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Tumor suppressive effect of PARP1-FOXO3 pathway

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이학 석사학위 논문

PARP1-FOXO3 신호경로의 종양

억제 효과

아 주 대 학 교 대 학 원

의생명과학과/분자의학전공

조 유 나

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PARP1-FOXO3 신호경로의 종양

억제 효과

지도교수 우 현 구

이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함.

2014년 12월

아 주 대 학 교 대 학 원

의생명과학과/분자의학전공

조 유 나

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- 국문요약 -

PARP1-FOXO3 신호경로의 종양 억제 효과

위암 (Gastric cancer) 은 매년 전세계에서 암 사망률의 주요 원인 중 하나이다. 위암과 관련된 여러 가지 새로운 종양 유전자와 종양 억제 유전자를 찾는 것은 조기 진단과 표적 치료의 발전을 위해 도움이 될 수 있다. 그 중 Poly (ADP-ribose) polymerase1 (PARP1) 은 많은 암 종류에서 항암치료의 타겟으로 보고되어 왔으며 PARP1 억제제를 이용한 임상시험이 다양한 암 종을 바탕으로 진행되었으며 현재까지 수행되고 있다. 하지만, PARP1 을 저해하게 되면 종양 발달이 어떻게 억제가 되는지 충분히 설명되어지지 않고 있다. 따라서, 위암 세포를 이용하여 PARP1 저해제인 올라파립 (Olaparib) 뿐만 아니라 PARP1 siRNA 를 가지고 PARP1 의 저해가 암세포의 성장을 어떻게 조절하는지를 보여주었으며 PARP1 저해에 의한 FOXO3 의 발현 증가를 통해 종양을 억제하는 효과를 가져온다. 뿐만 아니라, 166 개의 tumor stage-matched 위암 환자 샘플을 사용하여 PARP1 과 FOXO3 발현을 조직 마이크로 어레이로 평가하였다. 다변량 분석을 통해 PARP1 및 FOXO3 의 발현 차이에 따른 생존 곡선을 비교한 결과, 전체 생존 기간 (overall survival, PARP1; P = 0.021, FOXO3; P = 0.001) 및 무 재발 생존 기간 (relapse-free survival, PARP1; P = 0.021, FOXO3; P = 0.001) 의 영향을 주는 요인으로써 암의 독립적인 예후 지표로 활용 가능하다는 것을 확인하였다. 결론적으로, 우리의 결과는 PARP1- FOXO3 신호는 임상적인 의미와 암세포의

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성장에 중요한 역할을 한다는 것을 입증하였고, 이는 암 치료에 있어 PARP1-FOXO3 신호는 새로운 메커니즘과 임상 통찰력을 제안 할 수 있다.

핵심어 : 올라파립, PARP1, FOXO3, 위암세포, 암

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차 례

국문요약 ··· ⅰ 차례 ··· ⅲ 그림 차례 ··· ⅴ 표 차례 ··· ⅵ Ⅰ. 서론 ··· 1 Ⅱ. 재료 및 방법 ··· 7 A. 위암세포 배양 ··· 7 B. 약물처리 ··· 7 C. siRNA Transfection ··· 8 D. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylteteazolium bromide)assay ··· 8 E. Cell counting ··· 8

F. Colony forming assay ··· 9

G. Western blotting ··· 9 H. 환자 및 표본 ··· 10 I. Tissue microarray ··· 11 J. RNA 분리 및 real-time PCR ··· 12 K. 통계처리 ··· 13 Ⅲ. 결과 ··· 15

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A. 위암 세포에서 PARP1 의 억제의 세포 성장 억제 ··· 15 B. PAPR1 의 억제는 FOXO3 의 발현 유도 ··· 19 C. PARP1 과 FOXO3 의 발현과 위암 환자 임상결과 ··· 2 1 D. PARP1 과 FOXO3 발현은 위암 환자의 생존율에 영향 ··· 32 Ⅳ. 고찰 ··· 38 Ⅴ. 결론 ··· 44 참고문헌 ··· 45 ABSTRACT ··· 56

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그림 차례

Fig. 1. Anti-proliferation activity of Olaparib and PARP1 siRNA against carcinoma cells ··· 17

Fig. 2. FOXO3 protein up-regulation by PARP1 inhibition ··· 20

Fig. 3. Immunohistochemistry expression of PARP1 and FOXO3 and Kaplan-Meier survival analysis in gastric carcinoma ··· 26

Fig. 4. Kaplan-Meier survival analysis in subgroups gastric carcinomas according to the expression of PARP1 and FOXO3 ··· 34

Fig. 5. Kaplan-Meier survival analysis in gastric carcinomas according to the expression score of PARP1 and FOXO3 ··· 36

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표 차례

Table 1. Primers of target genes. ··· 13

Table 2. Clinic pathologic variables and the expression status of PARP1 and FOXO3. 23

Table 3. Univariate and multivariate Cox proportional hazards regression analysis for relapse-free survival and overall survival in gastric carcinoma patients. ···· 30

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I. 서 론

위암 (Gastric cancer)은 전세계적으로 매년 백만 명 정도의 새로운 사례가 보고되며, 암 사망률의 주요 원인 중 하나이다 (Caruso et al., 2002; Zhang et al., 2008; Ma et al., 2010; Jemal et al., 2011). 위암의 발병 증가는 특히 중국, 일본, 한국 그리고 동아시아 국가에서 많이 보고되고 있다. 특히 동아시아에서는 다른 아시아 지역보다도 높은 발병률이 보고되고 있다 (Ma et al., 2010). 서양 국가에서는 사망률이 점점 감소하면서 위암을 중요한 공중 보건 문제로 생각하여 위암 환자들의 수술 후 행적을 추적하며 관리하고 있다. 위암의 원인 중 하나인 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 의 양성반응은 매우 밀접하게 아시아에서의 위암 발생 확률과 관련이 있다고 나타내고 있다. 현재, 아시아 지역에서는 헬리코박터 파일로리와 위암의 연관성을 찾고, 위암의 예방 및 조기 발견에 초점을 맞추어 연구가 진행되고 있다 (Rahman et al., 2014). 위암의 치료 방법으로는 수술 요법, 화학 요법, 방사선 치료 방법이 사용되어 지고 있다. 현재, 위암으로 진단 받은 대부분 (약 80%) 의 환자에게는 수술 요법이 사용되고 있다 (Chen et al., 2008). 위암에서 화학적 요법의 사용은 진행성 위암에 대한 대체 치료로 사용 되고 있다. 이러한 위암 치료에 대한 진단 및 치료 양상의 큰 발전에도 불구하고, 위암의 치료 방법은 매우 낮은 생존율을 나타내고 있다 (Zhao et al., 2012). 현재 보고된 연구에 의하면 위암 환자에게 화학적 요법을 처리한 결과, 다른 암에서의 화학적 요법을 사용한 치료 결과

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수준에 비해 현저하게 낮은 예후와 전체 생존기간보다 낮은 1 년 미만의 생존 기간을 나타내고 있다고 보고되고 있다 (Shah and Kelsen, 2010; Oh, 2012).

위암 환자의 치료 결과를 개선하기 위해서는 조기 진단 및 위암의 효과적인 치료를 위해 새로운 타겟을 찾는 것은 임상적으로 중요하다 (Chen et al., 2005; Yasui et al., 2005). 따라서, 위암과 관련된 여러 가지 새로운 종양 유전자와 종양 억제 유전자를 찾는 것은 조기 진단과 표적 치료의 발전을 위해 도움이 될 수 있다. 그런 이유로 우리는 위암에서 PARP1 의 발현이 종양 발달에 기여한다는 연구 결과를 알고 PARP1 을 억제 하였을 때, 위암에서 어떤 작용을 하는지 확인해 보기로 하였다.

poly (ADP-ribose) polymerase1 (PARP) 는 17 개의 단백질로 구성된 큰 집단을 말한다 (Ame et al., 2004). 이 논문에서 사용하고자 하는 PARP1 은 113kDa 단백질로, 핵에 위치하고 있다. PARP1 유전자는 염색체 1(1q42.12) 번의 긴 팔에 위치한다. 그들은 모두 네 개의 도메인을 가지고 있다: 촉매작용 (catalytic), 자동수정 (auto-modification), 카스파제 절단 (caspase-cleaved), 그리고 DNA 결합 (DNA-binding) 도메인 (Kurosaki et al., 1987).

