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-국문요약-신
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신경계를 이루는 신경교세포나 신경세포에서 발현되는 세포부착분자들(Cell adhesion molecules,CAMs)은 신경계의 발생과 유지에 있어 중요한 기능을 담 당한다.또한 CAMs이 신경계 손상에 의해 나타나는 반응에서 중요한 분자적 결 정요소일 것이라고 제시된 바 있다.이러한 세포부착분자들의 발현은 신경계 손 상으로 나타나는 신경퇴행성 질환과 연관되어 매우 중요한 의미를 지닐 것으로 생각된다.따라서 본 연구에서는 이러한 세포부착분자들의 발현이 신경 손상시에 어떻게 변화되는지를 알아보고,신경계 세포들에서 이러한 세포부착분자들의 발 현과 변화양상을 알아보고자 하였다. 신경계에 손상을 시키는 조건으로는 실험동물모델에서는 척수신경결절을 일으켰으며, 배양세포의 실험에서는 염증반응을 일으키는 TNF-α(Tumor necrosisfactor-α),IL-1β(Interleukin-1β)와 LPS(lipopolysaccharide)등을 사용하 였고,신경독성물질로 알려진 NMDA(N-methyl-D-aspartic acid)를 사용하였다.
세포부착분자들의 발현변화는 RT-PCR과 Westernblotting을 통해 알아보았다. 척수신경을 결절한 동물에서는 척수신경결절 후 ICAM-1(Intercellular adhesionmolecule-1)과 CHL1(ClosehomologueofL1)mRNA의 발현이 뚜렷하 게 증가하였음을 확인하였다.신경계의 세포들 즉 신경세포,성상세포 및 미세아 교세포에서의 세포부착분자들의 발현양상을 비교해 본 결과,ICAM-1은 성상세 포와 미세아교세포에서 발현되었고, L1은 신경세포에서만 발현되었으며, N-cadherin(Neuralcadherin)과 NCAM(Neuralcelladhesionmolecule)은 신경세 포와 성상세포에서 발현되었다.CHL1은 신경세포 뿐만 아니라 성상세포와 미세 아교세포에서 발현되었다.자극별 변화양상을 보면,염증성 유발인자로 알려진 TNF-α,IL-1β, LPS는 성상세포에서 ICAM-1mRNA의 발현을 증가시켰고,미
포는 NMDA 처리시 N-cadherin의 mRNA 발현이 눈에 띄게 감소하였으며 혼 합신경세포에서는 NMDA 처리시 N-cadherin과 L1의 mRNA 발현이 감소하였 다.순수신경세포에서 NMDA를 농도별로 처리한 경우에는 NMDA 농도의존적으 로 N-cadherin의 mRNA 발현이 감소되었다.NMDA에 의한 N-cadherinmRNA 의 이러한 발현 감소현상은 NMDA receptorantagonist인 MK-801에 의해 회복 되었다. 단백질수준에서의 N-cadherin의 발현양상을 보면 순수신경세포에서는 NMDA에 의해 발현이 유의적으로 감소하였으나 혼합신경세포에서는 별다른 차 이를 보이지 않았다. 순수신경세포에 NMDA를 농도별로 처리한 경우에는 NMDA 농도의존적으로 발현이 감소하는 것을 확인하였고,NMDA에 대해 세포 보호작용을 보인 MK-801을 처리한 경우 이러한 감소현상이 회복되는 것을 확인 할 수 있었다. 이상의 결과에서 신경계에 존재하는 세포부착분자들은 세포마다 발현되는 종류나 양상이 다르다는 것을 알 수 있었다.특히 ICAM-1은 신경교세포에서만 특이적으로 발현되어 염증반응을 조절하는데 관여할 것으로 추측되었고,CHL1은 신경교세포와 신경세포에서 발현되어 염증반응과 관련되어 일어나는 신경세포의 퇴화와 재생과정에 기여할 것으로 생각되었다.한편 신경세포에서만 발현되는 L1과 성상세포와 신경세포에서 발현되는 N-cadherin은 신경세포의 생존과 사멸 에 있어 중요한 영향을 미칠 것으로 생각된다.
핵심되는 말 : cell adhesion molecules, ICAM-1, CHL1, L1, N-cadherin, NCAM,신경세포,신경교세포
차
차
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례
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국문요약 ···i 차례 ···iii 그림 차례 ···v I. 서론 ···1 A.신경계에서의 세포부착분자 ···1 B.신경계 손상과 세포부착분자의 발현변화 ···3 II. 재료 및 방법 ···5 A.실험동물 및 시약 ···5 1.실험동물 ···5 2.실험시약 ···5 B.실험방법 ···5 1.세포배양 ···5 2.실험동물모델 ···6 3.약물의 처리 ···7 4.RNA분리 ···7 5.RT-PCR···8 6.WesternBlotting···9 7.MTT assay···10 8.통계처리 ···10 III.결과 ···11A.척수신경결찰을 통한 CAMs의 mRNA 발현 ···11
B.신경계 세포 종류에 따른 CAMs의 발현변화 ···11
1.신경교세포에서 나타나는 CAMs의 mRNA 발현 ···11
2.신경세포에서 나타나는 CAMs의 mRNA 발현 ···13
C.순수신경세포에서 NMDA의 세포사멸과 CAMs발현에 미치는 효과
···17
1.순수신경세포에서 NMDA가 세포사멸에 미치는 효과 ···17
2.순수신경세포에서 NMDA에 의해 나타나는 CAMs의 mRNA 발현 ···17 3.순수신경세포에서 NMDA에 의해 나타나는 N-cadherin의 단백질 발현 ···18 IV.고찰 ···22 V.결론 ···28 참고문헌 ···30 영문요약 ···36
그
그
그림
림
림 차
차
차례
례
례
Fig.1.Spinalnerveligation-inducedCAMsmRNA expressioninvivo
···12
Fig.2.ExpressionofCAMsmRNA inglialcells···14
Fig.3.ExpressionofCAMsmRNA inneurons···15
Fig.4..ExpressionofN-cadherininneurons···16
Fig.5.EffectofNMDA onthecellviabilityinpurecorticalneurons···19
Fig.6.NMDA-inducedCAMsmRNA expressioninpurecorticalneurons ···20
I
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서
서 론
론
론
AAA...신신신경경경계계계에에에서서의서의의 세세세포포포부부부착착착분분분자자자
세포부착분자(Celladhesion molecules,CAMs)는 일반적으로 세포막에 결 합하여 세포간의 부착이 이루어지도록 하며,여러 가지 세포막에 존재하는 단백 질들과 결합하여 여러 가지 신호전달 등에 관여한다. 이러한 부착분자들은 immunoglobulin superfamily(IgCAM),integrins,cadherins,selectins등으로 나 눌 수 있고,이들은 Ca2+의존성 여부에 따라 calcium에 의존적인 군과 calcium
비의존적인 군으로 분류할 수 있다.Calcium 의존적인 CAMs에는 cadherins과 selectins과 integrins이 포함되며,calcium에 비의존적인 CAMs에는 IgCAM이 포 함된다.
신경세포들간의 상호연결은 신경계의 기능을 발휘하는데 있어 가장 필수적 인 조건이다.세포 표면에 발현되는 세포부착분자들은 이러한 신경세포들간의 상 호연결과 부착을 조절하는 중요한 요소로서 신경계의 발생과 유지에 중요한 역 할을 하고 있다.신경계의 발생과정 동안 세포부착분자들은 신경세포의 생장점의 이동을 조절함으로써 신경세포의 생장을 유도하고(Tessier-Lavigne와 Goodman, 1996)신경계가 성숙하게 되면 axonfacicles과 시냅스간의 접촉이 유지될 수 있 도록 도움을 준다(Gil등,2003).신경계에 존재하는 CAMs으로는 NCAM(neural cell adhesion molecule), N-cadherin(neural cadherin), L1, CHL1(close homologueofL1)등이 있다.이들은 신경계를 이루는 신경세포나 신경교세포에 서 발현되어 신경계의 재생과 분화의 중요한 기능을 담당한다(Martin등,2004).
