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목목목적적적 :환경 독성 물질인 카드뮴이 뇌졸중을 포함한 각종 뇌질환의 발병율을 증 가시킨다는 역학적인 조사는 이미 보고 된바 있으나 아직 그 작용기전에 대해서 는 잘 알려져 있지 않다.본 연구실에서는 이미 카드뮴이 뇌혈관 내피세포에서 염증인자 생성에 미치는 영향에 대한 관찰을 통해 cyclooxygenase (COX-2)의 발현과 prostaglandins(PGs)의 생성이 증가됨을 확인한 바 있다.뇌졸중의 발병 요인 중 하나가 세포부착분자의 기능 장애이며,이러한 세포부착분자 발현의 조 절 인자 중 대표적인 것이 prostaglandinE2(PGE2)이다.본 연구에서는 카드뮴에 의해 유도되는 뇌 손상의 발현기전을 규명하기 위한 연구의 일환으로 카드뮴 에 노출된 뇌혈관 내피세포의 intercellularadhesion molecule-1(ICAM-1)발현 에 있어 COX-2의 역할을 규명하고자 하였다.
재재재료료료 및및및 방방방법법법 :American TypeCultureCollection (USA)에서 구입한 생쥐 뇌 혈관 내피세포주인 bEnd.3 세포에 카드뮴 처리 후 PGE2 생성을 확인하고자
enzyme-linked immunoassay (EIA)를 수행하였고,PGE2 생성과 세포부착분자
발현의 상관관계를 밝히고자 COX 저해제,PGE2그리고 카드뮴을 함께 처리하여
RT-PCR과 형광면역조직화학검사법으로 ICAM-1,VCAM-1,E-cadherin그리고 VE-cadherin의 발현 양상을 확인하였다.그리고 카드뮴에 의해 유도되는 백혈구 -내피세포 부착에서 대한 COX 저해제와 PGE2의 영향을 알아보고자 monocyte
adhesionassay를 수행하였다.
결결결과과과 :bEnd.3에서 카드뮴 처리 후 증가된 PGE2생성이 COX 저해제에 의해 억
다.그리고 E-cadherin의 발현은 감소시켰으며 VCAM-1과 VE-cadherin은 발현 양상에 변화를 보이지 않았다.또 카드뮴에 의해 유도된 ICAM-1의 발현은 COX 저해제에 의해 감소되었으며,이러한 COX 저해제의 작용은 PGE2에 의해 차단되 어짐을 확인하였다.한편 카드뮴에 노출된 bEnd.3에서 감소된 E-cadherin의 경 우 COX 저해제에 의해 회복되었으며 이는 역시 PGE2에 의해 다시 저해됨을 확 인하였다.또한 카드뮴 처리에 의해 증가된 백혈구-내피세포 부착은 COX 저해 제에 의해 억제되었으며,PGE2처리시 다시 증가됨을 확인하였다. 결결결론론론 :본 연구의 결과들은 카드뮴에 의한 세포부착분자 발현이 PGE2생성을 매 개로 하고 있을 가능성을 제시하고 있다.