PARP1 은 DNA break binding 및 손상 위치에 DNA 복구 단백질을 포집하여 염기 삭제 복구 경로 (base excision repair pathway) 에 중요한 역할을 한다 (Burkle, 2001). PARP1 은 종합 효소의 일종으로 NAD+에서 ADP 활성화하는 대상 단백질이다. 그 주요 기능 중 하나는 단일가닥 DNA 절단 (SSB : single strand DNA breaks) 을 고치는 역할을 한다 (Kim et al., 2005; Csonka et al., 2014). 그리고 암에서의 PARP1 단백질 발현은 보통 높은 발현을 보이며, 이는 종양 세포에 생존과 발달에 PARP1 이 관련이 있다는 것을 암시한다 (Bryant et al., 2005;

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Kummar et al., 2012). 임상 분석의 최근 보고에 따르면 이와 같은 유방암, 난소암, 피부암인 흑색종에서 효소인 PARP1 의 활성은 종양 개발에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다 (Jemal et al., 2011; Hassumi-Fukasawa et al., 2012; Rojo et al., 2012; Gan et al., 2013). PARP1 는 항암제로 인한 DNA 손상의 회복을 도와 항암제를 비효과적으로 만든다 (Singh, 1991; Sandhu et al., 2013). 이전 연구 결과에 의해 암세포 내에서 종종 PARP1 활성이 증가되기 때문에 PARP1 는 암세포의 생존 메커니즘을 제공한다는 사실을 알게 되었다. PARP1 억제제는 암세포의 DNA 회복을 억제하고 방사선과 알킬화제 같은 일반적인 암치료제의 효과를 증가시킨다. 그러므로 PARP1 은 DNA 복구를 도와줌으로 PARP1 억제제는 종양을 치료하는 어떤 항생제보다 민감하게 만들 수 있을 것이며 또한 단독 요법으로 사용 가능할 만큼 강력할 것이다. 따라서, PARP1 는 여전히 임상의 진행에 있어 적극적으로 항암 치료 개발을 위한 가장 필요한 의약품이 될 수 있는 타겟으로 생각된다. 이런 이유로 poly (ADP-ribose) polymerase1 (PARP1) 는 많은 암 종류의 치료 타겟이 될 것으로 보고 있다. PARP1 에 특정 화학 저해제와 임상 시험의 지금까지 많이 이루어 여전히 진행 되었다. 그 중에 PARP1 억제제인 올라파립 (Olaparib, AZD2281) 에 의한 PARP1 억제는 복제하는 동안 수리되지 않은 SSB (single strand break) 의 전환으로 인하여 DNA 의 DSB (double strand break) 을 형성하게 되고 이 DSB 를 세포생존과 치료저항의 결과로 NHEJ (Non-homologous end joining) 경로에 의해 cell death 가 일어나게 된다고 보고되어 졌다 (Plummer et al., 2008; Audeh et al., 2010; Tsai et al., 2010; Tutt et al., 2010; Forster et al., 2011). 이러한 PARP1 에 대한 연구에도 불구하고 여전히 PARP1 의 억제는 종양 발달을 억제 할 수 있는 방법을 충분히 설명할 수 없다.

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그래서 우리는 PARP1 을 저해하게 되면 어떠한 신호경로를 통해 종양 발달이 억제되는지 확인하고자 본 논문에서 실험을 진행하였다.

이전 연구결과에 따르면, PARP1 을 억제하면 세포 증식이 감소되고, 이러한 세포 증식 감소는 FOXO1 에 의존적인 세포사멸 유도에 의한 감소라는 보고가 있었다. 이로 미루어 볼 때, FOXO1 과 같은 FOXO 패밀리 전사인자 중 종양 억제 유전자인 FOXO3 와도 연관이 있을 거라는 것을 암시한다 (Sakamaki et al., 2009).

Forkhead box O3 (FOXO3) 는 fork head 클래스 'O'의 멤버 (FOXO) 로 전사 인자 패밀리이다. FOXO3 유전자는 염색체 6(6q21) 번의 긴 팔에 위치한다. DNA 손상 복구, 아폽토시스, 세포주기 조절과 같은 생물학적 과정의 넓은 스펙트럼을 제어한다 (Galili et al., 1993; Anderson et al., 1998; Jacobs et al., 2003). FOXO3 는 종양 억제 전사 요인 유전자로 주로 세포주기 정지 및 / 또는 세포 사멸에 대한 책임이 있는 p27, Bim, Fas ligands, 그리고 GADD45α 와 같은 주요 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다 (Lam et al., 2013). 최근에 유방암, 난소암, 간암, 위암 포함한 종양의 발생을 예방하기 위해 개발되고 있고 다양한 화학적 종양 억제 전사 인자로서 FOXO3 의 작동 과정을 통해 새로운 치료제 역할을 할 수 있다고 보고되었다 (Wang and Feng, 2006; Stan et al., 2008; Fei et al., 2009a; Yuan et al., 2011). 이러한 전략의 주요 메커니즘은 보통 세포에서 FOXO3 단백질의 위치 제어에 기초한다. FOXO3 는 전사 기능을 갖는

핵에서 유지되어야 종양을 억제하기 때문에, 종양 세포는 핵에서

세포질로 FOXO3 단백질 보내서 FOXO3 종양 억제 기능을 차단하는 신호 기작을 갖는다. 예를 들어, AKT 가 활성화되면 FOXO3 가 인산화되고, 프로테아좀 – 매개 유비퀴틴화를 위해 Skp2 가 모이게 되고, 그 결과로 인해

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FOXO3 단백질의 빠른 저하 (faster degradation) 를 초래하게 되면서 세포의 성장을 도와 종양을 형성하게 된다 (Myatt and Lam, 2007; Huang and Tindall, 2011).

FOXO3 유전자는 장수 유전자로 잘 알려져 있었는데, 최근 다양한 암의 성장을 막을 수 있는 중요한 유전자로 밝혀져 주목을 받고 있다. 그러나 FOXO3 유전자가 암세포에서 어떤 메커니즘에 의해 작동되는지는 명확하게 밝혀지지 않았다. FOXO3 의 작용 기전을 이용하여 이를 활성화시키는 항암제를 만든다면 기존 항암치료제의 부작용은 줄이면서 항암 효과는 높일 수 있는 항암제를 만들 수 있을 것이라고 생각되고, FOXO3 가 활성화된다면 치료에 큰 도움이 될 것으로 기대한다 (Chung et al., 2012). 이전 연구 결과를 통해 위암에서 PARP1 의 활성화는 암의 발달과 연관성이 있다는 결과가 있었다 (Nossa et al., 2009). 그 연구 결과를 바탕으로 PARP1 과 종양 발달의 상관 관계를 알아보기 위해 PARP1 억제제 중 하나인 Olaparib (AZD2281)을 사용하여 위암 발달을 억제시키고 거기에 따른 메커니즘이 있는지를 확인하기 위해 실험이 진행 되었고 PARP1 와 FOXO3 사이의 관계를 암의 발달과정과 연관 지어 평가하기 위해 노력하였다. 위암 세포를 사용함으로써, 우리는 PARP1 의 억제는 세포 사멸 신호의 활성화와 암세포의 성장을 감소 시킬 수 있음을 관찰할 것이다. 또한, PARP1 과 FOXO3 발현 상태는 위암 조직 마이크로 어레이 (TMA; Tissue Microarray) 를 조사함으로써 평가하고, 단변량과 다변량 콕스 비례 위험 회귀 분석을 통해 생존함수를 추정, 생존율에 영향을 미치는 위험인자를 알아보기 위해 조사하였으며, Kaplan-Meier 생존분석을 통해 생존율의 추정 및 군의 생존율 비교를 통해 PARP1 과 FOXO3 의 상관관계와 임상 데이터의 적용이 가능한지 여부를 판단할 것이다. 우리의

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결과는 PARP1-FOXO3 의 암의 신호 전달 경로에 대한 새로운 생물학적, 임상적인 통찰력을 제공 할 것이라고 예상한다.