NCAM은 alternativesplicing을 통해 NCAM-180,NCAM-140,NCAM-120 과 같은 이성체를 생성한다. 이들은 공통적으로 axon의 생장을 촉진한다 (Catherina등,2001)고 알려져 있으며 특이적인 경우에 PSA(polysialicacid)형태 의 carbohydrate기(PSA-NCAM)를 가질 수 있는데 이러한 PSA는 NCAM에 의 해 조절되는 세포간의 부착을 줄이는 역할을 한다고 알려져 있다(Kiryushko등, 2004).
신경세포에서 특이적으로 발현되는 L1은 L1상호간의 homophilic interaction과 NCAM, integrins, proteoglycans과 같은 다른 세포부착분자, extracellular matrix과 관련된 단백질(laminin, tenascin)등의 여러 가지 heterophilic한 ligand와 결합하는 heterophilic interaction에 참여(Brummendorf 와 Pathjen,1995)하여,신경세포의 생존,이동,neuriteextension과 faciculation, axonguidance,regeneration,synapticplacity와 같은 기능을 담당한다(Hully등, 1998).또한 세포골격을 유지하는데 관련되는 단백질중의 하나인 ankyrin과 결합 하는데 이러한 상호작용은 L1의 기능발휘에 있어 중요한 역할을 담당하고 있다 (Crossin과 Krushel,2000).
L1과 구조적으로 유사한 특징을 보이는 CHL1은 L1과 함께 신경세포의 사 멸을 저해하는 기능을 담당한다.soluble형태의 CHL1과 L1 처리시 신경세포의 생존과 관련되는 인자들의 발현을 증가시켰으며 신경세포의 생존능력이 강화되 었음이 보고되었다(Chen등,1999).뿐만 아니라 CHL1이 integrin에 의해 조절되 는 세포의 이동에 관여하여 세포의 이동을 증폭시키는 기능이 알려져 있다 (Buhusi등,2003).
Cadherin의 한 종류인 N-cadherin은 Ca2+에 의존적인 homophilic한 세포부
착분자로 β-catenin과 세포내부적으로 상호작용을 하여 이중체를 형성함으로써 actin cytoskeleton과의 상호작용을 조절한다(Nagafuchi 와 Takeichi, 1989). N-cadherin은 주로 시냅스에 존재하여 presynapticassembly(Bamji등,2003)와 활성화로 조절되는 plasticity(Tang 등,1998;Tanaka등,2000)에 관여하며 세포 간 연결을 비롯하여 neurite outgrowth에 관여한다(Walsh 등, 1994). 최근 N-cadherin이 발생기의 신경세포의 presynapticterminal로 trafficking되어 시냅 스의 발생에 있어 중요한 구성요소로 알려지고 있다(James등,2004).
현재까지 신경계에서의 이러한 CAMs의 역할은 신경계의 재생,,,신경계의 퇴화,,,신경계에서의 염증반응,,,통증유발과 유지의 관점에서 활발한 연구가 진행 되고 있다.
BBB...신신신경경경계계계 손손손상상상과과과 세세세포포부포부부착착착분분분자자자들들의들의의 발발발현현현변변변화화화 신경세포 손상 후 신경계에서는 여러 가지 기전을 통한 보호반응과 면역반 응이 일어나게 되는데 CAMs의 발현은 손상에 대한 신경계의 반응에서 중요한 요소 중의 하나라고 알려져 있다(Cortman등,1998).신경계 손상 후에 일어나는 CAMs의 발현변화는 실험동물모델에서 여러 차례 보고가 되고 있으며 현재까지 도 많은 연구가 진행되고 있다.특히 CAMs중에서도 CHL1은 dorsalroot손상 이후,척수후근신경절(DRG,dorsalrootganglia)의 신경세포에서 CHL1의 발현 이 증가되었다는 보고가 있으며(Brook 등,2000),말초신경 손상 후 일어나는 wallerian degeneration과정에서 ICAM을 knockout시키자 axon의 회복효과가 훨 씬 더 높은 것으로 나타났다(Thelin등,2003).
뇌신경계는 성상세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia) 및 신경세포 (neuron)로 이루어져 있다.성상세포는 뇌신경계의 거의 대부분을 차지하고 있는 데 이에 비해 신경세포는 뇌신경계에서 소량만이 존재하고 있다.여러 가지 신경 계 손상에 대해 성상세포와 미세아교세포는 각종 보호작용을 통해 신경세포를 보호한다.특히 미세아교세포는 면역세포 중의 하나인 대식세포와 같은 기능을 지닌 세포로 사멸한 세포에서 분비되는 각종 부유물을 제거하고,여러 가지 면역 반응에 관여한다.최근의 연구들에서 미세아교세포나 성상세포에 TNF-α(Tumor necrosisfactor-α),IL-1β(Interleukin-1β)와 같은 여러 가지 cytokine을 처리하면 ICAM-1의 발현이 증가된다고 보고되고 있다.이러한 ICAM-1은 염증반응시 여 러 가지 면역세포들이 염증부위로 이동하게 되는데 이러한 이동에 있어 면역세 포의 trafficking에 중요한 작용을 하며 면역세포를 활성화 시키는 기능을 한다고 알려져 있다(Ballestas와 Benveniste,1995).
이러한 cytokine이외에도 LPS(lipopolysaccharide)는 그람음성 세균의 내독 소(endotoxin)로 면역계에 비특이적인 활성화 작용으로 쇼크를 유발하여 TNF-α,
IL-1β와 같은 여러 가지 cytokine과 PG(prostaglandin)등을 대량 생성함으로써 염증반응을 일으키고 그 결과 NO(Nitric oxide)와, ROS(Reactive oxygen species)를 생성함으로써 신경세포의 손상을 일으킨다고 알려져 있다(Minghetti
등,1997).
NMDA(N-methyl-D-asparticacid)는 다양한 신호전달 작용을 자극하여 신
경세포의 흥분성(excitability)을 유도함으로써 NMDA 수용체가 과도하게 활성화 되어 신경세포의 사멸을 일으킨다.NMDA로 유도되는 이러한 excitotoxicity작용 은 ischemia와 같은 저산소 상태에서 유발되는 stroke나 여러 가지 퇴행성 신경 질환과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다(Barnes와 Slevin,2003;Gillessen 등, 2002;Winblad등,2002).또한 NMDA는 배양된 신경세포에서 ROS를 생성할 뿐 만 아니라 세포 내의 Ca2+ 농도를 증가시키고,여러 가지 염증반응을 유도하는 매개체들을 분비하여 세포의 사멸을 일으킨다고 알려져 있다(Bonfoco등,1995; Dubinsky,1993;Pereira등,2000;Urushitani등,2001).
이러한 다양한 신경세포의 손상은 여러 가지 신호전달 기전만이 일부 밝혀 져 있을 뿐 이와 관련된 여러 가지 세포부착분자들의 발현과 그 역할에 대한 연 구는 미비한 실정이다.
이를 바탕으로 본 연구에서는 vivomodel과 vitro model을 이용하여 신경 계에서 신경손상에 따른 세포부착분자들의 발현변화를 관찰하고자 하였다.특히 신경계에서 중요하게 작용될 것으로 기대되는 ICAM-1,NCAM,N-cadherin, CHL1,L1을 중심으로 신경 손상시에 이러한 세포부착분자들이 어떻게 변화되는 지를 파악하고 신경계 세포들에서 이러한 세포부착분자들의 발현양상을 알아보 고자 한다.
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AAA...실실실험험험동동동물물물 및및및 시시시약약약 111...실실실험험험 동동동물물물
신경세포(neuron)배양은 ICR 생쥐의 배자(embryo)14일된 것을 사용하였다. 성상세포(astrocyte)배양은 생후 1～3일된 ICR 생쥐를 사용하였고,미세아교세포 (microglia)배양은 BV-2 세포주(murinemicroglia cellline)를 사용하였다.동물 실험에는 4주령(200～250g)의 SD(SpragueDawley)흰쥐 수컷을 사용하였다.
