서
론
최근 들어 나노기술의 발달로 많은 나노물질들이 개 발되고 있고 나노관련 소재들이 바이오센서를 비롯하여 디스플레이, 반도체 공정, 제약/바이오 분야 등에 다양하 게 사용 되고 있으며 새로운 산업을 이끌어 가고 있다. 그러나 한편으로는 새로 만들어진 나노물질에 대하여 환 경에 미치는 영향 또는 위해성에 대해서 많은 우려를 표 명하고 있다 (Kim et al. 2008). 이미 선진각국은 정부주 도로 나노물질이 환경에 미치는 영향에 대해 조사에 착 수해 있으며 REACH와 같은 규제법안의 발효를 하였거 나 준비하고 있다. 나노물질은 크기에 따라 세포내의 침 투가 자유로우며 질량에 대비하여 넓은 표면적을 가지 는 구조이므로 다른 물질과 응집하려는 성질이 강하다. 그러므로, 생태계의 환경 내에서 생물체에 흡수된 나노 물질이 내부물질과 반응하여 부정적 영향을 미칠 수 있 다. 특히 나노 은 입자를 비롯한 일부 나노금속입자들의 비선택적 살균성에 대한 많은 문헌들이 보고되어 있다 (Kim et al. 1998; O’Neill et al. 2003; Thomas and McCubin 2003; Mallick et al. 2004; Park et al. 2006; Park et al. 2007). 또한, 생물종에 따라서는 다양한 나노물질을 인식 하여 다양한 생체반응이 나타날 수 있고 나아가서 생태 계 환경에 영향을 미칠 수 있다고 우려하고 있다. 그러므 ─ ─ 273 ──나노금속입자 및 전도성 물질을 처리한 감자 괴경 조직에서의
과민화 반응 조사
박 해 준*∙김 화 정∙박 상 현 한국원자력연구원 정읍방사선과학연구소A Hypersensitive Reaction in Potato Tuber Tissue Treated with
Nanosized Metal Particles and Conducting Polymer
Hae-Jun Park*, Hwa-Jung Kim and Sang Hyun Park
Advanced Radiation Techology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, Jeongeup 580-815, Korea
Abstract -- Nanosized metal particles and aniline are well known as materials used in a biosensor. However, it has not been reported how these materials affect the environment like a soil, plant and water system. This study showed that nanosized silver particles induced a hypersensitive reaction (HR) and aniline induced a toxic necrosis in potato tuber tissue. But a nanosized gold particle did not induce toxic phenomenon and HR. The nanosized metal particles were prepared by irradiating a solution comprising of a silver salt or a gold salt with radiation. Our results suggest that nanosized gold particles can be recommended as an environmental-friendly material to produce a biosensor. Key words : Gamma irradiation, Nanosized metal particles, Biosensor, HR, Potato
* Corresponding authors: Hae-Jun Park, Tel. +82-63-570-3372, Fax. +82-63-570-3371, E-mail. [email protected]
로 나노물질을 사용하는 제품들을 개발하기 이전에 사용 될 소재들이 환경에 미칠 영향에 대해 검토가 필요하다. 생물체는 병원성 미생물의 침입, 급격한 온도변화, 공 해물질 접촉 등과 같은 환경 스트레스 조건에서 급격하 게 활성산소종 (O2-, H2O2, ㆍOH)을 생성한다. 이러한 현 상을 oxidative burst (활성산소 생성)라고 한다. 환경스트 레스에 의해 유도되는 oxidative burst는 발생 패턴에 따 라 생물이 스트레스로부터 자기 자신을 지키기 위한 저 항성 반응의 유도 등 신호전달체계에서 중요한 기능을 하기도 하고 한편으로는 산화장해를 유도하여 생육이나 노화촉진 등에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 지난 십 수 년 간 비병원성 병원균의 침입을 받은 식 물체가 O2-를 생성한다는 사실이 발견된 이래로 식물에 서 병원균의 침입, 엘리시터 (elicitor) 처리 및 환경스트레 스에 따라서 자기 몸을 지키기 위한 과민화 반응 (hy-persensitive reaction)과 oxidative burst가 발생되는 것이 확인되었다 (Doke 1983; Yosioka et al. 2001; Bright et al. 2006; Asai et al. 2008). 특히, 숙성된 감자 조직에서 분리