핵심되는 말 : Cadmium(Cd), Cyclooxygenase-2(COX-2), Prostaglandin E2(PGE2), Intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1), Brain microvascular
차
차
차 례
례
례
국문요약 ···i 차례 ···ⅲ 그림차례 ···ⅴ 약어 ···ⅵ Ⅰ.서론 ···1 Ⅱ.재료 및 방법 ···4 A.시약 및 실험기기 ···4 1.시약 및 재료 ···4 2.실험 기기 및 기구 ···4 B.연구 방법 ···5 1.세포 배양 ···5 2.세포의 처리 ···5 3.ProstaglandinE2정량 ···5 4.TotalRNA분리 ···55.RT-PCR (Reversetranscription-polymerasechainreaction)···6
6.형광면역조직화학검사법 ···8
7.백혈구-내피세포 부착 시험 (Leukocyte-endothelialcelladhesion assay)···8 8.통계처리 ···8 Ⅲ.결과 ···9 A.카드뮴이 뇌혈관 내피세포의 시간에 따른 부착분자 발현에 미치는 영향 ···9 B.카드뮴이 뇌혈관 내피세포의 PGE2생성에 미치는 영향 ···9 C.카드뮴이 뇌혈관 내피세포의 부착분자 발현에 미치는 영향 ···9 D.PGE2가 뇌혈관 내피세포의 부착분자 발현에 미치는 영향 ···9
E.COX 저해제와 PGE2가 카드뮴에 의해 유도되는 백혈구-내피세포의 부착에 미치는 영향 ···13 Ⅳ.고찰 ···19 Ⅴ.결론 ···23 참고문헌 ···24 영문요약 ···30
그
그
그림
림
림 차
차
차례
례
례
Fig.1.Effectsofcadmium onICAM-1expressioninbEnd.3cell···10 Fig.2.EffectsofCOX inhibitorsoncadmium-inducedPGE2productionin
bEnd.3cells···11 Fig.3.Cadmium-inducedadhesionmoleculeexpressioninbEnd.3cells···12 Fig.4.EffectsofCOX inhibitorsonmRNA expressionofadhesionmolecule inbEnd.3cellstreatedwithcadmium···15 Fig.5.EffectsofCOX inhibitorsonproteinexpressionofadhesionmolecule inbEnd.3cellstreatedwithcadmium···17 Fig.6.EffectsofCOX inhibitorsoncadmium-inducedleukocyte-adhesionto bEnd.3cells···18
약
약
약 어
어
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AA :arachidonicacid BBB :blood-brainbarrier Cd:cadmium
CD :clusterofdifferentiationantigens CLSM :confocallaserscanningmicroscopy COX-2:cyclooxygenase-2
DEPC :diethylpyrocarbonate E-cadherin:epithelialcadherin EIA :enzyme-linkedimmunoassay FITC :fluoresceinisothiocyanate
GAPDH:glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase ICAM-1:intercellularadhesionmolecule1
IL-1β :interleukin-1β
LFA-1:lymphocytefunction-associatedantigen1 LPS :lipopolysaccharide
MAC-1:macrophageadhesionmolecule1 NF-kB :nuclearfactorkappa-B
NO :nitricoxide PGs:prostaglandins
RT-PCR :reversetranscription-polymerasechainreaction ROS :reactiveoxygenspecies
PGE2:prostaglandinE2
TNF-α :Tumournecrosisfactor-α
VCAM-1:vascularcelladhesionmolecule1 VE-cadherin:vascularendothelialcadherin
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ.
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.서
서
서 론
론
론
뇌혈관 장벽은 척추동물의 뇌조직과 혈액 사이에 있는 장벽으로 이온 (ions),아미노산 (aminoacids),펩티드 (peptide),단백질 (protein)등의 용해성 인자와 세포간의 교환을 제한함으로써 뇌조직의 항상성을 유지하는데 중요한 역 할을 한다.뇌혈관 장벽은 뇌혈관 내피세포,성상세포 (astrocytes),대식세포 (macrophage)그리고 미세아교세포 (microglia)로 구성되며,구조적으로는 세포 간에 tightjunction으로 연결되어 있어(Dietrich,2002),체내의 신경 전달물질 (neurotransmitter)과 호르몬 (hormone)또는 유해한 물질의 뇌내 이입을 막아 준다(Minagar와 Alexander,2003).