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Ⅱ. 재료 및 방법

A. 위암 세포 배양

위암 세포를 배양하기 위해서 액체질소탱크에 보관되어 있던 세포를 37℃ water bath 에서 해동하여 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco, NY, U.S.)와 1% P/S (Penicillin/Streptomycin, Gibco, NY, U.S.)이 포함되어 있는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, High Glucose, GlutaMAX™, Gibco, NY, USA) 배지를 사용하여 위암 세포인 NCI-N87 을 100Ø dish 에 seeding 하여 37℃에서 5% CO2 가 포함된 배양기에서 배양하였고 다른 위암 세포인 MKN28, MKN74 는 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco, NY, U.S.)와 1% P/S (penicillin/streptomycin, Gibco, NY, U.S.)이 포함되어 있는 RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640, GlutaMAX™, Gibco, NY, USA) 배지를 사용하여 배양하였다. 배지는 2~3 일 간격으로 교체해주었다.

B. 약물처리

100Ø dish 에서 키운 cell 을 6well 에 1X104cell 을 seeding 하고 60Ø dish 에는 1X105cell 을 seeding 한 후, plate 에 cell 이 잘 붙도록 10% FBS 와 1% P/S 이 포함되어 있는 DMEM 배지 조건에서 하루 동안 안정화 시간을 거친 후, PARP1 저해제인 Olaparib (AZD2281, Selleckchem, Houston, TX) 을 각각 0, 2.5, 5, 10uM 의 농도로 처리하였다. 컨트롤로는 DMSO 를 사용하였다.

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C. siRNA Transfection

Transfection 을 하기 위해 전날 6well plate 에서 1X104 cell 을 seeding 한 후 에 transfection reagent 인 Lipofectamine 2000 (Invitrogen™, USA)을 사용하여 PARP1 siRNA (Santa cruz, CA) 와 FOXO3 siRNA (Santa cruz, CA)로 유전자 발현 여부 및 유전자 침묵으로 인한 암에 대한 세포사멸 효과와 다른 유전자와의 상관관계를 알아보는 실험을 하였다.

D. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylteteazolium bromide) assay

MTT assay 를 통해 Cell viability 를 측정 하였다. 96well plate 에 5mg/ml MTT ((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylteteazolium bromide) assay, sigma Aldrich, USA) 를 최종 농도가 0.5mg/ml 이 되도록 배지에 첨가하고 빛을 차단시킨 후, 37℃, 5% CO2 배양기에서 2 시간 +α 동안 배양하였다. 2 시간 뒤, 각 well 의 배지는 제거해주고 100ul 의 DMSO (dimethyl sulfoxide, sigma-Aldrich, USA) 를 넣어주었다. Spectrophotometer (VERSAmax, Molecular Devices) 를 이용하여 560nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

E. Cell counting

6well 에 seeding 한 plate 에 배지를 section 하고 PBS (Gibco, NY, U.S.) wash 한 후에 TE buffer (200ul) 를 well 당 넣어준다. 그리고 약 5 분 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 incubation 한 후에 1.5ml microtube 에 cell 을 모은 후 Trypan blue solution (sigma-Aldrich, USA) 을 1.5ml microtube 에 counting 할 세포와 1:1 비율로 맞춘 뒤 파이펫팅 해준 후 microscope

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(Axiovert, Carl Zeiss) 로 죽어있는 세포와 살아있는 세포를 관찰하고 count 하였다. Trypan blue 에 양성인 세포는 count 하지 않았다.

F. Colony forming assay

2X103 cell 이 깔린 60Ø dish 에 배지를 section 한 후 PBS 로 두 번 wash 해주고 Methanol (DAEJUNG, Korea) 2ml 넣고 10 분간 cell 을 고정 시킨다. 10 분 후 PBS 로 두 번 wash 해주고 0.05% crystal violet (sigma-Aldrich, USA) 을 2ml 넣고 cell 을 10 분간 염색시켜준다. 10 분 후 PBS 로 crystal violet 의 색이 없어질 때까지 wash 한 후 건조 시킨다. 건조가 되면 스캐너를 사용하여 Olaparib 을 처리한 군과 처리하지 않은 군을 비교하였다.

G. Western blotting

1X104 cell/6well plate 의 각 well 을 PBS 로 한 번 wash 한 후 TE buffer (Gibco, NY, U.S.) 200ul 를 넣고 5 분간 37℃, 5% CO2 배양기에서 incubation 한다. 그 후 1.5ml micro tube 에 cell 을 모은 후 RIPA lysis buffer 를 약물 처리군과 대조군에 각각 100ul 씩 넣어준다. 10 초간 sonication 하여 세포를 파쇄한 뒤에 4℃, 1400rpm 에서 10 분 동안 원심분리를 돌린 후, 상층액을 새 1.5ml micro tube 에 옮겨 시료로 사용하였다. 96well plate 에 시료를 2ul 씩 넣고 Bradford (GenDEPOT, USA) 200ul 씩 첨가해 주었다. 그리고 잠시 반응시킨 후에 spectrophotometer (VERSAmax, Molecular Devices)를 이용하여 560nm 파장에서 흡광도를

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측정하여 protein 을 정량 하였다. Laemli sample buffer(80nM Tris-HCl pH 6.8, 10% Glycerol, 5% Mercaptoehanol, 2.5% SDS, 0.032% Bromophenolblue, H2O)를 첨가하여 동량의 단백시료를 만든 다음, 100℃에서 5 분 동안 단백 시료를 끓이고, 각 시료는 12% SDS PAGE-GEL 에서 단백질 사이즈 별로 분리해주었다. 그 다음, wet transfer 를 이용하여 NC (nitrocellulose) membrane (BIO-RAD, USA)에 전기적으로 단백질을 이동시키고 3% BSA (GenDEPOT, USA)로 shakers 에서 1 시간 30 분간 blocking 하였다. 1 차 antibody 로 사용한 FOXO3 (santa cruz, CA, 1:1000), Actin (, 1:1000)은 4℃ shakers 에서 O/N 시키고 2 차 antibody 로 사용한 HRP (mouse or rabbit,

1:5000)는 RT (37℃) shakers 에서 1 시간 이상 반응시켰다. 그리고 ECL detection reagent (GenDEPOT, USA)로 발색시킨 후, film 을 사용, auto developer 를 통해 단백질을 분석하였다.

H. 환자 및 표본

Tissue microarray 분석은 이전에 행해졌던 연구에서 사용한 위암 환자 177 케이스 중 166 케이스를 사용하여 진행하였다 (Cha et al., 2009). 위암의 177 케이스 중 약 11 케이스는 이전의 paraffin-embedded tissue-microarray blocks 을 사용하여 새로운 조직 마이크로 어레이 (TMA)를 확립하기에 적절하지 않았다. 그래서 166 의 위암환자 케이스를 가지고 연구를 진행하였다. 1997 년 1 월부터 2005 년 12 월까지 전북대학교 병원에서 근치 위 절제술을 받은 환자의 샘플로 사용하였다. 이 위암의

(20)

세트는 종양 단계별 수술 (originally 50 cases for the each stage I, II, III, and IV

)

성별, 연령(± 2 년

)

, 연도(± 2 년

)

에 대한 일치된 집합이었다. 그러나, 이 과정은 AJCC (American Joint Committee on Cancer) 스테이지 시스템 6 판을 기반으로 했다. 그 후, 우리는 AJCC 스테이지 시스템 7 판의 가이드 라인에 따라 166 케이스를 다시 세계 보건기구 (WHO)의 분류 기준에 따라 검토하였다 (Washington, 2010). 본 연구는 전북 대학교 병원의 기관 심사위원회에서 승인되었다. 동의서는 헬싱키 선언에 따라 제공되었다. 환자의 연령, 성별, 암태아성 항원 (CEA: carcinoembryonic) 과 종양 표지자 CA 19-9 수치, 종양의 단계 (I 과 III 대 II 과 IV), 림프절 전이, 원격 전이 유무, 정맥 침략의 존재, 조직학적 유형의 존재에 따라 WHO 의 분류, 조직 학적 등급의 관암종 및 유두암종, 로렌 분류, 종양 침윤에 따라 분류 하였다 (Hassumi-Fukasawa et al., 2012; Rojo et al., 2012; Gan et al., 2013). I. Tissue-micro array 면역 조직 화학 염색법 (immunohistochemistry; IHC)을 이용하여 위암 환자들로부터 수술로 암 조직을 적출하고 이를 paraffin-embedded tissue-microarray blocks 에 일정한 크기인 케이스 당 3.0 mm 코어 정도 크기로 조직 마이크로 어레이 분석을 하였다. 조직 절편을 20 분 동안 pH 6.0 시트르산 나트륨 완충액 마이크로파 항원 검색 절차로 처리 하였고 마커는 PARP1 (H-300) (1: 100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 및

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FOXO3 (D19A7) (1: 100, Cell Signaling Technology, Beverly, MA)를 사용하였다. 인간의 위 샘플에서 PARP1 및 FOXO3 에 대한 면역 조직 화학 염색에 대한 평가는 임상 정보에 대한 지식 없이 합의에 의해 병리학자 (Jang KY and Kim KM)에 의해 수행되었다.