된 마이크로좀 분획에서의 O2-생성시스템은 NADPH
(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)의 산화효소 에 의존하여 생성되며, 비친화성 감자역병균의 감염과
엘리시터 처리에 의해 과민화 반응과 O2-생성이 유도
된다는 것이 알려졌다 (Doke 1983, 1985). 이렇게 생성된 활성산소들은 스트레스를 받은 국부적인 기관뿐만 아니 라 전신에 걸쳐서 영향을 미치며 (Park et al. 1998) phy-toalexin 유도, 식물호르몬 대사 및 2차대사를 활성화 시 킨다 (Yosioka et al. 2001). 한편 최근 나노금속입자 표면에 효소를 고정화시키고, 이 나노입자를 전도성폴리머가 코팅되어 있는 전극표면 에 고정화하여 센싱하는 연구가 보고 되었다 (Seo et al. 2007). 즉 나노금속입자를 제조하여 효소를 전도성 폴리 머 코팅 전극에 연결하는 링커 (Linker)로 사용하고 있는 방법이 널리 이용되기 시작하였다. 이러한 바이오센서에 서 대표적으로 사용되고 있는 나노금속으로서는 금 또는 은으로 구성되어 있는 구형 나노금속입자 등이며 전도성 폴리머로서는 폴리아닐린, 폴리티오펜 등이 널리 사용되 고 있다. 나노금속입자들은 금속이온에 방사선을 조사하 여 제조되고 있으며 전도성 폴리머는 단분자에서 폴리머 합성을 통하여 만들어지고 있다. 그러나 전극소재로 쓰 이는 나노물질과 전도성폴리머들이 제품 사용 후 폐기되 거나 제조되는 과정에서 부산물로 나와 환경에 어떠한 영향을 미칠 것인지에 대해 조사한 예는 아직 없다. 바이오센서의 재료들이 방기되어 환경으로 들어갈 경 우 제일 먼저 경제적으로 영향을 받는 곳은 농작물이며 특히 지하부의 구근, 괴경, 인경 및 괴근을 상품화하는 작 물에 대한 영향을 먼저 조사할 필요가 있다. 따라서, 본 연구에서는 나노 바이오센서의 소재가 되는 나노물질 및 폴리머소재들을 감자 괴경에 처리하여 과민화 반응과 oxidative burst 여부를 확인하여 생태계 환경에 미치는 영향에 대한 기초조사를 하였다.
재료 및 방법
1. 공시시료 나노금속입자들은 선행 보고되어 있는 감마선조사법을 이용하여 제조하였다 (Oh et al. 2006; Park et al. 2007).AgNO3와 HAuCL4를 3차 증류수에 녹인 다음 PVP과 이소프로필 알콜을 넣고 30 kGy을 선량으로 감마선조사 를 실시하였다. 실시 후에는 동결건조를 통하여 나노금 속입자를 수득하였다. 수득한 시료를 검정하기 위하여 spectrophotometer를 이용하여 각각 고유의 스펙트럼을 확인하였다 (Fig. 1). 전도성 폴리머로서 Sigma사의 아닐린 (aniline)을 시료 로 사용하였으며, PVP (분자량 5800)는 ACROS사의 제 품을 사용하였다. 대조구 처리를 위한 시료처리를 위하여 감자에서 과민 화 반응을 유도하는 엘리시터로서 잘 알려진 감자 역병 Fig. 1. Spectrums of nanosized metal particles prepared by irradia-ting a solution comprising of a silver salt (A) or a gold salt (B) with radiation. 0.880 A -0.030 (A) (B) 0.045 A -0.005 300 Wave length 800 300 Wave length 800
균 (Phytophthora infestans)에서 추출한 세포벽물질 (HWC) 을 사용하였으며 Doke and Tomiyama (1980)의 방법에 따라 엘리시터를 제조하였다. 2. 식물재료 공시 식물 재료로서 감자 괴경을 사용하였으며 당해년 도에 생산된 수미품종을 사용하였다. 감자 괴경을 세척 후에 70% 에탄올로 소독한 다음 감자 괴경의 정단 방향 의 수직 방향으로 절단한 다음 절단면의 수부위를 코르 크 볼러로 관통시켜 조직 실린더를 구하였다. 이 실린더 를 채칼로 4 mm의 두께로 절단하여 감자 괴경 조직 디 스크 (직경 1.5 cm)를 구하였다. 각각 디스크들을 4�C 증류수로 세척한 다음 안정화를 위하여 20�C 암상태에서 18시간 동안 보존하였다. 3. 과민화 반응 관찰 과민화 반응을 보기 위해 각각의 공시재료의 희석액 20μl를 조직디스크의 한쪽 면에 도말한 다음 습도가 유 지된 상자에 암상태에서 보존한 다음 조직에서 과민화 반응에 의한 갈변화 양상을 관찰하였다. 더 자세한 관찰 을 위하여 갈변화 된 감자 괴경 조직 디스크의 단면을 절단한 다음 절단면의 표면을 광학현미경(Olympus CX 21)을 이용하여 세포사를 확인하였다.