뇌혈관 장벽을 구성하고 있는 주된 세포인 뇌혈관 내피세포는(Brightman, 1989)혈관의 손상에 관여하여 다양한 염증 인자,reactive oxygen species (ROS)그리고 nitricoxide(NO)를 생성하게 되는데(Merrill와 Murphy,1997),이 로 인해 부착분자의 발현 증가와 함께 혈관으로의 투과도가 증가되면서 뇌혈관 장벽 기능이 저하된다(Dietrich,2002;Gennari등,2003;Ramirez와 Gimenez, 2003). 뇌졸중은 뇌의 급격한 순환장애에 의하여 일어나는 뇌혈관 장애로써 뇌혈 관이 혈전이나 색전에 의해 막히는 경우인 뇌경색,고혈압이나 뇌동맥류의 파열 로 뇌 속이나 뇌를 싸고 있는 지주막 밑에 피가 고이는 경우인 두개내출혈 그리 고 고혈압성뇌증으로 구분되어진다.뇌줄중이 발병되는 요인은 뇌혈관에서의 cytokine의 변화,염증 반응 매개 인자의 변화 그리고 세포부착분자의 붕괴 등을 들 수 있고 이러한 기전을 통해 뇌혈관 장벽의 기능이 저하되며 뇌졸중과 같은 뇌질환을 일으키게 된다.(Feuerstein등,1998) 세포 사이의 상호작용에 관여하는 세포부착분자는 염증과 면역반응의 과정 에서 중요한 역할을 하고 있다(Staunton 등, 1988).세포부착분자는 4개의 glycoprotein superfamily(immunoglobulin superfamily, cadherin superfamily, integrin superfamily,selectin superfamily)가 있는데,염증 반응에 주로 관여하
는 immunoglobulin superfamily (IgSF)중 Intercellular adhesion molecules (ICAM-1:CD54)은 lympocyte의 기능과 관련된 antigen-1(LFA-1),Mac-1그 리고 CD43의 ligand로 백혈구 세포 (leukocytes)(vandeStolpe와 vanderSaag, 1996),외피 세포 (epithelials), 내피 세포 (endothelials) 그리고 섬유아세포 (fibroblasts)(Dippold 등,1993)등에서 발현되어지는 celladhesion glycoprotein 이다.또한 세포와 세포 (cell-cell)또는 세포-기질 (cell-matrix)의 결합을 매개 하는 다양한 단백질로 이루어져 있으며 세포 밖으로 5개의 Ig와 같은 도메인을 가지고 있다(Bella와 Rossmann,1999).
이러한 ICAM-1은 VCAM-1,E-seletin과 함께 cytokine,호르몬,스트레스 (stress)그리고 감염 (infections)과 같은 염증 인자에 의해 발현이 조절되며,특 히 뇌혈관 장벽을 구성하는 주된 세포인 뇌혈관 내피세포에서의 발현은 뇌질환 발현 과정에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Dietrich,2002;Zhang F 등,2002).
Cadherin은 칼슘 의존적인 세포부착분자의 cadherin superfamily중 하나로 서 상피 세포등 대부분의 세포에서 발현되는 E-cadherin,신경과 근육 그리고 수 정체 세포에 있는 N-cadherin 그리고 태반과 세포성 외피에 있는 P-cadherin으 로 구별된다(Damsky 등,1983).이 중 E-cadherin은 세포내 actin cytoskeleton 과 결합한 형태로 존재하며 상피 세포의 양극성과 장벽의 기능을 생성하고 유지 하는데 중요한 역할을 하고 있다.E-cadherin은 뇌혈관 장벽에서 유일하게 뇌혈 관 내피세포에서 발현되어진다고 보고된 바 있고(Rubin 등,1991a,b),뇌혈관 장 벽의 paracellular한 통로를 조절한다고 한다.또한 카드뮴은 E-cadherin 결합을 저해하며(Prozialeck,2000)카드뮴에 노출된 생쥐의 폐에서 E-cadherin의 발현이 감소되었다고 보고된 바 있다(Heimark등,1990;Lampugnani등,1992;Fenyves 등,1993;Dejana 등,1995;Caveda 등,1996;Hordijk 등,1999;Corada 등, 2001).
VE-cadherin은 cadherin-5로 알려져 있으며 E-cadherin과 비슷한 기능을 갖고 있으므로 VE-cadherin의 손실은 곧 내피 세포벽의 투과성을 증가시키는 것
과 같다(Caveda등,1996).