J. RNA 분리 및 RT-qPCR

1X105 cell 을 seeding 한 60Ø dish 를 PBS 로 wash 한 후, TE buffer

200ul 씩 넣은 후 5 분간 37℃, 5% CO2 배양기에서 incubation 한다. 1.5ml micro tube 에 cell 을 모은 후 1 분, 3000rpm 에서 원심 분리하여 cell 을 모았다. 그리고 PBS wash 를 두 번 해주고 mirVana™ miRNA Isolation Kit (Ambion, life technologies, U.S.)에 lysis buffer 600ul 씩 넣은 후 60ul 를 넣고 ice 에서 10 분간 incubation 시킨다. 그 후 phenol 600ul 씩 넣은 후 vortexing 한 후 5 분, 13000rpm 으로 원심분리 하였다. 상층액을 새 tube 에 옮긴 후, 상층액의 1.25 배의 100% Ethanol 을 넣어준 후 파이펫으로 천천히 pipetting 한 후 필터에 700ul 씩 넣고 15 초, 13000rpm 으로 필터 시켜준다. 그리고 wash buffer 1, 700ul 씩 넣고 10 초, 13000rpm 으로 wash 해준다. Wash buffer 2/3, 500ul 씩 넣고 10 초, 13000rpm 으로 wash

해준다. 그 후 남아있는 wash buffer 를 날려주기 위해 1 분,

135000rpm 으로 원심분리 한다. 그리고 상온에서 tube 뚜껑을 연 체로 5 분간 방치 후 95℃ NF water, 50ul 씩 넣은 후 30 초, 135000rpm 으로 원심분리 후 Nano Drop(ND-1000 spectrophotometer, Pharamacia LKB,

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Finland)으로 정량 하였다. 그런 다음 1ug total RNA 와 cDNA 합성 kit 를 넣고 real-time PCR 을 하였다. real-time PCR 은 cDNA template 2ul 와 5pM sense, antisense primer(Bioneer, Korea), sso SYBR premix (BIO-RAD, USA)를 넣어 수행하였고, PCR 에 사용한 primer 는 다음과 같다.

Table 1. Primers of target genes.

Target gene Primer sequence

PARP1 sense CTACTCGGTCCACGCTCGCC

anti-sense TTGAAAAAGCCCTAAAGGCTCA

FOXO3 sense TCTACGAGTGGATGGTGCGTT

anti-sense CGACTATGCAGTGACAGGTTGTG

GAPDH sense ACCCAGAAGACTGTGGATGG

anti-sense TTCTAGACGGCAGGTCAGGT

K. 통계처리

PARP1 및 FOXO3 의 면역 조직 화학적 발현은 환자의 생존 기간 예측으로 높은 진단적 신뢰성을 나타내는 Likehood ratio 포인트에서 ROC (Receiver Operating Characteristic) 곡선 분석에 의해 양 또는 음으로 그룹화 하였다. PARP1 의 면역 염색의 합계 점수에 대한 cut-off 포인트는 6 이었고 FOXO3 의 면역 염색에 대한 cut-off 포인트는 7 이었다. 면역 조직 화학 염색에서 합계보다 PARP1 의 값이 ≥6 일 때, FOXO3 의 값이 ≥7 일 때 양성을 획득하였다. 변수 임상 병리학적 요인과 PARP1 또는 FOXO3 의 발현과의 연관성을 비교하기 위해 피어슨 카이 제곱 검정을 사용 하였다. PARP1 과 FOXO3 의 발현이 진단에 영향을 주는지 평가하기 위해, 전체 생존기간 (Overall survival)과 무 재발 생존기간 (relapse-free

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survival)을 평가하였다. 2011 년 12 월까지 추적조사를 마친 데이터를 사용하여 평가하였다. 전체 생존기간은 2011 년까지 위암환자들의 마지막 접촉 또는 사망 기간을 계산하였다. 무 재발 생존기간의 위암에서는 마지막 접촉, 재발 또는 사망기간을 계산하였다. 단변량과 다변량 콕스 비례 위험 회귀분석 (Cox proportional hazards regression analyses) 및 Kaplan-Meier 생존 분석은 SPSS 소프트웨어(버전 19.0)를 사용하여 수행 하였다.

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Ⅲ. 결과

A. 위암 세포에서 PARP1 의 억제의 세포 성장 억제

PARP1 이 과연 암세포의 발달과정에 어떠한 영향을 끼치는지 확인하기 위해 PARP1 을 저해시키는 약물인 Olaparib (AZD2281)을 위암 세포인 NCI-N87, MKN28 그리고 MKN74 를 이용하여 IC50 값 (10uM) 외의 여러 농도로 처리하여 Cell proliferation 을 알아보는 실험인 MTT assay, cell counting, colony forming assay 를 진행하였다.

MTT assay 를 하기 위해 24well plate 에 위암 세포를 각각 1X104cell 씩 깔아준 후 Olaparib 을 0, 2.5, 5, 10uM 로 처리한 결과, Olaparib 을 처리한 모든 농도에서 암세포 성장을 저해하는 효과를 나타났다. 72 시간 이후, Olaparib 의 IC50 값인 10uM 보다 더 낮은 농도에서도 세포 성장이 줄어드는 결과를 보였다 (Fig. 1A).

cell count 를 하기 위해 6well plate 에 위암 세포를 각각 1X104 cell 을 깔아준 후 Olaparib (0, 2.5uM) 을 처리하고 시간 별 (24, 72, 120hr) 로 관찰한 결과에서도 MTT 결과와 비슷하게 시간이 지날수록 암세포의 성장을 억제하는 효과를 보였다 (Fig. 1A). 위암 세포에 Olaparib 2.5uM 을 처리한 군과 비교군인 DMSO 를 처리한 군을 120 시간 동안 배양한 결과이다 (Fig. 1A).

MTT assay 와 cell counting 결과를 확인 후 cell proliferation 의 또 다른 확인 방법인 colony forming assay 를 진행하였다. Colony forming assay 는 60Ø dish 에

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위암 세포 각각 2X103 cell 을 깔아 준 후 Olaparib 2.5uM 을 처리한 후 14 일 동안 배양한 후 100% methanol 로 세포를 고정시킨 후 0.05% crystal violet 으로 염색한 결과로 Olaparib 을 처리하지 않은 군보다 Olaparib 을 처리한 군에서 50% 이상 세포 성장이 억제되는 것을 보았다 (Fig. 1C). 앞에서 진행한 cell proliferation 실험 결과를 종합해 보면 위암 세포에 PARP1 저헤제인 Olaparib 약물이 암세포의 성장을 저해시킨다는 것을 확인 할 수 있었다. 과연, 이러한 위암 성장을 PARP1 의 억제에 의한 억제 효과인지 확인하기 위해 PARP1 을 직접적으로 Knock-Down 시키는 siRNA Transfection 실험을 진행하였다. 그 결과, 위암 세포에 PARP1 siRNA 를 처리한 군에서 PARP1 을 Knock-Down 시키지 않은 대조군 보다 위암 세포의 성장률이 상당히 억제되었다는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1C 그리고 1D). 위의 실험 결과로 미루어보아 Olaparib 과 PARP1 siRNA 즉, PARP1 을 저해하게 되면 위암 세포의 성장을 억제 시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

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Figure 1. Anti-proliferation activity of Olaparib and PARP1 siRNA against gastric cancer cells.