4. Oxidative burst 측정 및 phytoalexin 유도 확인
감자 괴경 조직에서 H2O2의 유도양상을 관찰하기 위
하여 Miura et al. (1995)등이 제시한 luminol을 이용한
화학적 발광법을 응용하여 사용하였으며 O2-유도양상
을 관찰하기 위하여 Park and Doke (2005)에서 제시되어 있는 ESR측정법과 동일한 조건에서 수행하였다. 또한 Noridake et al. (1996)의 방법에 의해 phytoalexin 유도를 확인하였다.
결과 및 논의
1. 과민화 반응 검정 일반적으로 감자에서 과민화 반응을 유도하기로 잘 알 려진 HWC 엘리시터 (1 mg ml-1) 처리한 감자 괴경 조직 에서와 같이 나노 은 입자용액 (3~300 ppm)을 처리한 조직에서도 갈변화가 되는 전형적인 과민화 반응 (hyper-sensitive reaction)을 보였다 (Fig. 2). 나노 은 입자용액을 처리한 후 72시간 내 세포사 반응에 의한 국소적인 갈 변화를 보였으며 농도의존적인 양상을 띄고 있다. 한편 나노 은 입자 제조시 첨가되는 PVP (5 mg mL-1)에서는 과민화 반응이 관찰되지 않았다. 이 결과는 감자 괴경 조직세포들이 나노 은 입자를 이물질로 인식을 하며 식 물 저항성 반응의 하나인 과민화 세포사 반응을 유도한 다는 것을 시사한다. 과민화 반응의 세포사에 PVP는 전 혀 영향을 미치지 않았다. 더욱 자세하게 관찰하기 위하여 과민화 반응이 유도된 나노 은 입자용액 (300 ppm)을 처리한 조직을 표면으로 부터 세로로 절단한 다음 절단면을 현미경으로 관찰하였 다. 나노 은 입자용액을 처리한 조직 표면부위의 세포층 에서 과민화 반응에 따른 세포사가 관찰되었으며 반면 대조구의 조직에서는 아무런 변화가 일어나지 않은 정 상적인 세포들이 관찰되었다 (Fig. 3). 한편 나노 금 입자를 처리한 감자 괴경 조직에서는 고 유의 색깔에 의해 고농도시 착색된 현상이 보이나 일반 적인 과민화 반응 갈변화나 세포사는 보이지 않았 다 (Fig. 4). 한편 전도성 물질인 아닐린 용액을 처리한 조직에서 급격한 괴사가 일어났다 (Fig. 4). 아닐린 용액 은 식물에 대해 독성을 보이며 처리된 세포뿐만 아니라 처리되지 않은 세포에 대해서도 급속한 괴사를 유도하 였다. 더욱이 공간적으로 일정하게 떨어져 있는 조직에 대해서도 영향을 미치는 것으로 보아 감자 괴경 조직세 포가 괴사과정에서 휘발성의 신호전달 물질을 방출할 가능성이 있는 것으로 보인다. 향후 여기에 대한 조사가 더 이루어 져야 할 것으로 생각한다. 2. Oxidative burst 유도양상 관찰 과민화 반응을 유도한 나노 은 입자를 처리한 각각의 Fig. 2. Induction of hypersensitive reaction in potato tuber tissue was treated with nano silver particles or elicitor. Tissue discs were incubated 20�C in dark for 72 hours after treatment. a: 300 ppm, b: 30 ppm, c: 3 ppm, d: 0 ppm, e: pvp (5 mg ml-1),f: HWC elicitor (1 mg ml-1).