222...실실실험험험 시시시약약약
NMDA(N-methyl-D-aspartic acid)와 LPS(lipopolysaccharide,Escherichia
coli,O127:B8)는 Sigma(St.Louis,MO,USA)에서 구입하였고,TNF-α와 IL-1β
는 Calbiochem(LaJolla,CA)에서 구입하였다.MK-801은 Tocris(Brisol,UK)에 서 구입하였다.세포배양에 필요한 배지의 조성 성분으로써 Fetalbovineserum, Horse serum 및 glutamine은 Gibco-BRL(Grand Island,NY)에서 구입하였다. RNA 분리에 사용한 easy-blue는 Intron(Seoul, Korea)에서 구입하였으며, RT-PCR에서 사용하는 AMV reverse transcriptase, random primer는 Roche(Germany)에서 구입했고 dNTP mix,RNase inhibitor와 PCR-premix는 Takara(Seoul,Korea)에서 구입하였다.NCAM,ICAM,N-cadherin,CHL1,L1, GAPDH primer는 Bioneer(Seoul,Korea)에서 제작 구입하였다.
BBB...실실실험험험 방방방법법법 111...세세세포포포배배배양양양 (((AAA)))대대대뇌뇌뇌피피피질질질 순순순수수수신신신경경경세세세포포포 대뇌피질 순수신경세포배양은 임신 14일의 ICR 생쥐를 ethylether로 마취 한 후,배자를 얻어내어 수술 현미경 하에서 배자로부터 뇌를 적출하였으며,뇌 막을 제거하고 대뇌 피질 부위를 분리하여 5% horseserum과 5% fetalbovine
serum,2mM glutamine이 포함된 MEM(eaglesminimalessentialmedium)배지 (PM5+5)를 약 4ml첨가하여 pasteurpipette을 사용해 trituration한다.이렇게 하 여 얻은 대뇌 피질 현탁액을 PM 5+5배지에서 37℃,5% CO2가 포함된 배양기에 서 1주일간 배양한 후 실험에 사용하였다.배양 후 약 72시간 후에 Ara-c (cytarabine)를 최종농도 5µM이 되도록 처리하였다. (((BBB)))대대대뇌뇌뇌피피피질질질 혼혼혼합합합신신신경경경세세세포포포 혼합신경세포배양은 일차 순수성상세포를 배양한 후,2주가 되었을 때 내뇌 피질 신경세포를 함께 배양하였다.성상세포를 배양한지 2주 후에 성상세포 위에 대뇌피질 순수신경세포배양과 같은 방법으로 얻어낸 대뇌피질신경세포를 뿌려주 고 37°C,5% CO2가 포함된 배양기에서 1주일동안 배양한 후 실험에 사용하였다. (((CCC)))성성성상상상세세세포포포 성상세포는 생후 1～3일된 ICR 생쥐를 얼음에 담궈 얼린 후,수술 현미경 하에서 뇌를 적출하여 뇌막을 제거하고 대뇌 피질부위를 분리하였다.이를 0.1% trypsin용액에 넣고 37°C waterbath에서 약 5분간 두었다가 trypsin용액을 완전 히 제거하고 MEM(eagles minimalessesntialmedium)에 10% fetalbovine serum과 10% horseserum,2mM glutamine가 포함된 배지(PM10+10)를 약 4ml 첨가하여 pasteurpipette을 사용하여 trituration한다.이렇게 하여 얻은 세포현탁 액을 1µg/mlEGF(epidermalgrowthfactor)가 첨가된 PM10+10배지에서 배양하 였다.배양 후 매주 2회씩 10% horseserum과 2mM glutamine이 포함된 배지 (GM)로 바꾸어 주었으며,37°C,5% CO2가 포함된 배양기에서 2주일동안 배양한
후 실험에 사용하였다. 222...실실실험험동험동동물물물모모모델델델
200～250g의 무게인 수컷 쥐를 사용하여 pentobarbitalsodium 60mg/kg을 복강으로 주사하여 마취시킨다.마취가 되면 등의 털을 깎고 쥐의 등쪽이 위로
오도록 하여 엉치뼈를 기준으로 lumbar 6번 부분을 수술용 칼로 중심선에서 0.5cm정도 아래를 절개한다.이 때 거즈로 살짝 누르면서 혈액을 제거한다.피부 를 자른 것과 같은 위치의 근육층을 절개하여 꼬리와 연결된 붉은 근육을 드러 낸다.엉치뼈 부분 즉 척수신경 lumbar4-5번 부분이 들어가는 부분의 근육과 뼈를 조금씩 제거하면서 척수신경 lumbar4-5번이 들어가는 부분을 단단히 묶는 다(3/0mersilk).근육층을 꿰매주고 피부를 꿰매준 후 요오드를 넓게 충분히 발 라주고 마취가 풀릴 때까지 따뜻하게 유지시켜준다.수술 후 3일,1주일,3주 후 에 쥐의 복강으로 pentobarbitalsodium 75mg/kg를 주사하여 마취시킨다.차가운 생리식염수를 10ml/min속도로 관류시켜 혈액을 제거한다.수술용 칼로 수술한 부위를 절개하고 척추가 드러나도록 한 후 척수와 척수신경이 상하지 않도록 척 추의 마디를 하나씩 드러내어 lumbar4번의 위치까지 보이게 한다.수술한 왼쪽 과 수술하지 않은 오른쪽의 척수신경 lumbar 4번과 5번의 척수후근신경절 (Dorsalrootganglia,DRG)을 떼어낸다.떼어낸 척수후근신경절의 RNA를 분리 하여 RT-PCR을 수행한다.
333...약약약물물물의의의 처처처리리리
본 실험에서 사용한 약물로는 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)를 100ng/ml,IL-1β(Interleukin-1β)를 10ng/ml,LPS(Lipopolysaccharide)를 10µg/ml, NMDA(N-methyl-D-aspartic acid)를 100µM의 농도로 사용하였으며 LPS에 대
한 정상대조군으로는 fetalbovineserum 1%를 처리하였고,NMDA는 다른 약물 을 처리하기 전에 20분 전처리하였다. 또다른 실험에서는 NMDA를 10µM, 30µM,50µM,100µM로 처리하였고,MK-801을 처리한 군에는 NMDA 100µM을 처리하였다.MK-801은 10µM을 사용하였으며 NMDA를 처리하기 전에 30분 전 처리 하였다.모든 약물 처리시에는 serum이 포함되지 않은 배지를 사용하였다.
444...RRRNNNAAA분분분리리리
후,차갑게 준비한 easyblue(Intron,Korea)를 각 well에 1ml씩 넣어주고 세포를 긁어 모은다.1.5mltube로 옮긴 후,chloroform(Sigma,St.Louis,MO)을 200µl 첨가하고 4°C,14,000r.p.m으로 20분간 원심분리 한다.상층액을 다른 tube에 옮 겨 담고 동량의 isopropanol(Sigma,St.Louis,MO)을 첨가하여 상층액과 잘 섞 이도록 하여 4°C,14000r.p.m으로 20분간 원심분리 한다.상층액을 따라버리고 70% ethanol을 1ml넣어주어 잘 섞은 다음 4°C,14000r.p.m으로 20분간 원심분 리한다.상층액을 제거하고 RNA침전물의 물기가 마르도록 약 30분간 방치한 후 DEPC-H2O를 넣어 침전물이 잘 섞이도록 70°C에서 5분간 중탕한다.RNA정량은
spectrophotometer(Pharmacia,LKB,Finland)를 이용하여 측정한다.
동물실험모델의 경우에는 떼어낸 DRG조직을 미리 차갑게 준비해 둔 easy-blue1ml에 넣고 homogeniger로 조직을 약 50초간 갈아준 뒤 위와 동일한 방법으로 RNA를 분리한다.