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(A) Dose-dependent effect of Olaparib (0, 2.5, 5, and 10uM) after 72 h incubation. The cell viability was determined by MTT assay and the relative cell survival rate percentage was calculated by dividing the optical density of each treatment condition by the optical density of the control (DMSO) treatment. Time-dependent effect of Olaparib (0 and 2.5uM) for 0, 24, 72, and 120 h. NCI-N87, MKN74 and MKN28 cells treated with Olaparib for 0, 24, 72, and 120 h. The cell viability was determined by cell counting assay. (B) Colony formation assay of NCI-N87, MKN74 and MKN28 cells treated with Olaparib (0 and 2.5uM) for 14 days. Colony formation assay was done as described in Materials and Methods. These results are from one of the representative data out of three biological replicates. (C) Cell counting assay for time-dependent effect of PARP1 knock-down by PARP1 siRNA transfection. Cells were transfected with control or PARP1 siRNA for 4 and 7 days and the cell viability was determined by cell counting assay. (D) Colony formation assay. Cells transfected with control or PARP1 siRNA for 14 days. Colony formation assay was done as described in Materials and Methods. These results are from one of the representative data out of three biological replicates.

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B. PAPR1 의 억제는 FOXO3 의 발현 유도

위암세포에서 PARP1 억제에 대한 항암 메커니즘을 해명하기 위해, 단백 질 발현 여부를 알아보는 웨스턴 블롯팅을 수행 하였다. 여기서 주목할 것은 위암 세포에 Olaparib (0 그리고 2.5uM) 을 72시간 동안 처리하였을 때 FOXO3 단백질의 발현을 유도한다는 것이다 (Fig. 2A). 즉, PARP1을 저해시키 는 약물인 Olaparib 을 처리하여 PARP1을 억제시키게 되면 종양 억제 인자인 FOXO3 발현을 유도하여 위암의 세포 성장을 억제한다는 것을 가리키고 있다. PARP1 siRNA transfection 실험에서 FOXO3의 증가는 Olaparib 을 처리한 실험 과 동일한 단백질 발현 결과를 보여줌으로써, PARP1을 저해하는 것은 FOXO3 단백질 발현을 유도한다는 것을 입증하는 것이다. FOXO3는 세포사멸, 자식작용, DNA 수리, 그리고 세포주기 조절을 포함한 세포 활동에 다양한 측면으로 작용하고 있다고 알려져 있다. FOXO3의 발현이 Olaparib에 의해 증가한다는 것은 FOXO3의 메커니즘이 작용하여 위암 세포의 성장을 억제한다는 것을 예상할 수 있다.

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Figure 2. FOXO3 protein up-regulation by PARP1 inhibition.

Western blotting results of cells treated with Olaparib (0 and 2.5uM) for 72 h and cells transfected with control and PARP1 siRNA, the levels of the indicated proteins were analyzed by immunoblotting. β-actin is used for a gel-loading control.

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C. PARP1 과 FOXO3 의 발현과 위암 환자 임상결과

앞의 세포 실험에서 PARP1 을 억제하였을 때 암 억제 유전자인 FOXO3 의 발현이 증가한다는 것을 확인하였고, PARP1 과 FOXO3 의 관계가 과연 임상 병리학적으로도 관련성이 있는지 확인하기위해 임상데이터 분석을 수행하였다. PARP1 과 FOXO3 의 발현간의 관계를 위암 환자들의 임상 결과로 확인하기 위해 데이터를 수집하고 전체 생존 기간을 통해 확인하였다. 위암 데이터에서 임상 병리학적 기능과 PARP1 과 FOXO3 의 발현과의 상관 관계는 Table 2 에 요약하였다. 면역 화학 염색법을 통해 위암 조직 샘플에서의 PARP1 과 FOXO3 의 발현은 주로 종양 세포의 핵에 지역화 되어 있고 세포질에서는 핵에서보다는 낮은 발현을 보였다. 그리고 PARP1 의 발현이 FOXO3 의 발현보다 높다는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig 3). 그래서 이 연구에서는 핵에서의 PARP1 과 FOXO3 의 발현을 평가하였다. Table 2 를 보면 위암에서 PARP1 의 발현은 많은 경우에서 높은 발현을 보이는 반면에 FOXO3 의 발현에 의한 임상 데이터를 관찰한 결과에서는 낮은 발현을 보이는 것을 확인하였다. 결과적으로, PARP1 의 발현은 종양 발달에 영향이 있다는 것을 임상 데이터로 증명한 것이다.

Table 2 에서 얻은 유의한 결과를 바탕으로 위암 환자의 샘플을 TNM stage 별로 나눠서 PARP1 과 FOXO3 의 유무에 따른 평가를 Kaplan-Meier 생존 분석으로 TNM stage 를 Ⅰ & Ⅱ vs Ⅲ & Ⅳ 로 나누어 전체 생존곡선과 무 재발 생존곡선은 비교하였더니 TNM stage 가 낮은 Ⅰ&Ⅱ에서의 전체

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생존곡선 (P < 0.001) 과 무 재발 생존곡선 (P < 0.001) 에서 더 예후가 좋다는 것을 확인할 수 있었고, PARP1 음성일 때가 PARP1 양성일 때보다 전체 생존곡선 (P < 0.001) 과 무 재발 생존곡선 (P < 0.001) 에서 더 예후가 좋다는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 FOXO3 의 유무에 대한 생존곡선을 비교한 결과에서는 FOXO3 양성일 때가 FOXO3 음성일 때보다 전체 생존곡선 (P < 0.001) 과 무 재발 생존곡선 (P < 0.001) 에서 더 예후가 좋다는 것을 확인할 수 있었다 (Fig 3B). PARP1 과 FOXO3 의 양성발현은 각각 54% (166 중 89) 와 19% (166 중 32) 로 관찰되었다. PARP1 의 발현이 특징적으로 확인된 그룹은 환자의 나이 (P = 0.049), 높은 병기 (P < 0.001), 종양 침습 (EGC vs AGC, P < 0.001), 림프절 전이 (P < 0.001), 정맥 침습 (P = 0.017), 로렌 분류 (P = 0.035) 의 존재와 관련이 있었다. 대조적으로, FOXO3 는 낮은 병기 (P = 0.019) 와 EGC (P = 0.042) 에서 유의한 수치가 나왔다 (Table 2). 특히, FOXO3 의 발현이 크게 PARP1 (P = 0.021)의 발현과 연관이 있다는 것을 임상 병리학적 데이터를 가지고 찾을 수 있었다. 이러한 결과는 PARP1 의 발현은 종양 발생과 연관성이 있다는 것과 FOXO3 의 발현은 종양을 억제한다는 것을 예상할 수 있고, PARP1 과 FOXO3 의 연관성에 대해서도 임상 데이터를 통해 확인할 수 있었다.

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Table 2. Clinic pathologic variables and the expression status of PARP1 and FOXO3.

Characteristics n PARP1 FOXO3

Positive P value Positive P value

Age (years) < 60 y 50 21 (42%) 0.049 6 (12%) 0.119 ≥ 60 y 116 68 (59%) 2622%) Sex Female 41 24 (59%) 0.466 7 (17%) 0.68 Male 125 65 (52%) 25 (20%) CEA* Normal 106 52 (49%) 0.088 18 (17%) 0.428 Elevated 30 20 (67%) 7 (23%) CA19-9* Normal 120 63 (53%) 0.778 24 (20%) 0.182 Elevated 16 9 (56%) 1 (6%) TNM stage I & II 73 28 (38%) < 0.001 20 (27%) 0.019 III & IV 93 61 (66%) 12 (13%) Tumor invasion EGC 31 8 (26%) < 0.001 10 (32%) 0.042 AGC 135 81 (60%) 22 (16%)

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LN metastasis Absence 56 18 (32%) < 0.001 14 (25%) 0.182 Presence 110 71 (65%) 18 (16%) Venous invasion Absence 136 67 (49%) 0.017 27 (20%) 0.689 Presence 30 22 (73%) 5 (17%) WHO classification Tubular 115 70 (61%) 0.005 28 (24%) 0.045 SRC 18 5 (28%) 1 (6%) Mucinous 17 4 (24%) 1 (6%) Mixed 12 6 (50%) 0 (0%) Papillary 2 2 (100%) 1 (50%) Neuroendocrine 2 2 (100%) 1 (50%) Histologic grade** WD 10 5 (50%) 0.207 4 (40%) 0.193 MD 64 44 (69%) 18 (28%) PD 43 23 (53%) 7 (16%) Lauren classification Intestinal 73 43 (59%) 0.035 20 (27%) 0.007 Diffuse 72 31 (43%) 6 (8%) Mixed 21 15 (71%) 6 (29%)

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FOXO3

Negative 134 66 (49%) 0.021

Positive 32 23 (72%)

Abbreviations: CEA, carcinoembryonic antigen; LN, lymph node; WD, well differentiated; MD, moderately differentiated; PD, poorly differentiated; SRC, signet ring cell carcinoma; EGC, early gastric cancer; AGC, advanced gastric cancer; *; Preoperative serum level of CEA or CA19-9 were not measured in 30 and 30 patients, respectively. **; Histologic grade was applied primarily to tubular and papillary carcinomas according to the WHO histological classification of gastric tumors.

