 3차원 세포배양기술의 최신 기술과 상용화 동향을 공유하고, 다양한 분야의 연구자들과 함께 3차원 세포배양기술의 미래 개발 방향과 응용에 대해서 함께 생각해보고자 한다.

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2. 본론

2.1 3차원 세포배양모델이란?

3차원 세포배양모델은 생체와 유사한 환경을 체외에서 인공적으로 조성하여 세포가 모든 차원에서 성장하거나 주변 환경과 상호작용할 수 있도록 허용하는 세포배양모델을 통칭한다. 그림1은 2014년도에 오스트리아 Griffith 대학 연구진이 3차원 세포배양모델을 정리하여 Biology 국제저널에 출판한 그림 [9]이다. 3차원세포배양모델은 세포외기질(Extracellular matrix, ECM)으로 구성된 3차원 공간에 여러 가지 세포를 3차원적으로 배양하며, 이때 영양분, 산소, 약물이 확산구배 및 투과로 세포에 공급되어 생체와 유사한 환경을 제공한다. 특히, 세포와 세포의 3차원 접촉으로 인한 상호작용, 세포-세포외기질의 3차원 접촉으로 인한 상호작용, 세포 분비물의 확산에 의한 측분비신호전달(Paracrine singaling) 등이 2차원 세포배양에는 없는 3차원 세포배양모델이 가지고 있는 특징이다. 그림 1. 3차원 세포배양모델의 특징 [9]. [https://www.semanticscholar.org/paper/Advanced-Cell-Culture-Techniques-for-Cancer-Drug-Lovitt-Shelper/bc193f185831c48c383f5560d05e0c4fe59d6a5b]

2.2 2차원과 3차원 세포배양모델의 장단점 분석

지난 100여년간 플라스틱 또는 유리 접시(Dish)에 세포를 한층으로 붙여서 배양하는 2차원 세포배양모델은 지속적으로 개발되어 현재는 표준화되어 있다. 다만, 세포에 따라서 바닥에 세포를 부착시키는 코팅제의 종류가 다르다. 이러한 2차원 세포배양모델은 누구나 따라 할 수 있을 정도로 실험이 쉽고, 이미 상용화 되어 관련 제품들을 쉽게 구할 있어 사용자가 편리하게 실험을 수행할 수 있다. 하지만, 2차원 세포배양모델은 생체 대응성이 떨어져서 정확한 생체 정보를 대변하지 못하는 단점을 가지고 있다. 이를 해결하기 위해 3차원 세포배양모델이 연구되어왔지만, 생체환경의 모방을 위한 세포외기질의 종류, 및 형상, 세포배양인자, 세포배양용기의 모양 등의 변수가 많아서 시스템이 복잡하고 사용자가 쉽게 실험을 수행하기에는 많은 문제점이 있었다. 하지만 이러한 단점에도 불구하고, 3차원 세포배양모델은 생체 대응성이 높아서 보다 정확한 생체 정보를 줄 수 있는 장점 (그림 2)이 있다. 인체를 대신하는 생체대응모델은 크게 동물모델, 3차원 세포배양모델, 2차원 세포배양모델이 있는데 생체 대응성이 뛰어날수록 실험의 난이도는 높다. 현재 윤리적 문제점,

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비용과 시간 등의 문제점이 있는 동물모델을 대체/보완할 수 있는 3차원 세포배양모델이 활발하게 연구되고 있다. 또한 <표 1> 에서 보듯이 3차원 세포배양모델은 세포의 형상, 세포분화, 약물 대사 등에서 기존 2차원 세포배양보다 높은 생체 대응성을 가지는 것으로 보고되고 있다. 이러한 수요를 충족시키기 위해 3차원 세포배양모델은 실험이 복잡하여 수행이 어려운 문제점을 기술력으로 차츰 극복하고 상용화 되고 있다. 그 대표적인 예가 Corning사, Insphero사, 3D Biomatrix사, Trevigen사 등 이 있으며, 국내에는 SPL, MBD 등의 회사가 3차원 세포배양모델 관련 세포외기질, 배양용기 및 배양 기기 등을 판매하고 있다.