환경독성물질이며 다양한 세포 독성을 가지고 있는(Jamall와 Smith,1985)
카드뮴 (Cd)은 산업적 그리고 환경적인 오염물로써 폐 (lung),간 (liver),신장 (kidney)등의 다양한 조직에 영향을 줄 뿐만 아니라(Brightman,1989)기형의 발 생과 발암성 물질을 생성하기도 한다(DegraeveN,1981).그리고 뇌혈관 장벽에 축적이 되어 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에 변화를 일으키고 칼슘 (Ca)의존적 인 세포 부착 분자에서 세포와 세포간의 결합 (cell-celljunction)을 파괴시켜 tightjunction에 영향을 줌으로써 뇌혈관 장벽의 기능 부전을 초래시키는 것으로 알려져 있다.카드뮴 노출은 파킨슨 병 (Parkinson's disease) 및(Okuda 등, 1997)뇌졸중 (stroke)의 발현과 관련이 있는 것으로 알려져 있지만 역학적인 조 사 보고 이외에(Elliott등,2000)그 작용기전에 대해서는 아직 잘 알려져 있지 않다.최근 본 연구실에서는 뇌혈관 내피세포에서 카드뮴이 NF-κB를 경유하여
ICAM-1발현을 유도함을 보고한 바 있으며(Jeong EM 등,2004)COX-2발현 유도를 통해 염증인자인 PGE2생성을 촉진함을 관찰한 바 있다.뇌졸중의 발병
요인 중 하나가 세포부착분자의 기능 장애이며,이러한 세포부착분자 발현의 조 절 인자 중 대표적인 것이 prostaglandinE2(PGE2)이다.본 연구에서는 카드뮴
에 의해 유도되는 뇌 손상의 발현기전을 규명하기 위한 연구의 일환으로 카드뮴 에 노출된 뇌혈관 내피세포의 intercellularadhesion molecule-1(ICAM-1)발현 에 있어 COX-2의 역할을 규명하고자 하였다.
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AAA...시시시약약약 및및및 실실실험험험 기기기기기기 111...시시시약약약 및및및 재재재료료료
Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)는 JBI(Seoul,Korea)에서 fetal bovine serum은 Hyclon(Logan, UT, USA), penicillin-streptomycin, 0.25% trypsin-EDTA는 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA), cadmium chloride(CdCl2)는 Sigma(St. Louis, MO, USA), EIA에서 사용한 tracer는
CaymanChemical(AnnArbor,MI,USA)에서 구입하였다.TotalRNA분리에 사 용된 easy BLUER는 iNtRON(Seoul,Korea),RT-PCR에 사용한 AMV reverse transcriptase는 Roche(Pittsburgh,PA,Germany)에서,PCR에 사용한 Perfect PreMixR는 TaKaRa(Seoul,Korea),i-StarMastermixPCR kit는 iNtRON(Seoul,
Korea), GAPDH, ICAM-1, VCAM-1그리고 VE-cadherin oligo primer는 Bioneer(Seoul,Korea)에서 제작,구입하였다.형광면역조직화학검사법을 위한 ICAM-1 rabbit polycolonalIgG는 Santa Cruz Biotechnology(Deleware,CA, USA),FITC-labeledanti-rabbitIgG antibody는 MolecularProbes(Eugene,OR, USA),FITC mouse anti-E-cadherin MAb는 BD bioscience(SanDiego,CA, USA),Hoechst33258은 Sigma(St.Louis,MO,USA)에서,Adhesion assay에서 사용된 CellTrackerTM OrangeCMTMR은 MolecularProbes(Eugene,OR,USA), mountingsoultion은 VECTA Shield(Burlingame,CA,USA)에서 구입하였다.
222...실실실험험험 기기기기기기 및및및 기기기구구구
RNA 추출 후 total RNA의 정량을 위해 분광 광도계(Amersham, Piscataway, NJ, USA)를, RT-PCR은 PCR machine 640(Perkin Elmer, Wellslay,MA,USA)을,단백질의 발현 양상과 백혈구-내피세포 부착을 확인은 Confocallaserscanning microscopy CLSM(Olympus,Tokyo,Japan)를 사용하
였고,이외에 세포 배양에는 water-Jacketed CO2 Incubator(NAPCO 6101-1,
Winchester,VA,USA),cleanbench(Sam Ki,Seoul,Korea)를 사용하였다. BBB...연연연구구구 방방방법법법
111...세세세포포포배배배양양양
bEnd.3(CRL-2299)는 Amercan Type Culture Collection(ATCC)에서 구입 하여 4.5g/L의 glucose와 1.5g/L의 sodium bicarbonate가 포함된 DMEM에 10% FBS,1% penicilline-streptomycin(100unit/ml-100μg/ml)이 첨가된 배지로 5% CO2,95% air,37℃ 조건의 세포배양기에서 배양하였다.