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Figure 3. Immunohistochemistry expression of PARP1 and FOXO3 and Kaplan-Meier survival analysis in gastric carcinoma.

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(A) Immunohistochemistry expression of PARP1 and FOXO3 in well differentiated (WD), moderately differentiated (MD), and poorly differentiated (PD) gastric adenocarcinomas. (B) Overall survival and relapse-free survival according to the tumor stage (stage I and II vs III and IV) and the expression of PARP1 and FOXO3.

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위암 환자들의 생존율에 영향을 미치는 위험 인자를 확인하기 위해 콕스 비례 위험 회귀 분석에 의한 단변량 분석과 다변량 분석을 통해 확인하였다. 그 결과는 위암 데이터에서 임상 병리학적 기능 사이에서의 전체 생존기간과 무 재발 생존기간의 HR 값은 Table 3 에 요약하였다. 단변량 분석에서와 마찬가지로 다변량 콕스 비례 위험 회귀 분석에 의한 전체 생존 곡선과 무 재발 생존 곡선에서 PARP1 과 FOXO3 의 발현 요인은 암 태아성 항원인 CEA 와 종양 표지자인 CA 19-9, 종양 병기, 림프절 전이, 종양 침습, 정맥 침습 등과 마찬가지로 생존율에 영향을 미치는 것으로 관련되어 있음을 알 수 있었다 (Table 3). 위암 예측 지표인 항원인 CEA 와 CA 19-9, 종양 병기, 림프절 전이, 종양 침습, 정맥 침습 등에서 HR 값이 유의하게 나타난 것과 마찬가지로 암 환자에게 PARP1 발현은 전체 생존기간에서 2.190 배 (95% CI; 1.424-3.370, P < 0.001) 의 더 큰 사망위험과 무 재발 생존기간의 2.143 배 (95% CI; 1.406-3.265, P < 0.001) 의 생존기간을 예측하였다. 다음으로 암 환자에게 FOXO3 손실에 의한 전체 생존기간은 3.893 배 (95% CI; 1.800-8.416, P < 0.001) 의 더 큰 사망위험과 무 재발 생존기간의 3.453 배 (95% CI; 1.673-7.127, P < 0.001) 의 생존 기간을 예측하였다. 다변량 분석은 단변량 분석에 의한 전체 생존 곡선과 무 재발 생존곡선과의 관련된 모든 요소를 포함하여 분석하였다. 다변량 분석은 종양의 단계 및 PARP1 과 FOXO3 의 발현을 전체 생존 곡선과 무 재발 생존곡선의 독립적인 예후 지표로 드러났다. PARP1 의 표현은 전체 생존기간에 1.783 배(95% CI; 1.090-2.915, P = 0.021) 의 더 큰 사망위험을 무 재발 생존기간에서 1.756 배(95% CI; 1.089-2.830, P = 0.021) 의 생존기간을

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예측했다. FOXO3 를 발현하는 암 환자와 비교했더니 FOXO3 발현 손실이 있는 암 환자는 전체 생존기간에서 6.958 배 (95% CI; 2.163-22.383, P = 0.001) 의 더 큰 사망위험과 무 재발 생존기간에서 5.351 배 (95% CI; 1.929-14.845, P = 0.001) 의 더 큰 재발 또는 사망을 보여 주었다 (Table 3). 결과적으로 PARP1 과 FOXO3 의 발현은 단변량과 다변량 콕스 비례 위험 회귀 분석에서 전체 생존곡선과 무 재발 생존곡선에 영향을 끼친다는 것을 확인하였다. 이러한 전체 생존곡선과 무 재발 생존곡선에서의 PARP1 과 FOXO3 의 발현은 위암을 예측하는 임상 마커로 유용하게 사용할 수 있다는 것을 예상한다.

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Table 3. Univariate and multivariate Cox proportional hazards regression analysis for relapse-free survival and overall survival in gastric carcinoma patients.

Characteristics N OS RFS

HR (95% CI) P value HR (95% CI) P value

Univariate analysis CEA, elevated (vs. normal) 30/136 2.024 (1.230-3.330) 0.006 1.917 (1.170-3.144) 0.01 CA19-9, elevated (vs. normal) 16/136 2.510 (1.376-4.580) 0.003 2.275 (1.251-4.138) 0.007

TNM stage, III and IV (vs. I and II) 93/166 4.660 (2.865-7.581) < 0.001 4.488 (2.802-7.186) < 0.001

Tumor invasion, AGC (vs. EGC) 135/166 3.539 (1.711-7.320) < 0.001 3.767 (1.823-7.785) < 0.001 LN metastasis, presence (vs. absence) 110/166 3.696 (2.178-6.271) < 0.001 3.737 (2.230-6.261) < 0.001 Venous invasion, presence (vs. absence) 30/166 2.724 (1.705-4.352) < 0.001 2.654 (1.666-4.229) < 0.001 PARP1, positive (vs. negative) 89/166 2.190 (1.424-3.370) < 0.001 2.143 (1.406-3.265) < 0.001 FOXO3, negative (vs. positive) 134/166 3.893 (1.800-8.416) < 0.001 3.453 (1.673-7.127) < 0.001

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Multivariate analysis* TNM stage, III and IV (vs. I and II) 3.444 (1.922-6.171) < 0.001 3.345 (1.918-5.836) < 0.001 PARP1, positive (vs. negative) 1.783 (1.090-2.915) 0.021 1.756 (1.089-2.830) 0.021 FOXO3, negative (vs. positive) 6.958 (2.163-22.383) 0.001 5.351 (1.929-14.845) 0.001

Abbreviations: OS, overall survival; RFS, relapse-free survival; HR, hazard ratio; CEA, carcinoembryonic antigen; LN, lymph node; EGC, early gastric cancer; AGC, advanced gastric cancer. *The variables considered in the multivariate analysis were the pretreatment serum level of CEA and CA19-9, tumor stage, tumor invasion (EGC versus AGC), the presence of lymph node metastasis, venous invasion, and the expression of PARP1 and FOXO3.

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D. PARP1 과 FOXO3 발현은 위암 환자의 생존율에 영향

앞선 실험에서는 PARP1 과 FOXO3 의 발현에 따른 생존분석을 각각 실행 하였다. 이번에는 PARP1 과 FOXO3 의 발현간의 상관성을 확인하기 위해 Kaplan-Meier 생존분석을 수행하였다.