그림 2. 2차원 vs 3차원 세포배양모양 모델 분석. 표 1. 2차원 vs 3차원 세포배양모들의 특성 차이들

Key Characteristics 2D-Cell Culture 3D-Cell Culture

세포 형상

(Cell Shape) [10] 편평하고 표면에 뻗어 있음 자연 형태 (타원체 / 편광)

세포와 미디어 연결성 (Cell interface to medium) [11-12]

모든 세포가 균일하게 배양액과 약물에 노출됨 생리 조건과 마찬가지로 세포 덩어리 에 배양액 및 약물의 투과로 인한 농도 구배가 생김 세포덩어리 표면 세포가 속의 세포보다 노출이 많음(이질적 노출) 세포-세포 연결 (Cell junction) [13] 세포-세포 연결은 측면으로만 연결되어 널리 퍼져 있지 않으며 생리학적 조건과 다름 세포-세포 연결이 세포 모든 면에서 이루어져 있으며, 세포 간 통신을 가능하여 생리학적 조건과 유사함 세포분화 (Cell Differentiation) [14] 보통 또는 낮은 분화 보임 높은 분화 약물대사 Drug metabolism [15-16] 약물 대사관찰이 용이하지 않음 CYP 효소의 발현 증가로 약물 대사가 향상됨 약물 감수성 Drug Sensitivity [17] 세포가 약물에 민감하게 반응함 세포는 종종 저항성을 보이고 약물은 낮은 효력을 보임 세포 증식 Cell Proliferation [18-19] 자연 환경보다 더 높은 증식률 세포 증식 속도는 높거나 낮을 수 있으며 세포 유형 및 3D 세포배양모델에 따라 차이가 남

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3차원 세포배양 기술의 연구 및 상용화 동향 최재원, 이동우 Page 5 / 20 자극에 대한 반응 Response to stimuli [20] 세포의 기계적 자극에 대한 낮은 반응성을 보임 세포의 기계적 자극에 대한 높은 반응성을 보임 세포 활성 Viability [21] 세포 독소에 민감하게 반응함. 외부 자극에 대해 둔감하게 반응함 세포 사멸 Apoptosis [22] 약물 유발 성 세포 사멸에 매우 민감함 약물 유도 된 세포 사멸 자극에 대한 향상된 내성 보임

2.3 3차원 세포배양모델 분류

3차원 세포배양모델은 아직 표준화가 되지 않고, 많은 연구자들이 활발하게 연구하고 있는 분야이다. 2차원 세포배양모델과 다르게 3차원 세포배양은 세포외기질 없이 세포와 세포를 뭉쳐서 자라게 하는 Scaffold-free 방식과 세포외기질 공간 안에 세포를 3차원으로 배양하는 Scaffold 방식으로 나뉘게 된다 [24]. Scaffold-free 방식은 세포를 뭉치게 하는 방법에 따라서 모델은 크게 4가지로 분류하게 된다. 바닥을 세포부착장지 코팅하거나 배양액을 유동시켜 세포의 부착을 방지하는 Anti-adhesion 방식에는 Static Suspension 배양, Spinner/rotational Chamber 배양, Nano-pattern well 배양, 자기 부상(magnetic levitation) 배양이 있다. 자기부상방식은 자성입자를 이용하여 세포와 세포를 뭉치는 방식이다. 부착방지 이외에도 중력의 힘으로 세포를 모아서 단일 스페로이드(Spehroids)를 형성하는 방식에는 Hang in drop 배양, U 또는 V shape well 배양이 있다. 이러한 방식은 세포를 좁은 공간(물방물의 오목한 아래면, U 또는 V 모양의 웰의 아래 바닥 면)에 세포를 조밀하게 모아서 단일 세포덩어리(스페로이드)를 형성하는 3차원 세포배양모델이다. Scaffold 방식은 세포외기질로 인공 폴리머인 Solid-scaffold나 Hydrogel등을 쓰는 방식에 따라서 다양하게 나뉘어 지며, 구조적으로는 세포외기질을 Well, 마이크로채널, 마이크로 필라 등에 형성하는 방식으로 나뉘어 진다. 이처럼 3차원 세포배양모델은 실험의 목적에 따라 다양한 실험변수들의 적용이 가능하여 다양한 모델이 개발되고 있다. 각 대표모델의 설명은 아래와 같다.