555...RRRTTT---PPPCCCRRR(((RRReeevvveeerrsrsseeetttrrraaannnsscsccrrriiippptttiiiooonnn---pppooolllyyymmmeeerrraaassseeeccchhhaaaiiinnnrrreeeaacacctttiiiooonnn)))
1µg의 totalRNA를 random primerp(dN),5mM MgCl2,1mM dNTP,50U
RNaseinhibitor,20U AMV reversetranscriptase와 함께 25°C에서 10분,60°C 에서 60분,95°C에서 10분간 반응시킨다.
PCR 반응은 5pM primer(Bioneer,Korea)를 PCR 용액(10mM Tris/HCl, 1.5mM MgCl2,50mM KCl,pH 8.3)에서 4mM MgCl2가 들어있는 PCR buffer,
0.5U Tag polymerase,0.4mM dNTP가 혼합되어 있는 PCR-premix(Takara, Japan)에 firststrand cDNA template를 2µl를 넣어주어 수행한다.PCR에 사용 한 primer는 다음과 같다.
<GAPDH primer>
sense:5'-GTG-AAG-GTC-GGT-GTG-AAC-GGA-TTT-3' antisense:5'-CAC-AGT-CTT-CTG-AGT-GGC-AGT-GAT-3'
<ICAM-1primer>
sense:5'-ATC-AAT-GGA-CAG-CAT-TTA-CC-3' antisense:5'-TCC-TTT-TCT-TCT-CTT-GCT-TG-3' <NCAM primer>
sense:5'-TCA-TGG-ACA-TCA-CCT-GCT-AC-3' antisense:5'-TCT-GTC-AGT-GGT-GTG-GTC-TC-3' <N-cadherinprimer>
sense:5'-TGT-TGC-AGA-AAA-CCA-AG-3' antisense:5'-TGA-CAT-TTG-GCG-ACT-CTC-TG-3' <CHL1primer> sense:5'-TAC-TTG-GAT-CAG-ACC-ATT-CC-3' antisense:5'-CCT-AGA-CAT-GGG-TGT-GAC-TT-3' <L1primer> sense:5'-GTG-ACC-CTA-TGC-CAA-CAG-AC-3' antisense:5'-TGG-CCC-ATA-CAA-ATG-ACT-CT-3' 666...WWWeesessttteeerrrnnBnBBlllooottttttiiinnnggg
6wellplate를 인산완충액(phosphatebufferedsaline;PBS)으로 2회 세척한 후,2mM PMSF(phenylmethylsulfonylfluoride),10uM leupeptin,10mM EDTA, 2mM pepstatin, 2mM aprotinin, 2mM 1, 10-phenanthroline(metalloprotease inhibitor)을 SDS sample buffer(62.5mM Tris-HCl pH 6.8,2% SDS,10% glycerol,50mM MTT,0.1% bromphenolblue)에 첨가하여 세포를 긁어모은다.5 초 간격,5회의 sonication으로 세포를 파쇄한 후 100℃에서 5분간 끓이고 8%
SDS-PAGE 전기영동 한다.전기영동한 후 gel을 PVDF(polyvinilidenedifluoride membrane,Milipore)에 electrotransfer한 뒤 5% non-fatdrymilk로 blocking한 다.1시간 후 N-cadherin(rabbitpolyclonalantibody,Santa Cruz,1:500)항체를 상온에서 밤새 반응시킨다.TBS-T(0.05% Tween20,10mM Trisbase,150mM NaCl,pH 8.0)로 세척하고 HRP-linked 항체(cellsignalling,1:5000)로 상온에서 1시간 동안 반응시키고 TBS-T로 세척한 후,ECL로 이용하여 발색시켰다.
777...MMMTTTTTT aaassssssaaayyy
24wellplate에 5mg/mlMTT(sigmachemical)를 최종 농도 0.5mg/ml이 되 도록 각 well에 첨가하고 2시간동안 5% CO2,37℃ 배양기에서 배양한다.각
well에 200µl의 solubilizationbuffer를 넣고 빛을 차단한 상태에서 5% CO2,37℃
배양기에서 10시간 동안 배양한 후 상층액을 얻어 595nm파장에서의 흡광도를 측정하였다.
888...통통통계계계처처처리리리
모든 자료는 평균 ±S.E.M.으로 나타냈고 Students'T-Test로 통계처리 하 여 p〈 0.05수준에서 유의성을 검증하였다.
I
I
II
I
II
I
I.
.
.결
결
결 과
과
과
AAA...척척척수수수신신신경경경결결결찰찰찰(((SSSppipiinnnaaalllnnneeerrrvvveeellliiigggaaatttiiiooonnn)))을을을 통통통한한한 CCCAAAMMMsss의의의 mmRmRRNNNAAA 발발발현현현
실험동물에서의 CAMs의 발현을 확인하고자 척수신경을 묶어 신경손상을 일으킨 동물실험모델을 사용하였다.lumbarlevel4,5번의 척수신경을 묶고 나서 3일,7일,21일 후에 DRG(DorsalRoot ganglia,척수후근신경절)를 떼어내어 NCAM과 CHL1,ICAM-1의 발현변화를 mRNA상에서 관찰하였다.NCAM의 경 우 척수신경결찰 후 시간이 지남에 따라 정상대조군과 비교하여 큰 차이 없이 거의 일정한 수준으로 발현되었으나,CHL1과 ICAM-1의 경우 정상대조군과 비 교하여 척수신경결찰 후 시간의 경과에 따라 mRNA 발현이 증가되었다.CHL1 의 경우는 7일 후에 발현이 증가하여 21일 후까지 증가양상이 지속되는 것을 관 찰할 수 있었으며,ICAM-1의 경우는 3일 후에 발현이 증가하여 7일후에는 최고 에 도달하였다가 21일에는 회복되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.1). BBB...신신신경경경계계계를를를 구구구성성성하하하는는는 세세세포포포 종종류종류류에에에 따따따른른른 CCCAAAMMMsss의의의 발발발현현현변변변화화화 111...신신신경경경교교교세세포세포포에에에서서서 나나나타타타나나나는는는 CCCAAAMMMsss의의의 mmmRRRNNNAAA 발발발현현현 뇌신경계를 구성하고 있는 세포 종류에 따른 CAMs의 발현변화를 관찰하 기 위해 성상세포와 미세아교세포에서 어떠한 종류의 CAMs이 발현되는지를 mRNA상에서 비교하였다.TNF-α(100ng/ml),IL-1β(10ng/ml),NMDA(100µM), LPS(10µg/ml)를 각각 처리하고 6시간 후에 mRNA를 분리하여 RT-PCR을 수행 하였다.
성상세포와 미세아교세포에서 ICAM-1,NCAM,N-cadherin,CHL1,L1의 mRNA 발현을 관찰한 결과 성상세포에서는 ICAM-1, NCAM, N-cadherin, CHL1이 발현되는 반면,미세아교세포에서는 ICAM-1과 CHL1만이 발현되었다. 성상세포에서 TNF-α, IL-1β 그리고 LPS를 처리하였을 때 ICAM-1의 발현이 증가하였는데 이중에서도 특히 LPS 처리시에는 현저하게 발현이 증가되었다.
FFFiiiggg...111...SSSpppiiinnnaaalllnnneeerrrvvveeellliiigggaaatttiiiooonnn(((SSSNNNLLL)))---iiinnnddduuucceceeddd CCCAAAMMMsssmmmRRRNNNAAA eeexxxppprrreeessssssiiiooonnn iiinnn vvviiivvvoo.o..DRG was isolated after 3,7 and 21days with spinalnerve ligation. TotalRNA was isolated from DRG and analyzed by RT-PCR.A relative amountofeachCAMscomparedtoGAPDH mRNA.Valuesareexpressedas mean±S.E.M.