222...세세세포포포의의의 처처처리리리
세포는 70～80%의 confluent가 되도록 배양한 뒤 실험에 이용하였다.선행 연구에서 세포 생존율,cyclooxygenase-2(COX-2)의 발현,prostaglandins(PGs) 생성에 미치는 영향을 농도 별로 확인하였으며,그 결과를 바탕으로 본 연구에서 는 카드뮴의 처리 농도를 2μM로 하였다.
333...PPPrrrooosssttataaggglllaaannndddiiinnnEEE222(((PPPGGGEEE222)))정정정량량량
일정 시간 동안 세포를 배양한 후 배지의 상층액(sup)를 취하여 생성된 PGE2의 양을 Enzyme-linked immunoassay(EIA)방법으로 측정하였다.EIA는
다음과 같은 방법으로 시행하였다.Plate에 PGE2 antibody를 붙인 후 PGE2
acetylcholinesteraseEIA tracer를 well당 50μl씩 가하고 측정하고자 하는 시료를 넣었다.4℃에서 12시간 또는 실온에서 4시간 반응시키고,Ellman's reagent를 150μl씩 가하여 발색하였으며,totalbinding값이 0.6～0.7정도가 되었을 때 405nm 에서 흡광도를 측정하였고,PGE2양을 작성된 표준 곡선으로부터 산출하였다.
TotalRNA는 easy BLUER RNA isolation kit을 사용하여 분리하였다.60
∅ plate에 배양한 세포를 1×PBS로 2번 씻어내고 easy BLUE 800μl씩을 가하여 세포 균질액을 얻었다.Microtube에 세포 균질액을 옮긴 후 chloroform을 각각의 microtube에 200μl씩 넣고 10～20초 동안 잘 섞어주었다.14,000rpm,4℃에서 20 분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 새 microtube에 400μl씩 옮겨 담은 뒤 isopropanol을 400μl을 가하고 5～6차례 tube를 inversion하여 혼합한 후 5～10초 간 실온에서 잘 섞어주었다.섞어준 tube를 실온에서 13,000rpm,5분간 원심분리 하여 얻은 RNA pellet에 70% EtOH를 400μl를 가하여 혼합한뒤 실온에서 13,000rpm,2분간 원심분리하여 RNA pellet을 상온에서 약 20분간 건조시켰다. RNA pellet을 30μl의 DEPC water에 녹인 후 분광광도계를 이용하여 260nm에서 totalRNA 양을 측정하였고,280nm에서 측정한 값을 비교하여 순도를 측정하였 다.
555...RRRTTT---PPPCCRCRR (((RRReeevvveeerrrssseeetttrrraaannnsscsccrrriiippptttiiiooonnn---pppooolllyyymmmeeerrraaassseeecchchhaaaiiinnnrrreeeaaaccctttiiiooonnn)))
5
×
Reaction buffer 4μl/sample,Random primer p(dN)6 2μl/sample, Deoxynucleotide Mix 2μl/sample, RNase inhibitor 1μl/sample, AMV reverse-transcriptase0.3μl/sample,RNA sample1μg을 넣은 후 DEPC water로 totalvolume이 20μl가 되도록 맞춘 뒤 PCR machine640에서 25℃에서 10분,4 2℃에서 60분,97℃에서 5분을 1cycle로 하여 cDNA를 얻었다.얻은 cDNA 2μl, primerupstream 0.3μl,primerdownstream 0.3μl,DEPC water7.4μl를 Perfect PreMixR에 혼합하였다.한편 ICAM-1의 경우에는 cDNA 2μl,primerupstream0.3μl, primer downstream 0.3μl, i-StarMaster Mix Solution 17.4μl를 i-StarMastermixR PCR kit에 혼합하였다.각 시료에 대해 다음의 조건하에서 PCR을 행하여 ICAM-1,VCAM-1,E-cadherin그리고 VE-cadherinmRNA발현 양상을 알아보았다.