Static Suspension는 가장 일반적인 세포배양모델로 디쉬(Dish)나 웰의 바닥에 세포의 부착을 방지하는 아가(Aga) 또는 Anit-adhesion 코팅을 하여 세포가 떠서 서로 뭉쳐서 자라는 3차원 세포배양모델이다. Leukemia와 murine ascite tumor cell 등의 일부 세포와 같이 특성상 붙지 않고 부유해서 자라는 세포(Floating cell line)들은 웰의 바닥 코팅 없이 이 모델로 배양이 가능하다. Spinner/rotational Chamber는 Spinner 또는 Rotational chamber를 이용하여 세포를 끊임없이 움직여 바닥에 세포가 부착하지 못하여 배양액상에서 떠서 뭉쳐서 자라는 3차원 세포모델이다. 세포가 배양액에 떠서 움직이다 보면 세포간 상호작용을 통해 보다 친화성이 높은 세포끼리 접착하고, 원래의 조직 구조를 얼마간 반영한 구조를 만드는 특징이 있다. 주로 세포 대사물을 생산하거나, 세포를 대량 증식하는데 사용된다.

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3차원 세포배양 기술의 연구 및 상용화 동향 최재원, 이동우 Page 6 / 20 중력으로 인해 물방울의 아래 부분에 모인 세포를 하나의 덩어리 형태(스페로이드)로 3차원 세포배양하는 모델이다. 그림 3. 3차원 세포배양모델 분류. U or V Shape well은 U 또는 V 모양을 가진 웰의 바닥에 중력 또는 원심력을 이용하여 세포를 모아서 하나의 덩어리 형태(스페로이드)로 3차원 세포배양하는 모델이다. Nano-Patterned well은 웰의 바닥에 미세 패턴을 만들어 세포가 웰 바닥에 부착되지 않고 떠서 덩어리 형태로 3차원 세포배양하는 모델이다. Magnetic Levitation은 자석입자를 이용하여 세포를 웰 바닥으로부터 띄워서 세포를 덩어리 형태로 3차원 세포배양하는 모델이다. Solid-Scaffold-in-well은 미세구조가 있는 폴리머 위에 세포를 놓으면, 세포가 미세 구조로 침투하여 3차원 구조물 내에서 증식하여 자라는 3차원 세포배양모델이다. Hydrogels-in-well은 온도 또는 이온에 따라서 젤 형태의 구조물을 형성하는 Hydrogel을 세포와 혼합하여 웰 바닥에 분주하여, 세포가 Hydrogel 구조 내에서 덩어리를 형성하면서 증식하는 3차원 세포배양모델이다.

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Hydrogels-on-micropillar은 최근에 소개된 기술로, 세포를 포함하는 Hydrogel을 필라 위에 고정하고, 이를 배양액에 포함된 웰에 담구어, 필라 위 Hydrogel 내 세포가 덩어리를 형성하면서 증식하는 3차원 세포배양모델이다.

(Hydrogels-in-microchannel) MEMS (MicroElectroMechanical System) 기술의 발달로 혈관 기의 미세유로에 Hydrogel과 세포를 주입하고, 배양액을 흘리면서 미세유로 내에서 세포가 덩어리를 형성하면서 증식하는 3차원 세포배양모델이다. 특히, 배양액이나 약물은 생체 내 혈관과 유사하게 흘려주면서 배양하여 생체대응성이 뛰어난 모델이다. 표 2. 3차원 세포배양모델의 장단점 ★:하, ★★:중, ★★★:상 모델 생체 대응성 사용 편의성 상용화 정도 Static Suspension ★ ★★★ ★★★ Spinner/rotational Chamber ★ ★★★ ★★★ Hang in drop ★ ★ ★★ U or V Shape well ★ ★★★ ★★★ NanoCulture ★ ★★★ ★★★ Magnetic Levitation ★ ★ ★ Solid-Scaffold-in-well ★★ ★★ ★★★ Hydrogells-in-well ★★ ★ ★★★ Hydrogells-on-micropillar ★★ ★★★ ★★ Hydrogells-in-microchannel ★★★ ★ ★