감자 괴경조직에서 유도되는 oxidative burst의 유도 양 상을 관찰하였다. 먼저 각 조직에서 H2O2의 유도를 확 인하기 위하여 H2O2에 luminol (2.5 mM)을 매개한 화학 적 발광법을 이용하였다. HWC 용액 (1 mg ml-1)을 처리 한 감자 괴경 조직에서는 한 시간 이내에 luminol (2.5 mM)을 매개한 화학적 발광이 보였으나 반면 나노 은 입자용액 (3 ppm)을 처리한 조직에서는 H2O2의 유도양 상은 관찰되지 않았다 (Fig. 5). Oxidative burst의 또 하나 의 중요한 활성산소종인 O2-의 유도를 확인하기 위하여 Tiron (100 mM)을 trap제로 이용하여 ESR분석을 진행하 였다. 나노 은 입자용액 (3~300 ppm)을 처리한 조직에 서는 유의적인 O2-의 유도양상이 보이지 않았다 (Fig. 6). 상기 결과는 식물에 대해 나노금속입자가 과민화 반 응이 초기 oxidative burst의 신호전달 체계 경로가 거치 지 않고 유도시킬 가능성을 보여준다. 다른 연구결과에 따르면 경우에 따라서 과민화 반응이 초기 oxidative burst에 의해 유도되는 것이 아니라 수 시간이 지난 후 재차 유도되는 oxidative burst에 기인한 것임을 제시하 고 있다 (Yosioka et al. 2001). 나노 은 입자는 세포내의 투과성이 좋으므로 세포막에서는 인식을 하지 못하고 투 과된 다음 세포내에서 oxidative burst를 유도할 가능성 이 있고 특히 중금속 입자를 액포에서 저장할 수 있기에 후차적인 oxidative brust를 유도할 수 있다. 또한 나노금 속입자의 경우 식물체내의 항산화 단백질과 결합하여 활 성산소의 집적율을 높일 수 있으나 같은 농도의 나노 금 입자의 경우 세포사가 일어나지 않는 것으로 보아 전자 의 가능성이 높다고 판단된다. 향후 이 현상에 대한 식 물생리학적인 연구가 더 이루어져야 한다. 한편 전도성 분자인 아닐린은 처리 직후 급격히 세포사가 일어나므로 oxidative burst 유도양상을 관찰할 수가 없었다. 3. Phytoalexin 유도 확인 일반적으로 감자에 엘리시터 등을 처리하면 초기 oxi-dative burst가 유도되고 이를 시그널로 이용하여 phy-toalexin 물질인 루비민 (lubimin), 리시친 (risitin) 등을 생 산한다고 보고되어 있다 (Noridake et al. 1996; Yosioka et Fig. 4. Induction of hypersensitive reaction in potato tuber tissue
was treated with nano gold particles or aniline. Tissue discs were incubated 20�C in dark for 72 hours after treatment. a: 300 ppm, b: 30 ppm, c: 3 ppm, d: 0 ppm, e: aniline solution (100%).
Fig. 5. Oxidative burst as images of luminol mediated
chemilumi-nescence on potato tuber discs was treated with nano silver particles. a: 0 ppm, b-d: 3 ppm, e: HWC elicitor (1 mg ml-1).
a b c d e
a b c d e
Fig. 3. Detection of hypersensitive reaction in potato tuber surface
cell was treated with 300 ppm nano silver particles (A) or DDW (B).
(A)
al. 2001). 나노 은 입자를 처리한 조직에서도 상기와 같 이 phytoalexin 유도되는지를 확인하였다. 대조구로서 HWC 용액 (1 mg ml-1)을 처리한 감자 괴경 조직에서는 phytoalexin의 유도가 확인되었으나 나노 은 입자를 처 리한 조직에서 전혀 유도가 되지 않았다 (Table 1). 상기 의 결과로 나노금속입자 중 나노 은 입자는 감자 괴경 조직에 대하여 과민화 반응을 유도하나 초기 oxidative burst를 유도에 의존하지 않고 초기 oxidative burst의 신
호전달 경로에 의존하는 2차 대사산물 또한 유도하지 않 음을 시사하였다.
결
론
나노바이오센서에 적용되는 나노금속 및 전도성 폴리 머에 대한 식물에 미치는 영향에 대해 조사한 결과, 나 노 은 입자가 처리된 감자 괴경 조직에서는 전형적인 과민화 반응이 일어났으나 초기 oxidative burst는 유도 되지 않았다. 전도성분자인 아닐린을 처리한 구에서는 조직 괴사 반응이 급속히 일어났으며 처리한 세포뿐만 아니라 조직 전반에 걸쳐 괴사 반응이 확산되었다. 결론 적으로 나노 은 입자와 전도성 폴리머인 아닐린은 각각 토양내의 식물 조직에 영향을 미치며 향후 이들 소재에 대한 환경평가와 생태계에 관련하여 생물군들에 대한 정밀한 조사가 필요하다.Fig. 6. ESR spectrum of the Tiron radical in samples obtained from Tiron solution applied on surface of potato tuber tissues were treated with
nano silver particles. A: 0 ppm, B: 3 ppm, C: 30 ppm, DL 300 ppm. Samples were taken 2 min after application of Tiron (50 mM) on a well of potato tuber tissues 1 hour after treatment.
Table 1. Induction of phytoalexin production in potato tuber
treated with nano silver particle Sample
Phytoalexin Lubimin Risitin HWC (1 mg ml-1) ++++ ++++
Nano silver particle 6 ppm -
-Nano silver particle 3 ppm -
-Control (DDW) -
-(A) (B)
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Manuscript Received: December 1, 2009 Revision Accepted: December 14, 2009