PARP1 이 양성일 때, FOXO3 의 유무와 PARP1 이 음성일 때, FOXO3 의 유무에 따른 두 유전자 간의 상관 관계를 Kaplan-Meier 생존분석을 통해서 확인 해보았다 (Fig 4). 그 결과 PARP1 이 양성일 때와 음성일 때 모두 FOXO3 가 양성일 때에 FOXO3 가 음성일 때 보다 훨씬 더 전체 생존율 (negative: P = 0.087, positive: P < 0.001) 과 무 재발 생존율 (negative: P = 0.067, positive: P < 0.001) 이 증가하는 것을 확인하였다 (Fig 4A, 4B). 반대로 FOXO3 가 양성일 때와 음성일 때 PARP1 양성일 때와 음성일 때의 생존 곡선을 확인해보았더니 PARP1 이 음성일 때가 양성일 때보다 전체 생존율 (negative: P < 0.001, positive: P = 0.378) 과 무 재발 생존율 (negative: P < 0.001, positive: P = 0.271) 이 증가하는 패턴을 확인할 수 있었다 (Fig 4C, 4D). Kaplan-Meier 생존분석을 통해 PARP1 의 억제와 FOXO3 의 증가 발현은 서로 상관 관계가 있다는 것을 확인 할 수 있고, 그로 인해 임상 데이터에서 PARP1 을 저해하고 FOXO3 를 증가하는 것은 환자 예후에도 좋은 결과를 나타낼 수 있다는 근거로 예상한다. Fig 5 에서는 PARP1 과 FOXO3 는 크게 3 가지 score 로 나누고 거기에 따른 Kaplan-Meier 생존분석을 비교해 보았다. 그 결과 PARP1 score 0-3 일 때가 PARP1 score 6-8 일 때 보다 훨씬 전체 생존 곡선 (P < 0.001) 과 무 재발 생존곡선 (P < 0.001) 에서 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, FOXO3 에서는 PARP1 과는 반대로 FOXO3 score

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6-8 일때가 FOXO3 score 0-2 일 때보다 전체 생존곡선 (P < 0.001) 과 무 재발 생존곡선 (P < 0.001) 에서 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig 5A, 5B). 결론적으로 PARP1 의 억제와 FOXO3 의 발현은 전체 생존곡선 (P = 6.0X10-9) 과 무 재발 생존곡선 (P = 2.2X10-8) 에서 유의한 결과로 나타났다 (Fig 5C). 따라서, 임상 데이터 결과에서도 나타냈듯이 PARP1 을 저해하였을 때의 FOXO3 의 발현은 임상적으로 환자의 예후에 좋은 결과를 나타낼 수 있을 것으로 예상된다.

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the expression of PARP1 and FOXO3.

(A) and (B) Overall survival and relapse-free survival according to the expression of FOXO3 in PARP1-negative (A) and PARP1-positive (B) subgroups. (C) and (D) Overall survival and relapse-free survival according to the expression of PARP1a in FOXO3-negative (C) and FOXO3-positive (D) subgroups.

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expression score of PARP1 and FOXO3.

(A) and (B) Overall survival and relapse-free survival according to the expression of PARP1-score (A) and FOXO3-score (B) subgroups. (C) Overall survival and relapse-free survival according to the expression of PARP1a in FOXO3.

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Ⅳ. 고찰

위암 (Gastric cancer)은 세계에서 두 번째로 많이 발병하는 암이자, 사망률이 폐암 다음으로 높은 암이라고 알려져 있다 (Caruso et al., 2002; Zhang et al., 2008; Ma et al., 2010; Jemal et al., 2011). 이전 보고된 연구에 의하면 위암 환자에게 화학적 요법의 처리는 다른 암에서의 화학적 요법을 사용한 치료 결과 수준에 비해 현저하게 낮은 예후와 전체 생존기간보다 낮은 1 년 미만의 생존기간을 나타내고 있다 (Shah and Kelsen, 2010; Washington, 2010; Oh, 2012). 따라서 위암 환자의 효과적인 치료를 개선을 위하여 조기 진단 뿐만 아니라 암 유발 인자 또는 암 억제 인자의 새로운 타겟을 찾는 것은 임상적으로 매우 중요하다 (Chen et al., 2005; Yasui et al., 2005). 다시 말해 위암과 관련된 여러 가지 새로운 종양 유전자와 종양 억제 유전자를 찾는 것은 조기 진단과 표적 치료의 발전을 위해 도움이 될 수 있을 것이라고 예상한다. 따라서, 본 연구에서는 위암에서 PARP1 의 발현이 높다는 연구 결과를 토대로 위암에서의 종양 발생 과정에 PARP1 의 역할을 알아보고자 하였다.

PARP1 은 특히 BRCA1 돌연변이 암세포에서 DNA 손상에 내성이

생김으로써 종양의 발달을 촉진하는 기능을 갖는 것으로 알려져 있다 (Ossovskaya et al., 2010). 그러나, 최근 연구에서는 BRCA1 돌연변이 유전자의 존재에 관계없이 특정 유형의 종양을 가진 환자 유래의 조직 마이크로 어레이를 이용한 몇몇 임상 연구에서 PARP1 이 종양 발달을 촉진한다는 보고가 있었고, 이것은 PARP1 의 발현은 종양의 예후 마커로 사용 될 수 있다는 것을 말한다

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(Mahe et al., 2014). 예를 들어, 소아 혈액암의 한 연구에서는 PARP1 과 소아 중추 신경계 암에 대한 환자의 mRNA 와 단백질 수준을 평가한 결과, PARP1 의 발현이 높게 나타났고 이는 강력하게 높은 종양 단계에서 PARP1 의 발현과 상관 관계가 있음을 밝혀냈다 (Barton et al., 2009). 또한, Staibano et al., 에서 발표한 논문에 따르면 PARP1 의 발현은 종양 병변의 두께와 vertical 성장 단계간의 상당한 연관성을 보여 주었다 (Staibano et al., 2005). 이러한 결과는 본 논문의 연구에서도 PARP1 을 억제 하게 되면 전체 암의 세포에 비례하여 죽은 세포 수의 증가, 살아있는 세포 수의 감소를 유도하게 된다는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서, PARP1 의 발현이 위암세포에서 손상 세포를 복구하는 역할을 하여 종양 발달에 기여한다는 것을 확인하였고, 이러한 PARP1 을 저해하는 것은 손상 세포의 복구를 막아 종양 발달을 억제 한다는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, PARP1 을 억제하였을 때 FOXO3 를 발현하면서 세포사가 일어나는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 연구 결과를 통해 PARP1 과발현은 종양 발달과 연관이 있다는 것을 예상 할 수 있고, PARP1 의 억제 또는 PARP1 의 발현 조절은 종양 치료에 있어 잠재적인 새로운 마커가 될 수 있을 것으로 예상한다. FOXO3 는 nucleus 에 위치하고 있으며, 활성화 또는 표적 유전자의 전사를 억압한다 (Karger et al., 2009). 또한, FOXO3 는 종양 억제 유전자로 세포주기 정지, 세포 사멸, 그리고 DNA 복구를 하는 것으로 잘 알려져 있다 (Huang and Tindall, 2006; Karger et al., 2009). 이전까지 진행되던 연구에 따르면 FOXO3 의 발현이 원발성 종양의 성장을 억제하는 것으로 나타났다 (Brunet et al., 1999; Brunet et al., 2001; Accili and Arden, 2004; Zigrino et al., 2005; Paik et al., 2007). 유방암에서 FOXO3 의 전사 활성 억제는 세포 변형, 종양 발달과 혈관 신생을 촉진하는 반면,

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FOXO3 의 발현은 유방 종양 성장을 억제하고 종양 크기를 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (Hu et al., 2004). 이러한 결과는 FOXO3 가 종양을 억제시키는 역할을

한다는 것을 증명한다. Fei et al., 에서 악성 난소 종양에서 정상조직에 비해

FOXO3 의 발현이 낮게 나타나는 것을 통해 FOXO3 가 난소암에도 영향을 준다는 것을 보고한 바 있다 (Fei et al., 2009b). 이는 FOXO3 의 발현이 낮을 수록

생존 곡선에서 낮은 생존율과 관련이 있었다. Lu et al., 그룹에서는 FOXO3 의 발현이 병기 및 림프절과 크게 상관 관계가 있음을 보여 주었다 (Lu et al., 2012). 앞에서 설명한 연구를 통해 FOXO3 가 화학 요법 및 표적 치료에 대한 반응을 결정하는 중요한 요소인 것으로 나타났다 (Gomes et al., 2008). 본 연구에서도 동일하게 위암세포에서 PARP1 을 억제하였을 때 세포 성장이 억제되는 것을 확인 하였고, 이러한 PARP1 의 억제는 FOXO3 의 발현을 증가시킨다는 것을 단백질 발현 분석으로 확인하였다. PARP1 의 억제에 의한 FOXO3 발현이 종양 발달 억제에 영향을 줄 수 있다는 것을 다시 한번 확인 할 수 있었다. 세포 실험을 통해 PARP1 저해에 의한 FOXO3 의 활성화가 위암 세포의 성장을 억제 할 수 있음을 본 연구에서 확인한 결과를 바탕으로 임상 데이터에서도 이러한 PARP1-FOXO3 신호 경로가 효과가 있는지 확인 하기 위해 임상 데이터를 가지고 조직 마이크로 어레이를 이용하여 PARP1 과 FOXO3 의 발현 여부를 확인하였고 Kaplan-Meier 생존분석을 통해 PARP1 의 발현과 FOXO3 의 발현에 따른 위암 환자의 생존에 영향을 끼친다는 것을 확인하기 위해 분석을 진행하여 PARP1 과 FOXO3 의 발현이 임상 데이터에서도 영향을 끼친다는 것을 확인 할 수 있었다.