2.4 3차원 세포배양모델의 최신연구동향

최근, 3차원 세포배양모델의 핫 이슈는 단연 오가노이드 배양모델이다. 오가노이드는 위, 간 등 실제 장기의 구조와 기능을 일부 닮았다는 의미이며 생체 대응성이 뛰어난 질병모형의 체외에서 구현하여, 질병의 연구 및 약물 개발에 활용된다 (그림 4). Kanster와 Knoblich의 정의에 따르면 오가노이드 [28]는 1)모방하려고 하는 장기의 최소한 하나 이상의 세포종을 가지고 있어야 하고, 2) 모방장기에 특화된 기능을 발현해야 하며, 3) 세포들의 일부분에서 장기와 유사한 형태로 조합되어야 한다. 따라서, 단순한 세포의 덩어리 형성으로는 오가노이드를 만들 수는 없지만 방법적으로는 오가노이드는 새로운 3차원 배양방식은 아니라 기존 3차원 세포배양 방식인 Hydrogels-in-well 모델을 사용한다. 다만, 대상 조직에 적합한 세포외기질 내에 세포를 적당한 분화 또는 성장 인자와 함께 장기간 배양하여 인체 장기와 유사한 기능을 하는 인공기관을 만드는 것이다. 어떻게 보면 3차원 세포배양모델의 궁극적 목적이 체외에서 생체대응성이 높은 모델을 만드는 것이기 때문에 개발의 최종 단계가 오가노이드라고 보아도 무방하다. 이러한 오가노이드 연구는 네델란드 Hans Clevers 연구팀 [29]이 가장 선도적으로 하고 있으며 이러한 오가노이드 연구는 생체대응성이 뛰어난 모델을 개발하여 정밀의료에 적용하는 연구를 활발하게 진행하고 있다.

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3차원 세포배양 기술의 연구 및 상용화 동향 최재원, 이동우 Page 8 / 20 그림 4. 환자에서 환자유래세포를 추출하여 3차원 세포배양으로 오가노이드 형성 후 질병치료에 사용되는 모식도들 [28,29] [http://science.sciencemag.org/content/345/6194/1247125.full] [https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(15)00373-6] 오가노이드를 만드는 3차원 세포배양모델은 점성이 높은 세포외기질을 사용하므로 일반적으로 생물실험에 사용하는 파이펫(Pipet)으로는 정밀한 세포 및 세포외기질의 분주가 어렵다. 이를 해결하기 위해 최근에는 3D 바이오 프린트를 적용한다. 그림5와 같이 바이오 프린트를 이용하여 3차원 세포인 오가노이드를 제조하는 연구들이 활발하게 이루어 지고 있다 [30,31,32]. 국내에서는 주요 대형병원에서는 맞춤형 치료를 위해 암환자유래세포를 3차원으로 배양하고 항암제의 효능을 분석하는 연구들이 활발하다. 특히 삼성서울병원 연구팀이 환자유래세포를 이용한 3차원 세포배양모델을 개발하고 있다. 주로 암환자의 세포를 3차원으로 배양하고 항암제의 반응성을 측정하여 임상테이터와 비교 분석하고 추후 최적의 항암제를 선정하거나 신약의 효능을 분석하는 플랫폼의 개발을 목표로 하고 있다 (그림 6)[33]. 그림 5. 오가노이드와 바이오 프린팅의 결합 [31]. [http://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/aa6121] 그림 6. 3차원 세포배양 모델을 이용한 항암제 효능 분석 예시 [33]. [https://www.researchgate.net/publication/315977413_3-Dimensional_micropillar_drug_screening_identifies_FGFR2-IIIC_overexpression_as_a_potential_target_in_metastatic_giant_cell_tumor]