ICAM-1primer Sense:5'-GTCTGCTGAGACCCCTCTTG-3' Antisense:5'-GAAGGTGGTTCTTCTGAGCG-3' VCAM-1 Sense:5'-GTGAACCTGACCTGCTCAAG-3' Antisense:5'-CTCCACCAGACTGTACGATC-3' E-cadherinprimer
Sense:5'-CGTGATGAAGGTCTCAGCC-3' Antisense:5'-ATGGGGGCTTCATTCAC-3' VE-cadherinprimer
Sense:5'-TTGCCCAGCCTACGAACCTAAAG-3' Antisense:5'-ACCACCGCCCTCCTCATCGTAAGT-3' GAPDH Sense:5'-GTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTT-3' Antisense:5'-CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3' reactioncycle ICAM-1:92℃ 1분,58.3℃ 1분,72C℃ 1분 -30cycle VCAM-1:94℃ 1분,50.3℃ 1분,72℃ 1분 -28cycle E-cadherin:94℃ 15초,52.5℃ 15초,72℃ 30초 -30cycle VE-cadherin:92℃ 1분,60.4℃ 1분,72℃ 1분 -34cycle GAPDH :94℃ 30초,60℃ 1분,72℃ 1분 30초 -25cycle
666...형형형광광광면면면역역역조조조직직직화화화학학학검검검사사사법법법
ICAM-1과 E-cadherin의 단백질 발현을 형광면역조직화학검사법을 이용하 여 측정하였다.Coverglass가 놓인 24well에 세포를 배양하고 카드뮴,COX 저 해제 그리고 PGE2를 처리하였으며, 1×HCSS로 씻어낸 후에 4%
paraformaldehyde로 고정하였다.일차 항체 ICAM-1,E-cadherin (1:500)을 실온 에서 4시간 동안 반응시킨 후,1×HCSS로 씻어내고 FITC가 표지된 이차 항체 (1:500)를 차광한 상태로 실온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다.동일한 조건하에 Hoechst33258로 5분간 염색한 다음 다시 1×HCSS로 씻어내고 VECTA ShieldR(Vector laboratories, Burlingame,CA,USA)로 mounting하여 slide
glass에 고정시키고 confocallaserscanningmicroscopyCLSM을 이용하여 형광 염색된 ICAM-1과 E-cadherin의 발현 양상을 확인하였다.
777...백백백혈혈혈구구구---내내내피피피세세세포포포 부부부착착착시시시험험험(((LLLeeeuuukkkooocccyyyttteee---eeennnddodoottthhheeellliiiaaalllccceeellllllaaadddhhheeesssiiiooonnnaaassssssaaayyy))) COX 저해제와 PGE2가 카드뮴에 의해 유도되는 백혈구-내피세포의 부착
정도를 확인하고자 coverglass가 놓인 24well에 bEnd.3세포를 배양하였고,카 드뮴,COX 저해제 그리고 PGE2를 처리하였다.Human monocyte cellline인
U937에 cellTrackerTM OrangeCMTMR로 30분동안 세포 배양기에서 표지한 다 음 500μl(1×106cells/well)씩 bEnd.3가 배양된 coverglass위에 뿌렸으며,약 1시
간동안 세포 배양기에서 부착시킨 후 1×PBS로 씻어내고 VECTA Shield로 mounting하여 slide glass에 고정시켰으며 confocallaserscanning microscopy CLSM를 이용하여 부착 정도를 확인하였다.
888...통통통계계계처처처리리리
모든 자료는 평균 ±S.E.M으로 나타내었고 student'st-test로 통계처리 하 여 p< 0.05수준에서 유의성을 검증하였다.
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ.
.