*
:p〈 0.05vscontrol.한편 NCAM과 N-cadherin은 모든 약물에 대해 발현의 변화가 거의 일어나지 않았다.미세아교세포는 BV-2세포주(murinemicroglialcellline)를 사용하였는 데 성상세포에서와 같이 LPS 처리시 현저하게 ICAM-1의 발현이 증가하였고, TNF-α 처리시에는 CHL1의 발현이 감소하였으며 NMDA 처리시에는 ICAM의 발현이 감소하였다(Fig.2). 222...신신신경경경세세세포포포에에에서서서 나나나타타타나나나는는는 CCCAAAMMMsss의의의 mmmRRRNNNAAA 발발발현현현 신경세포에서의 CAMs의 mRNA 발현양상을 보고자,대뇌피질 순수신경세 포와 대뇌피질 혼합신경세포에서 CAMs의 mRNA 발현을 검토하였다.대뇌피질 순수신경세포에서는 NCAM,N-cadherin,CHL1,L1은 발현되었으나 ICAM-1은 발현되지 않았고,대뇌피질 혼합신경세포에서는 ICAM-1,NCAM,N-cadherin, CHL1,L1이 모두 발현되었다. 각 세포는 자극에 따라 CAMs의 발현변화 정도가 다르게 나타났다.대뇌피 질 순수신경세포에서 TNF-α 처리시 CHL1의 발현은 증가되었으나 NCAM과 N-cadherin, L1의 발현정도에는 큰 변화가 없었고, NMDA 처리시에는 N-cadherin이 눈에 띄게 감소하였다.대뇌피질 혼합신경세포에서는 NMDA 처리 시 N-cadherin과 L1의 발현은 감소되었다(Fig.3). 333...신신신경경경세세세포포포에에서에서서 나나나타타타나나나는는는 NNN---cccaaadddhhheeerrriiinnn의의의 단단단백백백질질질 발발발현현현 N-cadherin이 신경세포의 단백질 수준에서는 어떻게 변화하는지 발현양상 을 검토하였다. 배양된 신경세포에 TNF-α(100ng/ml), IL-1β(10ng/ml), NMDA(100µM),LPS(10µg/ml)를 처리하여 8시간 후에 N-cadherin의 단백질 변 화를 관찰한 결과,대뇌피질 순수신경세포에서 NMDA를 처리하였을 때 유의성 있게 N-cadherin의 발현이 감소하였고,TNF-α와 IL-1β 그리고 LPS 처리시에는 정상대조군과 비교하여 변화가 없었다.이에 비해 대뇌피질 혼합신경세포에서는 모든 CAMs이 정상대조군과 비슷한 양상으로 발현되었다(Fig.4).
AAA)))
BBB)))
FFFiiiggg...22.2..EEExxxppprrreeessssssiiiooonnn ooofffCCCAAAMMMsss mmmRRRNNNAAA iiinnn gggllliiiaaalllccceeellllllsss... AAA)))Astrocytes and BV-2 cells were treated for 6hr with LPS(10µg/ml), TNF-α(100ng/ml), IL-1β(10ng/ml)andNMDA(100µM).Fetalbovineserum weretreatedforfinal concentration 1% on control serum-treatment group(CTL+S) and LPS-treatment group. NMDA was pretreated 20min before other drugs treatment.TotalRNA wasisolated and analyzed by RT-PCR.BBB)))A relative amountofeachCAMscomparedtoGAPDH mRNA.Valuesareexpressedas mean±S.E.M.*:p〈0.05vscontrol.
AAA)))
BBB)))
FFFiiiggg..3.33...EEExxxpprprreeessssssiiiooonnnooofffCCACAAMMMsssmmmRRRNNNAAA iiinnnnnneeeuuurrrooonnsnss... AAA)))Purecorticalneurons and mixed cortical neurons were treated for 6hr with LPS(10µg/ml), TNF-α(100ng/ml), IL-1β(10ng/ml), NMDA(100µM). Fetal bovine serum were treated for final concentration 1% on control serum-treatment group(CTL+S)and LPS-treatment group. NMDA was pretreated 20min before other drugs treatment. Total RNA was isolated and analyzed by RT-PCR. BBB))) A relative amount of each CAMs compared to GAPDH mRNA.Values are expressed as mean ± S.E.M.
*
:p〈 0.05 vscontrol.AAA)))
BBB)))
FFFiiiggg...444...EEExxxppprrreeessssssiiioononn ooofffNNN---cccaaadddhhheeerririinnn iiinnn nnneeeuuurrrooonnnsss...AAA)))Pure corticalneurons and mixed cortical neurons were treated for 8hr with LPS(10µg/ml), TNF-α(100ng/ml), IL-1β(10ng/ml), NMDA(100µM). Fetal bovine serum were treated for final concentration 1% on control serum-treatment group(CTL+S) and LPS-treatment group. NMDA was pretreated 20min before another drugs treatment. Total protein was isolated and analyzed by western blotting.BBB))) A relative amount of each N-cadherin compared to Actin protein.Values are expressed as mean ± S.E.M.
*
: p〈 0.05vscontrol.CCC...순순순수수수신신신경경경세세세포포포에에에서서서 NNNMMMDDDAAA의의의 세세포세포포사사사멸멸멸과과과 CCCAAAMMMss발s발발현현현에에에 미미치미치치는는는 효효효과과과 111...순순순수수수신신신경경세경세세포포포에에에서서서 NNNMMMDDDAAA가가가 세세세포포포사사사멸멸에멸에에 미미미치치치는는는 효효효과과과
NMDA는 신경세포를 흥분시켜 신경세포로 하여금 excitotoxicity를 유발함 으로써 세포독성을 나타내는 신경전달물질로 알려져 있다.따라서 여러 종류의 자극 중 NMDA 처리시에 나타나는 CAMs의 발현변화양상을 대뇌피질 순수신경 세포에서 좀더 구체적으로 살펴보고자 하였다. NMDA가 대뇌피질 순수신경세포 사멸에 있어 어느 정도의 영향을 주는지 MTT assay를 통해 확인하였다.NMDA를 농도별(10µM,30µM,50µM,100µM) 로 처리하고,MK-801(10µM)을 처리한 군에는 NMDA 100µM을 처리하여 4시 간,8시간,12시간 후에 MTT assay를 수행한 결과,NMDA는 농도의존적으로 세포의 사멸을 유도했으며,시간이 지남에 따라 사멸의 정도가 증가하였고, NMDA receptorantagonist인 MK-801에 의해서 유의성 있는 세포보호작용을 보였다(Fig.5). 222...순순순수수수신신신경경경세세세포포포에에에서서서 NNNMMMDDDAAA에에에 의의해의해해 나나나타타타나나나는는는 CCCAAAMMsMss의의의 mmmRRNRNNAAA 발발발현현현 NMDA가 대뇌피질 순수신경세포 사멸에 미치는 영향을 바탕으로 이러한 조건에서는 CAMs의 발현이 어떻게 변화하는지를 관찰하였다.NMDA를 농도별 (10µM,30µM,50µM,100µM)로 처리하고,MK-801(10µM)을 처리한 군에는 NMDA 100µM을 처리하여 6시간 후에 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행하였 다.
NMDA에 의한 CAMs의 mRNA 발현변화에 있어서 NCAM,CHL1과 L1은 NMDA 처리에 의해 농도의존적인 감소는 보이지 않았으나,CHL1의 경우는 NMDA 100µM을 처리하였을 때 정상대조군에 비해 유의성 있게 발현이 감소하 였으며, N-cadherin은 NMDA 농도의존적으로 발현이 감소하였고 NMDA receptorantagonist인 MK-801을 처리하였을 때 이러한 감소현상이 회복되었다. 즉,excitotoxicity를 일으키는 NMDA는 신경세포의 사멸을 유도하고 이러한 신 경세포의 사멸은 신경계에서 발현되는 CAMs 중 N-cadherin의 mRNA 발현을
농도의존적으로 감소시켰음을 알 수 있었다(Fig.6). 333...순순순수수수신신신경경경세세세포포포에에에서서서 NNNMMMDDDAAA에에에 의의의해해해 나나나타타타나나나는는는 NNN---cccaaadddhhheeerrriiinnn의의의 단단백단백백질질질 발발발현현현 대뇌피질 순수신경세포에서 N-cadherin의 단백질수준에서의 발현변화를 알 아보기 위해서 배양된 순수신경세포에 NMDA와 MK-801을 처리하고 8시간 후 N-cadherin의 단백질 변화를 관찰한 결과, 대뇌피질 순수신경세포에서 N-cadherin은 NMDA 처리시 농도의존적으로 발현이 감소하는 경향을 보였으며, NMDA receptorantagonist인 MK-801처리시 이러한 감소현상이 회복되었다.대 뇌피질 신경세포는 NMDA에 의해 세포사멸이 일어나고 이때 신경계에서 발현되 는 CAMs 발현변화를 일으키는데 N-cadherin의 경우 mRNA와 단백질 발현을 모두 감소시켰음을 알 수 있었다(Fig.7).