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2.5 3차원 세포배양모델의 상용화 동향

3차원 세포배양모델의 시장은 표 3과 2016년도에는 5천억원 시장을 형성하고 있으며, 2021에는 고속 성장하여 1조원이 넘는 시장을 형성할 것으로 예상된다 [34]. 이는 다양한 종류의 종양세포를 이용한 3차원 세포 모델이 많이 개발되어 항암치료제, 재생의학, 기초연구 등에 활용되어 시장이 확장하고 있는 것이다. 현재, 주요 기업은 Corning사, Insphero사, 3D Bio matrix사가 있다. 특히, Corning사는 세포배양 용기 및 시약을 판매하는 세계적인 기업으로 2017년도부터 3차원 “U-shape” 세포배양 용기를 출시하며 3차원 세포배양모델의 상용화에 박차를 가하고 있다. 표 3. 3차원 세포배양기술의 국내, 세계시장 규모 구분 현재 시장규모(2016 년) 예상시장규모(2021 년) 세계시장규모 $466.8 M $1345.2 M 국내시장규모 $9.4 M $27 M 산출근거 국내시장규모는 세계시장규모의 2%로 추산

[출처: 3D cell Culture Market, 2016, Markets and Markets] 표 4. 3차원 세포배양기술의 국내외 대표적 기업

회사 제품명 대표도 3차원 세포배양모델

Corning Corning Spheroid

microplates Scaffold-Free

InSphero 3D InsightTM_Microtissues _{Scaffold-Free}

EMD Millipore Corporation CellASIC ONIX Scaffold

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MBD Cellvitro™ Scaffold

(Micropillar)

SPL SPL3DTM _{Scaffold-free}

Organognix Nano Culture plate Scaffold

(plate)

Trevigen Cultrex

®_{3D Spheroid}

Cell Invasion Assay

Scaffold (Plate)

3D Biomatrix Perfecta3D®

hanging drop plate Scaffold-Free

1) Corning [35]

Corning사는 Corning Spheroid microplates를 96- 또는 384- plate 형태로 판매하고 있다. 제품의 형태는 Scaffold-Free에서 “U-shape”의 바닥을 가진 웰에 세포를 뭉쳐 중력의 힘으로 3차원 배양하게 되는데 고속-대용량 스크린이 가능하다는 장점을 가지고 있다.

그림 7. Corning사의 Corning Spheroid microplates 및 3차원 세포 배양 실험 결과 [35]. [http://www.corning.com/catalog/cls/documents/protocols/CLS-AN-235.pdf]

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3차원 세포배양 기술의 연구 및 상용화 동향 최재원, 이동우 Page 11 / 20 그림 8. 96 Corning Spheroid microplate에서 세포 덩어리들이 균일하게 형성된 세포 염색 사진.

[http://www.corning.com/catalog/cls/documents/protocols/CLS-AN-235.pdf]

2) InSphero [36]

InSpero사는 3D InsightTM Microtissues라는 상품으로 3차원 세포배양용기를 상용화 시켰다. Hanging drop을 개선하여 고속 대용량 스크린이 가능하도록 96- 또는 384- Plate 형태로 배양용기를 설계한 것이 특징이다. Hanging drop으로 생성된 스페로이드는 다시 “V shape”의 웰로 이동되어 다양한 테스트를 진행할 수 있는 장점이 있다. 그림9는 세포를 뭉쳐서 배양 후에 V shape 웰에 스페로이드를 전사하는 프로토콜과 384 웰 플레이트에 스페로이드를 균일하게 형성한 실험결과를 보여준다. 그림 9. 3D InsightTM_{Microtissues 제품 및 384 웰에 세포가 덩어리를 형성한 실험 결과.} [http://www.perkinelmer.co.jp/Portals/0/resource/products_ls/assays/pdf/3D101%20-%20Plate%20Technologies%20-%20YueGeng.pdf]

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3) EMD Millipore Corporation [37]

EMD사의 CellASIC ONIX라는 상품으로 Microfluidics 기술을 활용해 세포를 세포외기질과 함께 3차원 세포배양이 가능한 플레이트 형태의 Microfluidics 플랫폼을 상용화 하였다. 실제로 플레이트 이외에 플레이트 내에 배양액 및 약물을 흘려줄 수 있는 유체 제어모듈도 함께 판매하고 있다. EMD사의 세포배양칩 연구는 미국 버클리대학에서 시작되어 상용화 되었으며, 마이크로유체 기술을 이용하여 세포에 연속적인 유체공급이 가능하여 보다 생체대응성이 뛰어난 것이 특징이다. 그림 10. CellASIC 제품 개념도 및 3차원 세포배양 사진. [https://www.imperial.ac.uk/media/imperial-college/medicine/facilities/film/CellAsics-Onix-Microfluidic-Platform-Brochure.pdf]