.결
결
결과
과
과
AAA...카카카드드드뮴뮴뮴이이이 뇌뇌뇌혈혈혈관관관 내내내피피피세세세포포포의의의 시시시간간간에에에 따따따른른른 부부부착착착분분분자자자 발발발현현현에에에 미미미치치치는는는 영영영향향향 카드뮴이 뇌혈관 내피세포의 부착분자 발현에 미치는 영향을 알아보고자 시간별로 카드뮴을 처리하였다.30분,1시간,4시간,8시간 후의 mRNA level을 RT-PCR을 통하여 측정하였으며,그 결과 카드뮴에 의한 ICAM-1의 발현이 시 간 경과에 따라 증가하고 4시간째에 가장 많이 발현됨을 확인하였다(Fig.1). BBB...카카카드드드뮴뮴뮴이이이 뇌뇌뇌혈혈혈관관관 내내내피피피세세세포포포의의의 PPPGGGEEE222생생생성성성에에에 미미미치치치는는는 영영영향향향 COX 저해제가 카드뮴 유도 PGE2 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해 COX 저해제를 30분간 전처리 후 카드뮴 2μM을 처리하고 24시간 후 PGE2생성을 EIA를 통하여 측정한 결과 카드뮴에 의해 증가된 PGE2의 생성이 COX 저해
제에 의해 유의적으로 감소하였다(Fig.2). CCC...카카카드드드뮴뮴뮴이이 뇌이 뇌뇌혈혈혈관관관 내내내피피피세세세포포의포의의 부부부착착착분분분자자자 발발발현현현에에에 미미미치치치는는는 영영영향향향 카드뮴 유도 뇌혈관 내피세포의 부착분자 발현에 있어서 COX의 관여 가능 성을 확인하고자 COX 저해제를 30분간 전처리 후 카드뮴을 처리하여 4시간 후 의 mRNA level을 RT-PCR을 통하여 측정하였다.그 결과 카드뮴에 의해 증가 되는 ICAM-1의 발현이 COX 저해제에 의해 억제됨을 확인하였고 카드뮴에 의 해 감소되는 E-cadherin의 경우 COX 저해제에 의해 발현이 증가됨을 확인하였 다(Fig.3).그러나 이 두 가지의 부착분자 발현 양상에 유의성은 확인할 수 없었 다. DDD...PPPGGGEEE222가가가 뇌뇌뇌혈혈혈관관관 내내내피피피세세세포포포의의의 부부부착착착분분분자자자 발발발현현현에에에 미미미치치치는는는 영영영향향향 111... mmmRRRNNNAAA llleeevvveeelll에에에 미미치미치치는는는 영영영향향향
A) GAPDH ICAM-1 CTL Cd CTL Cd CTL Cd CTL Cd 30min 1h 4h 8h B) 3 0 m i n 1 h 4 h 8 h % o f C T L 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 C T L C d ( 2 u M ) FFFiiiggg...111...EEEffffffeeeccctttsss ooofff cccaaadddmmmiiiuuummm ooonnn IIICCCAAAMM-M--111 eeexxxppprrreeessssssiiiooonnn iiinnn bbbEEEnnnddd...33 c3 cceeellllllsss... bEnd.3 cellsweretreatedwith CdCl2(2μM).Cellswereincubatedforfurther
30min,1h,4h,8h and the levels ofICAM-1 mRNA were determined by RT-PCR(A)anddensitometry(B)asdescribedinMaterialsandMethod.