FFFiiiggg...555...EEfEfffffeeeccctttooofffNNNMMMDDDAAA ooonnn ttthhheeeccceeellllllvvviiiaaabbbiiillliiitttyyy iiinnn pppuuurrreeeccocoorrrtttiiicccaaalllnnneeeuuurrrooonnnsss... Pure cortical neurons were treated for 4hr, 6hr and 12hr with NMDA in a dose-dependent manner and cell viability was measured by MTT assay. MK-801(10µM) was pretreated 30min before NMDA treatment. Valuesareexpressed asmean ± S.E.M.
*
:p〈0.05vscontrol,#:p〈0.05 vsNMDA 100µM treated.AAA)))
BBB)))
FFFiiiggg... 666.. N.NNMMMDDDAAA---iiinnnddduuuccceeeddd CCACAAMMMsss mmmRRRNNNAAA eeexxxppprrreeessssssiiiooonnn iiinn pn ppuuurrreee cccooorrrtttiiicccaaalll nnneeeuuurrrooonnnsss... AAA)))Purecorticalneurons weretreated for6hrwith NMDA in a dose-dependentmannerand MK-801 was pretreated 30min before NMDA treatment.TotalRNA wasisolatedandanalyzedbyRT-PCR. BBB)))A relative amountofeachCAMscomparedtoGAPDH mRNA.Valuesareexpressedas mean±S.E.M.
*
:p〈0.05vscontrol.#:p〈0.05 vsNMDA 100µM treated.AAA)))
BBB)))
FFFiiiggg...777...NNMNMMDDDAAA---iiinnnddduuuccceeedddNNN---cccaaadddhhheeerrriiinnn eeexxpxpprrreeessssssiiionoonn iiinn pnppuuurrreeeccocoorrrtttiiicccaaalllnnneeeuuurrrooonnnsss... AAA))) Pure cortical neurons were treated for 8hr with NMDA in a dose-dependent manner and MK-801(10µM) was pretreated 30min before NMDA treatment. Total protein was isolated and analyzed by western blotting BBB)))A relative amountofeach N-cadherin compared to Actin protein.Values are expressed as mean ± S.E.M.
*
:p〈0.05 vs control.#:p〈0.05 vsNMDA 100µM treated.I
I
IV
V
V.
.
.고
고
고 찰
찰
찰
본 실험에서는 다양한 신경 손상 유발시 세포부착분자들의 발현변화를 알 아보고 신경계를 이루는 세포들에서의 세포부착분자들의 발현양상을 알아보고자 하였다. 척수신경을 묶어 신경손상을 유발한 실험동물모델에서는 CHL1과 ICAM-1의 유의적인 발현의 증가를 보였다.CHL1은 신경 손상 후 비교적 오랜 시간까지 발현이 지속된 반면,ICAM-1의 경우는 신경 손상 후 짧은 시간동안 발현이 증가되었다가 오랜 시간이 지나면 다시 정상수준으로 회복되는 것을 확 인하였다. 동물실험 모델에서 나타난 결과를 바탕으로 배양 세포에서 CAMs의 발현 양상과 발현변화를 조사해 보았다.신경계를 이루는 세포들에서의 CAMs의 발현 양상을 알아본 결과,ICAM-1(Intercellularcelladhesionmolecule-1)은 성상세포 와 미세아교세포에서 발현되었고, NCAM(Neural cell adhesion molecule)과 N-cadherin(Neural cadherin)은 신경세포와 성상세포에서 발현되었다.그리고 CHL1(ClosehomologueofL1)은 신경세포,성상세포와 미세아교세포에서 발현 되었고,L1은 신경세포에서만 발현되었다.성상세포와 미세아교세포에서의 ICAM-1의 발현은 중추신경계에서 여러 가 지 cytokine으로 유발된 염증반응 부위에서 lymphocyte와 신경교세포들이 작용 하는데 중요한 역할을 하고 있음이 보고되었는데(Satoh등,1991)이는 ICAM-1 이 신경계에서 염증반응과 중요한 관련이 있음을 시사하고 있다.성상세포의 정 상조건에서 항상 일정하게 발현되는 ICAM-1은 TNF-α 또는 IL-1β 그리고 LPS 등에 의해 강력히 유도되는데 이러한 ICAM-1의 발현 조절은 PKC(protein kinaseC)의 활성과 관련되어 있음이 보고되었다(Ballestas와 Benveniste,1995). 이와 같은 cytokine등에 의한 신경교세포의 활성화는 본 실험에서 사용된 혼합신 경세포에서도 관찰되었다.본 실험에서 배양된 혼합신경세포는 대부분이 일차 배 양한 성상세포와 신경세포 및 아주 소량의 미세아교세포가 혼합된 상태로, TNF-α나 IL-1β등에 의한 ICAM-1의 발현이 순수신경세포만을 배양한 경우에서
는 나타나지 않고 혼합신경세포에서만 발현된 것으로 보아 TNF-α,IL-1β 그리 고 LPS에 의해 활성화된 소량의 미세아교세포와 성상세포에서 나타나는 ICAM-1의 발현이 혼합신경세포에서의 ICAM-1의 발현에 반영되었음을 알 수 있었다.본 실험에서 ICAM-1의 mRNA는 여러 가지 cytokine처리시 성상세포 와 미세아교세포 그리고 혼합신경세포에서 발현이 증가되었고,척수신경결찰과 같은 신경손상시에도 발현이 증가되는 것으로 보아 ICAM-1은 말초신경계와 중 추신경계에서 일어나는 염증반응과 관련되어 중요한 역할을 하고 있음을 추측할 수 있었다.
N-cadherin은 중추신경계의 시냅스에서 presynapticneuron과 postsynaptic neuron사이의 부착을 조절하는데 있어 중요한 작용을 하는 부착분자로 Ca2+에
의존적인 세포부착분자이다.N-cadherin의 extracellulardomain은 Ca2+에 매우 의존적인 성질을 갖기 때문에 세포외부에 Ca2+이 풍부하게 존재하는 경우에는
homophilicinteraction을 통해 N-cadherin이 이중체를 형성하여 시냅스에서의 부 착을 단단하게 유지시키는데,세포외부에 존재하던 Ca2+이 NMDA channel이나 voltage-gated Ca2+channel을 통해서 세포내로 유입되어 세포외부에 Ca2+이 부
족하게 되면 단단하게 이중체를 형성하고 있던 N-cadherin은 불안정한 상태로 구조적인 변형을 하여 시냅스 사이의 결합이 약화되고 세포내에서 신호전달을 담당하고 있던 여러 가지 구성요소들의 변화를 야기한다(Murase와 Schuman, 1999).본 실험에서는 신경을 흥분시켜 세포내의 Ca2+농도를 증가시킴으로써
excitotoxicity를 일으킨다고 알려진 신경전달물질 NMDA(N-mathyl-D-aspartic acid)를 사용하여 여러 가지 세포부착분자들의 발현양상을 검토하였고 이를 N-cadherin의 발현양상과 비교하여 보았다.다른 세포부착분자에서는 뚜렷한 발 현변화가 일어나지 않은 것과는 달리 N-cadherin의 경우 mRNA상에서 뿐만 아 니라 단백질상에서도 NMDA 농도의존적으로 mRNA의 발현이 감소하였고 NMDA receptorantagonist인 MK-801에 의해서는 NMDA에 의한 N-cadherin 의 발현 감소가 회복되었다.본 실험에서 NMDA는 10,30,50,100µM의 농도를 사용하였는데 MTT assay결과 농도의존적으로 세포사멸을 일으키고 있음을 확
인하였으며 또한 MK-801에 의해서도 NMDA에 의한 세포사멸이 유의적으로 억 제됨을 확인함으로써 NMDA가 세포사멸에 영향을 미치고 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과들을 통해 신경세포에서는 각 세포부착분자들이 하나의 세포독성 자 극에 의해서 각기 다른 영향을 받고 있음을 확인할 수 있었고,세포부착분자들은 신경세포의 synapticplasticity와 같은 신경계의 기능 조절에 있어 서로 다른 역 할을 하고 있음을 추측할 수 있었다.특히 N-cadherin과 같은 세포부착분자는 세포의 생존과 사멸에 연관되어 있을 것으로 생각되었다.