4) MBD (MEDICAL&BIO DECISION) [38-39]

MBD사는 한국기업으로 Cellvitro™이라는 상품으로 3차원 세포배양용기를 상용화 하였다. 최초로 마이크로필라 구조물에 세포와 세포외기질을 고정하고, 이를 마이크로 웰에 담구어 세포를 3차원으로 배양하는 세포칩을 상용화 하였고, 이후에 기존 96-과 384- plate에 호환이 되는 필라 Plate도 상용화 하였다. 필라/웰 구조는 세포와 세포외기질이 필라에 고정되어 있고, 이런 필라의 이동으로 배양액 및 약물의 교체가 손쉽다는 장점이 있다. 이러한 구조는 세포외기질을 사용하는 3차원 세포배양모델에서 배양액, 약물, 염색 시약의 교체가 어려운 단점을 극복한 사례이다.

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3차원 세포배양 기술의 연구 및 상용화 동향 최재원, 이동우 Page 13 / 20 그림 11. CellVitroTM_{의 제품에서 필라웰의 개념 및 3D cell-based High Throughput Screening (HTS) 제품 사진.}

[https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac402546b?journalCode=ancham]

그림 12. CellVitroTM_{의 제품인 Micropilar/microwell chip을 이용한 뇌종양 환자유래세포의 약물 효능성 분석 및}

유전체 데이터와 비교 검증. [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac402546b?journalCode=ancham]

5) SPL [40]

SPL사는 한국기업으로 SPL3DTM라는 상품으로 3차원 세포배양용기를 상용화 하였다. SPL은 세포배양 관련 용품 및 기기를 생산하는 국내 유일 업체로 최근에는 기술개발을 통해서 독자적인 3차원 배양용기를 개발하여 상용화 하였다. 12 well에 끼울 수 있는 Scaffold에 세포를 3차원으로 배양하는 타입으로 In vivo 환경과 유사한 3차원적 배양 환경 구현으로 체외에서 세포의 생리적 특성 유지를 가능하게 하며, 고차원적 Scaffold 구성을 통해 세포 배양 표면적을 극대화 시켰다. 또한 Suspension 세포 배양 기법으로 Spheroid Forming Unit (SFU)이라는 제품을 상용화 하였는데, Spheroid의 생성 및 생성 된 spheroid의 크기 증가(size up)에 용이하도록 설계되었다. 특히, SFU 제품의 뚜껑은 소수성 필터 멤브레인이 장착된 통기성 캡으로서, 세포배양 시 필요한 가스공급을 가능하게 함으로써 세포를 띄워서 배양하는 데 최적으로 설계되었다.

(14)

3차원 세포배양 기술의 연구 및 상용화 동향 최재원, 이동우 Page 14 / 20 그림 13. SPL사의 12-well에 Scaffold를 끼워 세포를 3차원으로 배양하는 SPL3DTM의 상품과 Suspension 세포 배양이 가능한 Spheroid Forming Unit (SFU) 15 ml 튜브의 제품 사진.

[http://www.spllifesciences.com/en/]

6) Organogenix [41]

Organogenix사는 NanoCulture Plate (NCP)를 Well plate(24, 96, 384)또는 dish 형태로 판매하고 있다. NCP는 하이드로 겔 또는 화학적 전처리 없이 Scaffold형 3D 배양 시스템이며, 배양 된 세포는 높은 증식 특성, 높은 균일성을 가지고 있어 기존 High Throughput Screening (HTS)에 적합하며, Low-binding/High-binding으로 원하는 monolayer를 형성할 수 있는 장점이 있다. 일본의 Organogenix사의 NanoCulture Plate 96-well는 종양 조직에서 암 초대 배양을 목적으로 하며, 특징으로는 ① 콜라겐 겔에 비해 배양 기간이 짧고 ② 전용 매체에 젤 성분을 포함하지 않고 배지 교환 등 실험이 가능하고 ③ 멀티 플레이트 형식으로 항암제 감수성 시험이 편리한 장점이 있다.