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결과적으로 이러한 연구 결과는 PARP1 의 억제에 의한 FOXO3 의 발현은 종양을 억제하고, 이것은 악성 종양에 대해 민감하게 반응할 것이고 특정 표적을 치료할 수 있는 방법이 될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 이 PARP1 의 억제가 FOXO3 단백질의 발현을 상향 조절한다는 것의 설명이 가능한 분자적 메커니즘에 대한 몇 가지 연구 보고가 있다. 예를 들어 PARP1 의 억제는 암세포에서 pro-survival 신호인 NF-kB / IKK 을 차단할 수 있음을 암시하고, 유사한 양상으로 IKK 베타의 억제는 FOXO3 유비퀴틴화를 방지하고 생체 외 (in vitro)및 생체 내 (in vivo) FOXO3 활성화를 일으킬 수 있다는 것을 확인하였다 (Hu et al., 2004; Stilmann et al., 2009; Tsai et al., 2010; Weston et al., 2010). 한편, 다른 연구에서는 PJ34 와 3AB, 두 개의 PARP1 억제제는 PHLPP1 을 활성화, FOXO3 의 인산화를 감소, AKT 의 비활성화를 통해 종양 억제 전사 인자로 FOXO3 단백질의 활성화로 이어질 nucleus 에서 세포질로 FOXO3 를 이동시킨다 (Wang et al., 2011). 또한, 본 연구결과에서 PARP1 을 knock-out 시켰을 때, FOXO3 가 발현하면서 세포 성장의 억제를 유도한다는 결과와 비슷하게 PARP1 의 knock-out 은 세포 증식의 감소를 유도하고 FOXO1 을 의존하는 방법으로 세포 사멸을 야기하는 것으로 나타났다 (Sakamaki et al., 2009). 이러한 전반적인 최근의 연구 결과로 미루어볼 때 PARP1 은 종양 발생을 초래하고 직접 또는 간접 방식으로 FOXO3 단백질 발현과 기능을 조절한다는 것을 설명할 수 있고 이 결과는 새로운 치료 전략이 될 수 있음을 암시한다. 우리의 결과에서 PARP1 과 FOXO3 사이의 표현 패턴이 반대임에도 불구하고, 인간의 위 암 샘플에서 PARP1 과 FOXO3 는 양의 상관 관계 (P value by chi-square test, p = 0.021) 를 띄는 것으로 나타났다. 우리가 PARP1 (Mean Allred score ±

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standard error; 4.8 ± 0.2) 과 FOXO3 (Mean Allred score ± standard error; 3.8 ± 0.2) 의 면역 화학적 Allred scores 사이의 관계를 평가했을 때, 유의 한 양의 상관 관계를 확인할 수 있었다 (Spearman’s rho 0.383, P < 0.001). 그러나, PARP1 및 FOXO3 사이가 양의 상관 관계임에도 불구하고, 예후의 의미는 달랐다. PARP1 의 발현에서 높은 TNM stage, 종양 침윤에서 진행형 위암 (AGC) 과 림프절 전이 또는 정맥 침략의 존재에 상당한 연관성을 보였고, 그것은 위암 환자의 전체 생존 곡선과 무 재발 생존곡선에서 독립적으로 안 좋은 예후를 나타냈다. 반대로, 위암에서 FOXO3 의 발현이 보존 되어있을 때, TNM stage 와 종양 침윤에서 진행성 위암 (AGC) 과는 낮은 연관성을 보였다. 또한, FOXO3 의 발현은 위암환자의 전체 생존 기간 (P < 0.001) 과 무 재발 생존 기간 (P < 0.001) 에 독립적으로 우호적인 예후를 나타냈다. 이러한 결과로 미루어 보아 종양에서의 FOXO3 발현은 종양 자극에 대한 보상적 발현임을 추측할 수 있다. FOXO3 의 발현이 성공적으로 종양 자극에 의해 유도될 경우 FOXO3-매개 항암은 암의 진행을 약화시킨다고 할 수 있다. 결과적으로 FOXO3 의 발현은 위암에서 상대적으로 좋은 예후로 나타내고 있다. 그러나, 종양 진행에서 FOXO3 의 보상적 발현에 결함이 나타날 때, 종양 FOXO3-매개 항암 진행이 아닌 종양 형성이 일어날 수 있고 그로 인해 위암 환자에서 상대적으로 안 좋은 예후로 나타날 수 있다. 이러한 측면으로 보았을 때, 암세포에서 FOXO3 발현의 유도는 암 치료를 위한 전략이 될 수 있다는 것을 시사한다. 종합하자면 PARP1 의 저해제인 Olaparib 의 처리는 세포사를 유도하였고, PARP1 의 억제는 FOXO3 의 발현을 증가시킴으로써 세포 성장을 억제한다는 것을 증명하였다. 또한, 임상 데이터에서 PARP1 발현과 FOXO3 손실은 위암

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환자의 생존 곡선에 안 좋은 예후를 확인할 수 있었다. 조직 마이크로 어레이 데이터와 콕스 비례 위험 회귀 분석을 통해 PARP1 양성 발현은 좋지 않은 생존과 높은 HR 값을 예측하였고, FOXO3 양성 발현이 위암 환자에게서 더 유리한 생존을 예측했다. 그리고 PARP1 음성 발현과 FOXO3 양성 발현은 위암 환자의 생존에 있어 유리한 독립적인 예후 지표임을 보여 주었다. 본 논문의 결과는 PARP1 - FOXO3 신호 경로는 종양을 억제하는 중요한 역할을 한다는 것을 입증하였고, 임상적으로도 PARP1-FOXO3 신호 경로는 상관 관계가 있다는 것도 확인할 수 있었다. 이는 암 치료에 있어 PARP1-FOXO3 신호는 새로운 메커니즘과 임상 통찰력을 제안을 예상한다.

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Ⅴ. 결론

본 연구에서는 PARP1 의 억제가 암 세포의 성장에 어떤 메커니즘을 통해 세포사를 유도하는지 밝히기 위해 실험을 진행하였고, 진행한 결과에서 PARP1 의 억제는 FOXO3 발현을 증가시킴으로써 암을 억제한다는 것을 확인 할 수 있었다. Olaparib 은 PARP1 저해제로써, 암세포를 복구하지 않고 세포사를 유도함으로써 암세포의 성장을 억제하는 효과를 보였다. 이러한 PARP1 억제는 FOXO3 의 활성화를 통해 위암 세포의 성장을 억제 할 수 있음을 보여 주었다. 임상 데이터에서 PARP1 발현과 FOXO3 발현의 손실은 위암의 진행과 관련이 있음을 보여 주었다. 또한, PARP1 의 발현은 좋지 못한 생존 기간을 나타냈고, FOXO3 의 발현이 위암 환자에게 높은 생존 기간을 나타냈다. 결론적으로, 위암의 유리한 독립적인 예후 지표로 PARP1 의 저해에 의한 FOXO3 의 발현을 보여 주었다. PARP1- FOXO3 신호는 임상적인 의미와 암세포의 성장에 중요한 역할을 한다는 것을 입증하였고, 이는 암 치료에 있어 PARP1-FOXO3 신호는 새로운 메커니즘과 임상 통찰력을 제안 할 수 있다.

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수치

그림  차례
표  차례
Table 1. Primers of target genes.
Figure  1.  Anti-proliferation  activity  of  Olaparib  and  PARP1  siRNA  against  gastric  cancer cells.
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