해마(Hippocampus)의 신경세포에서 세포내로 NMDA 나 K+ 등을 투여한 경우 세포막이 탈분극 되는데 이 때 시냅스 사이에서 N-cadherin은 매우 안정적 인 이중체를 형성하여 단백질 분해효소에 대한 저항성이 크게 증가하며 여기에 NMDA agonist를 처리하여 NMDA 수용체를 자극하자 trypsin에 대한 저항성이 증가되었을 뿐만 아니라 N-cadherin의 이중체 형성이 촉진되는 분자적 수준의 변형이 일어났다는 보고가 있는데(Tanaka등,2000),이는 N-cadherin이 구조적, 기능적으로 NMDA 수용체와 연관되어 있음을 시사하고 있다.또한 N-cadherin 은 NMDA 수용체 뿐만 아니라 β-catenin이라는 cytoskeletalprotein과 구조적으 로 연관되어 있는데 β-catenin의 Tyr-654부위의 인산화가 N-cadherin과의 친화 력을 조절한다고 알려져 있다(Erin과 Sachiko,2003).β-catenin과 N-cadherin의 친화력은 시냅스유지에 있어 중요한 역할을 하고 있으며 이러한 cytoskeleton과 의 상호작용을 통해 여러 가지 세포내부로의 신호전달이 일어나게 되며 (Tryanovsky, 1999), KCl이나 NMDA등에 의한 세포의 탈분극은 Cdk5(cyclin-dependentkinase5)의 활성을 저해하여 β-catenin의 인산화를 감소 시킴으로써 β-catenin과 N-cadherin의 친화력을 증가시킨다는 보고가 있다 (Schuman과 Murase,2003).β-catenin과 N-cadherin의 친화력이 신경세포의 활 성에 중요하게 작용하는 시냅스 유지에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 보아 이들의 친화력의 조절이 신경세포의 생존과 사멸에 중요한 영향을 줄 것으로 생 각된다.뿐만 아니라 전기적 자극에 의해 일시적으로 세포외부에 존재하던 Ca2+ 이 voltage-gated Ca2+channel과 NMDA channel을 통해 세포내로 유입되는데
여기에 N-cadherin의 활성을 억제하는 항체를 처리하면 불안정해진 cadherin bond에 이러한 항체들이 결합하게 되어 세포부착이 저해된다는 보고가 있다 (Murase와 Schuman,1999).NMDA 처리시에도 전기적 자극에 의해 나타난 것 과 같이 NMDA channel즉,NMDA 수용체를 통해 세포내로 Ca2+이 과도하게
유입됨으로써 세포외부에 존재하던 Ca2+이 부족해지게 되어 cadherin bond가 불 안정하게 변형될 것으로 생각된다. 최근 protemic analysis를 통해 밝혀진 NMDA 수용체와 부착단백질 신호전달에 관여하는 complex들이 알려진 바 있는 데(Husi등,2000)이러한 단백질 중에서 calpain과 같은 단백질 분해효소가 불안 정해진 cadherin bond부위나 cadherin의 이중체 형성에 필수적인 Ca2+결합부위
를 공격하여 본 실험의 결과에서 나타난 것과 같이 N-cadherin을 분해시킬 뿐만 아니라 이러한 단백질 분해효소의 활성으로 세포막에 존재하는 단백질들을 분해 시킴으로써 세포사멸에 영향을 줄 수 있을 것이라는 가능성을 생각할 수 있다.
Padilla등은 sciatic nerve를 neurotomy하여 일어나는 wallerian degeneration과정 중 myelin fibre의 Schwann cell에서 N-cadherin mRNA의 발 현이 증가되었고,이러한 효과는 neurotomy후 9일까지 지속되다가 21일 이후에 는 발현이 감소하였음을 보고하였다(Padilla등, 1999). 이러한 보고를 통해 N-cadherin은 neurodegeneration동안 schwann cell과 같은 신경교세포에서의 발현과 분포에 영향을 주는 것으로 생각되었으며 N-cadherin이 신경세포의 재생 에도 연관되어 있음을 추측할 수 있었다. CHL1은 신경세포뿐만 아니라 일부 신경교세포에서 발현되는 것으로 알려 져 있으며(Rolf등,2003) 신경세포의 재생기능에 관여하고 있음이 보고되었다 (Chaisuksunt등,2003).본 실험에서 사용한 동물실험 모델에서 척수신경 결찰로 신경손상을 일으킨 후,CHL1은 신경손상이 일어나고 회복이 진행되는 시기(7일) 부터 손상이 회복된 시기(21일)까지 발현의 증가가 지속된 것으로 보아 CHL1은 신경손상시 신경세포의 재생이 진행되는 과정에서 발현량이 증가되는 것으로 추 정되었다.이와 관련하여 동물실험 모델에서 척수신경과 같은 말초신경계에서의 CHL1의 발현은 sciaticnerve손상이나 dorsalroot손상시에 증가하는데 이러한
손상을 받은 이후 재생반응이 일어나는 동안인 1～2주까지는 운동신경세포와 일 부 감각신경세포에서 CHL1과 axon의 생장에 관여하는 단백질인 GAP-43의 발 현이 증가하다가 재생반응이 완전히 끝난 5주에서는 CHL1의 발현이 정상수준으 로 감소한 것으로 보아 이러한 CHL1의 발현이 동물실험모델에서 말초신경계의 axon재생에 있어 CHL1의 발현이 중요한 역할을 할 것으로 제시되었다(ZhangY 등,2000).또한 흰 쥐의 sciaticnerve의 일부를 성숙한 흰쥐의 시상(thalamus)으 로 이식한 결과 TRN(thalamicreticularnucleus)의 신경세포에서 재생능력을 보 였으며,이러한 재생능력을 보인 신경세포에서 CHL1의 발현이 증가되었음이 보 고되었는데(Chaisuksunt등,2000)이는 CHL1이 말초신경뿐만 아니라 중추신경 계의 신경세포 재생에도 관련이 있음을 시사하고 있다.배양 세포를 이용한 실험 에서 CHL1은 순수신경세포에서 TNF-α에 의해 발현이 증가되었는데 이는 염증 이 일어난 세포에 있어 재생을 촉진시키기 위하여 그 발현이 증가하는 것으로 생각된다.