그림 14. Organogenix사의 NanoCulture Spheroid 제품 및 3차원 세포배양 사진. [http://www.nanocultureplate.com/common/pdf/1_Handbook_NCP.pdf]

7) Trevigen [42]

(15)

응집체 또는 회전 타원체는 생체 내 종양을 보다 잘 대표하며 유사한 형태학, 세포-세포 결합 형성, 증식 속도 감소, 세포 생존 증가, 종양 휴면 및 저산소성 코어를 비롯한 몇 가지 생리적 특성을 3D culture cell invasion 분석에 적용하여 종양 침범을 평가하는 데 생리적인 접근이 가능하며 이미지 분석을 통해 정량화 할 수 있는 시각적 구성 요소를 제공하고, Cultrex®_{3D Spheroid 세포 침공} 분석은 세포의 응집 및/또는 스페로이드 형성을 유도하는 특수 회전 타원체 형성 ECM과 함께 3D Cell culture 96 웰 스페로이드 형성 플레이트를 활용하고 Cultrex®_{3D Culture Spheroid Cell Invasion} Assay의 일부로 형성된 스페로이드에서 세포의 침입을 유도하도록 최적화 된 특수 세포외기질을 매트릭스로 사용하는 것이 장점이다 (그림 15).

그림 15. Trevigen사의 Cultrex®_{3D Culture Spheroid Cell Invasion Assay 제품 및 3차원 세포 배양 사진.}

[https://trevigen.com/docs/protocol/protocol_3500-096-K.pdf]

8) 3D Biomatrix [43]

3D Biomatrix사는 Perfecta3D®_{Hanging Drop Plates (96, 384)를 상용화하여, Hang in drop} 방식으로 세포를 응집시켜 단일 스페로이드를 쉽게 형성하는 플레이트 제품을 시장에 출시하였다. 홀에 파이펫 팁을 넣어서 세포와 미디어를 넣어서 물방울을 만드는 기술은 Insphero사의 3D InsightTM_{Microtissues 유사하지만 홀의 크기와 구조가 차이가 난다.}

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3차원 세포배양 기술의 연구 및 상용화 동향 최재원, 이동우 Page 16 / 20 그림 16. 3D Biomatrix사의 Perfecta3D®_{Hanging Drop Plates 제품 및 세포 개수에 따른 스페로이드 크기 변화}

그래프. [https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/perfecta3d-hdp1096-plate-handling-spheroid-formation-protocol.html]

2.6 3차원 세포배양모델의 기대효과

ㆍ정밀 의료

정밀의료(Precision Medicine)란 개인의 유전체 정보, 생활습관 정보 등, 다중 정보를 분석해 환자 맞춤형 치료제를 선정하는 것을 의미한다. 환자에게서 추출한 환자유래 세포를 환자 인체환경과 유사하게 3차원 세포배양하고, 다양한 약물에 대한 환자유래 3차원 세포배양모델의 반응을 분석함으로써 환자의 유전자 정보, 진료정보, 생활습관 정보와 함께 환자에게 최적화된 치료제를 선정할 수 있는 기준을 제시해 줄 것으로 기대된다.

ㆍ신약 개발

신약 개발은 크게 신약후보물질 탐색, 신약후보 물질의 비임상 시험 및 임상시험으로 나누어지는데 비임상 실험(동물실험) 및 임상실험에 천문학적인 비용과 시간이 소요된다. 일 예로, 50,000,000개의 물질 중에서 비임상(동물실험)/임상 실험에 들어가는 신약 후보가 되는 것은 250개 정도이고 여기서 비임상(동물 실험)과 임상실험을 거쳐서 1개 정도의 신약이 시장에 출시되는 실정이다. 특히, 최근에는 신약개발 확률이 더 낮아지고 있는 추세이다. 따라서 신약후보물질 탐색에서 기존 2차원 배양 세포를 이용한 약물 스크린 시스템을 3차원 세포배양모델을 이용한 약물 스크린 시스템으로 바꾸게 되면 보다 효과적이고 정확한 신약후보 물질을 탐색이 가능하여 비임상/임상 실험에 드는 천문학적인 비용과 시간을 획기적으로 줄일 수 있을 것으로 기대된다.

(17)

ㆍ기초연구

일반 생물학 연구에 있어서, 생체를 모방한 3차원 세포배양모델을 활용하게 되면 약물의 기전, 인체 내 세포 분화 연구 등 다양한 생물학 기초연구에 활용될 것으로 기대된다. 그림 17. 3차원 세포배양모델의 기대효과.

3. 결론

이상으로 주요 3차원 세포배양모델에 대해서 정리하고, 이러한 모델들 중에서 상용화 되어 시판되는 제품 및 회사에 대해서 살펴보았다. 2차원 세포배양모델과 달리 3차원 세포배양모델은 세포외기질, 배양용기의 구조, 사용 세포의 특성, 배양액의 조성에 따라 다양한 모델이 가능하여 정형화 되거나 표준화 된 모델이 아직 없다. 따라서, 지금도 많은 연구자들이 3차원 세포배양모델을 개발하고 있으며, 이를 상용화 하려는 시도들이 많다. 실제로 세포배양 관련 제품을 판매하는 국내외 업체들을 위주로 속속 3차원 세포배양 관련 배양용기나 시약 등이 판매되고 있고, 3차원 세포배양모델에 특화된 기술을 바탕으로 국제적으로 스타트업 업체들이 제품을 출시하고 있지만 아직은 걸음마 단계로 일반 실험실 또는 병원에서 일반 실험자가 손쉽게 사용할 수 있는 수준이 되지는 못하고 있다. 실제로 제품을 출시하여 상용화는 하지만 생명과학 또는 의료분야에 종사하는 실험자가 이를 소비하는 시장을 형성하기에는 3차원 세포배양모델은 아직 많은 허들을 가지고 있는 것이 사실이다. 필자가 생각하는 허들은 크게 2가지로 요약할 수 있다. (사용자 편의성 문제) 3차원 세포배양모델은 세포를 3차원으로 덩어리를 형성하면서 키워야 하기 때문에 배양액의 교체, 세포외기질의 유지 또는 교차 오염 등으로 실험할 때 상당한 노하우가 필요하다. 일 예로, Suspension 세포배양의 경우 세포 덩어리가 고정되지 않아 배양액 교체하면서 덩어리가 suction machine에 빨려가는 문제가 발생하고, Hydrogel에서 세포를 3차원 배양하는 경우 suction machine에 의해 Hydrogel이 무너지는 문제들이 종종 발생한다. 이러한 문제는 배양액

(18)

3차원 세포배양 기술의 연구 및 상용화 동향 최재원, 이동우 Page 18 / 20 교체가 편리한 배양용기를 개발하여, 실험과정을 쉽고 단순화 하는 노력이 필요할 것으로 사료된다. (분석의 표준화 문제) 2차원 세포배양에서 세포의 활성은 MTT assay 또는 ATP 활성을 측정하는 Luminescence assay을 통해서 간접 측정하는 방식이 표준화가 잘되어 있다. 하지만, 3차원 세포배양모델은 세포가 3차원으로 덩어리져서 자리기 때문에 기존 MTT나 ATP 시약의 확산과 투과도가 세포 덩어리(스페로이드)마다 상이하여 적용에는 한계가 있다. 현재까지 나온 방식은 세포 덩어리(스페로이드)를 염색하여 크기를 측정하는 방식이 일반적이다. 하지만, 이러한 방식은 세포 덩어리 안에 있는 세포의 활성을 대변하기는 어렵다. 따라서, 조직 투명화(CLARITY))나 컨포컬 마이크로스콥(confocal Microscope)을 사용하여 세포 덩어리에서 세포의 활성을 정밀 측정하려는 노력이 계속되고 있지만 기술의 표준화는 아직 되지 않고 있는 실정이다. 따라서, 지속적인 연구개발로 이러한 문제들이 해결되어 기술이 표준화 된다면 생체 대응성이 뛰어난 3차원 세포배양모델은 정밀의료, 신약바이오산업, 기초연구 분야에 큰 파급효과를 가져올 것으로 기대된다.

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