L1 mRNA는 NMDA에 대해 발현이 감소하였는데,이는 neuropsin이라는 serineprotease의 작용과 관련되어 보고된 바 있다.L1의 활성화는 neuropsin의 전구체를 활성화 시키는 작용을 통해 neuropsin을 활성화 시킨다.활성화된 neuropsin은 N-cadherin,laminin과 같은 다른 기질과는 반응하지 않고 오직 L1 에만 반응성을 보이며 L1의 특이적인 부위를 자르게 되는데 이러한 neuropsin에 의해 특이적으로 분해되는 L1의 작용기전이 NMDA 수용체와 관련되어 일어남 으로써 synaptic plastivity조절에 관여된다고 보고되었다(Matsumoto-Miyai등, 2003).또한 L1mRNA가 염증을 유발하는 cytokine이나 LPS에 의해서는 발현의 변화가 일어나지 않은 반면,신경세포 사멸을 일으키는 NMDA에 의해서만 발현 이 감소한 것으로 보아 L1은 구조가 유사한 CHL1에 비해 자극에 대한 감수성이 떨어지며 이들은 구조만 유사할 뿐 발현이 조절되는 기전은 다르다는 것을 추측 할 수 있었다.이와 관련하여 L1과 CHL1은 모두 neurite의 생장을 촉진하는데 관여하는데 L1은 Schwann cell과 같은 세포에서 homophilic 또는 heterophilic interction을 통해 2차 전달자를 매개로 하여 neurite의 생장을 촉진하는 것으로
보여지는 반면(Dohery 등, 1996; Heiland 등, 1998) CHL1은 heterophilic interaction을 통해서 L1보다 훨씬 더 강력하게 neurite의 생장을 촉진하는 효과 를 나타낸다(Hillenbrand등,1999)는 보고가 있다. 본 연구는 신경계의 재생과 퇴화과정에서 중요한 작용을 할 것으로 생각되 는 신경세포에서의 세포부착분자들의 발현변화를 밝힘으로써 이러한 신경계의 퇴화와 재생과 관련되어 세포부착분자들의 기능과 역할을 알아보고 이를 바탕으 로 신경계의 재생방안을 찾고자 하는데 의의가 있다.특히 N-cadherin은 calcium 과 연관되어 일어나는 구조적 변형이 신경세포의 생존과 사멸에 영향을 미치는 것으로 추측되고 일부 신경계의 재생과도 관련이 있을 것으로 생각되므로 N-cadherin과 calcium간의 연관성을 알아보아야 할 것이다.또한 신경계의 재생 과 신경세포 생존에 있어 중요한 기능을 담당한다고 보고되어진 L1과 NCAM을 비롯하여 각 세포부착분자들의 명확한 기능을 파악하고 이러한 기능을 조절하는 기전을 밝힘으로써 세포부착분자들이 신경계의 퇴행과 재생에 있어 어떠한 연관 이 있는지를 알아보아야 할 것이다.
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결
결 론
론
론
신경계에서 신경손상에 따른 세포부착분자의 발현변화 양상을 ICAM-1, N-cadherin,CHL1,L1,NCAM을 중심으로 확인하였다.실험결과 각 세포부착분 자는 세포마다 특이적으로 발현되었으며,손상자극에 따라 그 변화양상이 다르게 나타났다. ICAM-1은 성상세포와 미세아교세포에서 특이적으로 발현되었으며 특히 염 증유발인자인 cytokine류나 LPS에 의해 ICAM-1의 mRNA 발현이 증가되었다. 실험동물모델에서도 ICAM-1mRNA 발현은 척수신경결찰에 의해서 증가되었다.N-cadherin은 성상세포와 신경세포에서 발현되었으며 순수신경세포에서 NMDA는 농도의존적으로 N-cadherin의 mRNA와 단백질 발현을 감소시켰다.혼 합신경세포에서는 NMDA,TNF-α와 LPS 에 의해 N-cadherin mRNA 발현이 감소되었다. CHL1은 신경교세포와 신경세포에서 모두 발현되었으며 순수신경세포에서 는 TNF-α에 의해 CHL1의 mRNA 발현을 증가되었으나,NMDA에 의해서는 감소되었다.실험동물모델에서는 척수신경결찰에 의해 CHL1의 발현이 증가되었 다. L1은 신경세포에서만 특이적으로 발현되었으며,특히 NMDA는 L1mRNA 발현을 감소시켰고,NCAM은 성상세포와 신경세포에서 발현되었으나 자극에 대 한 뚜렷한 변화양상은 보이지 않았다. 이를 통해 세포부착분자들은 신경계를 이루는 세포마다 발현되는 종류나 양상이 다르다는 것을 알 수 있었다.이러한 세포부착분자들 중에서 ICAM-1은 신경교세포에서 발현되어 염증반응을 조절하는데 있어 중요한 매개체로 작용하 할 것으로 추측되었고,CHL1은 신경교세포와 신경세포에서 발현되어 염증반응과 관련된 신경퇴행과 재생과정에 있어 중요한 역할을 할 것이라 생각된다. N-cadherin은 성상세포와 신경세포에서 발현되고,L1은 신경세포에서만 특이적 으로 발현되는데 이들은 신경 퇴행성질병에서 나타나는 신경세포의 사멸에 중요
한 역할을 할 것이라 생각된다. 특히 N-cadherin은 일반적으로 synaptic plasticity를 조절하는데 있어 중요한 작용을 한다고 알려져 있는데 본 연구에서 나타난 NMDA 수용체 자극에 따른 N-cadherin의 발현변화는 이러한 synaptic plasticity를 조절함에 있어 N-cadherin과 복합체를 이루고 있는 NMDA 수용체 와 다른 cytoskeletalprotein과 연관되어 신경세포의 생존과 사멸에 까지 영향을 미칠 가능성을 제시해 주고 있다.
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-ABSTRACT-
Differential Expression of Cell Adhesion Molecules by Neuronal Injury.
You-Na Jang
Department of Medical Sciences The Graduate School, Ajou University
(Supervised by Professor Eun-Joo Baik)
Cell adhesion molecules(CAMs) are expressed in glial cells and neurons play critical roles in development and maintenance of nervous system. CAMs are reported that may be key molecular determinants in the response of the nervous system to injury. Therefore we are thought to that the expression of these CAMs is associated with neurodegenerative disease by neuronal injury. In this study, we investigated the expression of CAMs is changed by neuronal injury and what types of CAMs are expressed in glial cells and neurons.
We used a neurodegeneration model, spinal nerve ligation, in vivo, and cultured cells treated with the change of CAMs expression by RT-PCR and western blotting analysis. In nervous system, ICAM-1 mRNA was expressed in astrocytes and microglia. NCAM mRNA was expressed in astrocytes as well as neurons and CHL1 mRNA is
expressed in astrocytes, microglia and neurons. And L1 mRNA was expressed in neurons.
As the result of the expression of altered CAMs mRNA against to injuries, ICAM-1 mRNA expression was increased by TNF-α, IL-1β and LPS in astrocytes. In microglia, ICAM-1 mRNA expression was increased by LPS. In vivo, ICAM-1 mRNA expression significantly increased by spinal nerve ligation.
N-cadherin mRNA expression was significantly reduced by NMDA in pure cortical neurons and mixed cortical neurons with glial cells. Especially, in pure cortical neurons, NMDA reduced N-cadherin in dose dependent manner, and NMDA receptor antagonist MK-801 is restored NMDA-induced reducing of N-cadherin expression at the mRNA and protein level.
CHL1 mRNA expression was increased by TNF-α in pure cortical neurons. And in vivo, CHL1 mRNA expression significantly increased by spinal nerve ligation.
L1 mRNA expression was reduced by NMDA in mixed cortical neurons with glial cells and NCAM mRNA expression was not changed definitely by TNF-α, IL-1β and NMDA.
Taken together, our data show that the type of CAMs expressed in nervous system differed in every cells. Among the CAMs, ICAM-1 expressed only glial cells and was associated with regulation of inflammatory response. Also, CHL1 expressed in glial cells and neurons. We suggest that CHL1 play role in neuronal regeneration and degeneration associated with inflammatory response. Finally, we suggest that L1 expressed in neurons and N-cadherin expressed in astrocyte and neurons may be
associated with neuronal survival as well as neuronal death.
Key words : cell adhesion molecules(CAMs), ICAM-1, CHL1, L1, N-cadherin, NCAM, neuron, astrocyte, microgila