C T L A S A IN D O K E T O N S 3 9 8 P G E 2 (n g /m g p ro te in ) 0 1 2 3 4 5 C d (2 u M ) * * * * * * * * * FFFiiiggg...222...EEfEfffffeeeccctttsss ooofffCCCOOOXXX iiinnnhhhiiibbbiiitttooorrrsss oononn cccaaadddmmmiiiuuummm---iiinnnddduuuccceeeddd PPPrrrooossstttaaaggglllaaannndddiiinnn EEE222(((PPPGGGEEE222)))ppprrroooddduuuccctttiiiooonnn iiinnn bbbEEEnnnddd...33c3cceeellllllsss...bEnd.3 cellswerepreincubatedwith
aspirin(100μM),indomethacin(10μM),ketoprofen(10μM),NS398(10μM)for30min before CdCl2(2μM)treatmentand incubated forfurther24h.The amountof
PGE2wasmeasuredby enzymeimmunoassay(EIA)asdescribedin Materials
and Method.Dataareexpressed asmean ±S.E.M (n=4).*p <0.01vsCTL, **p< 0.01vsCd
A) C T L A S A IN D O K E T O N S 3 98 C d (2µΜ2µΜ2µΜ2µΜ) IC AM -1 E -ca d h e rin G AP D H B) IC A M -1 E -c a d h e rin m R N A /C T L 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 C T L C d (2 u M ) A S A (1 0 0 u M ) IN D O (1 0 u M ) K E T O (1 0 u M ) N S 3 9 8 (1 0 u M ) FFFiiiggg...333...CCCaaadddmmmiiiuuummm---iiinnnddduuuccceeedddaaadddhhheeesssiiiooonnn mmmooollleeecccuuullleeeeeexxpxpprrreeessssssiiiooonn iniinnn bbbEEEnnnddd...333ccceeellllllsss... bEnd.3 cells were preincubated with aspirin(100μM),indomethacin(10μM), ketoprofen(10μM),NS398(10μM)for30min beforeCdCl2(2μM)treatment.Cells
were incubated for further 4h and the levels ofICAM-1 and E-cadherin mRNA weredetermined by RT-PCR(A)anddensitometry(B)asdescribed in MaterialsandMethod.Dataareexpressedasmean±S.E.M (n=3).
PGE2가 뇌혈관 내피세포의 부착분자 발현에 미치는 영향을 알아보고자 COX 저 해제를 30분간 전처리 후 카드뮴과 PGE2를 동시처리한 뒤 4시간 후의 mRNA level을 RT-PCR을 통하여 측정하였다.그 결과 카드뮴에 의해 증가된 ICAM-1 의 발현이 COX 저해제에 의해 감소되었고 PGE2를 처리했을 때 다시 증가되었 으며 PGE2를 단독 처리한 경우에도 ICAM-1의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었 다.또한 카드뮴에 의해 감소된 E-cadherin의 발현은 COX 저해제에 의해 증가 되었고 PGE2를 처리하자 다시 감소함을 확인하였다.한편 VE-cadherin의 경우 에는 카드뮴 또는 PGE2에 의해 별다른 영향을 받지 않았다(Fig.4). 222...단단단백백백질질질 발발발현현현에에에 미미미치치치는는는 영영영향향향 PGE2가 뇌혈관 내피세포의 부착분자 발현에 미치는 영향을 알아보고자 COX 저해제를 30분간 전처리 후 카드뮴과 PGE2를 동시처리한 뒤 12시간 후의 단백질 발현 양상을 형광면역조직화학법을 통하여 확인하였다.그 결과 카드뮴에 의해 증가된 ICAM-1의 발현이 COX 저해제에 의해 감소되었고,이때 PGE2를
가해주었을 때 다시 회복됨을 확인하였다.카드뮴에 의해 감소된 E-cadherin의 발현 역시 COX 저해제에 의해 증가되었으며 PGE2를 넣어줬을 때 다시 감소함 을 확인하였다.(Fig.5). EEE...CCCOOXOXX 저저저해해해제제제와와 P와 PPGGGEEE222가가가 카카카드드드뮴뮴뮴에에에 의의의해해해 유유유도도되도되되는는는 백백백혈혈혈구구구---내내내피피피세세포세포포의의의 부부부착착착 에 에에 미미미치치치는는는 영영영향향향 COX 저해제와 PGE2가 카드뮴에 의해 유도되는 백혈구-내피세포의 부착에
미치는 영향을 알아보고자 confocallaser scanning microscopy를 이용하였다. U937을 Cell TrackerTM Orange CMTMR로 30분동안 표지한 다음 500μ l(1×106/well)를 배양된 bEnd.3위에 가하고 약 1시간동안 부착시킨 후 confocal
microscope 하에서 형광 측정을 함으로써 U937의 부착 정도를 확인하였다.그 결과 카드뮴에 의해 증가된 백혈구 세포의 부착이 COX 저해제에 의해 유의적으 로 감소됨을 보였고,다시 PGE2를 넣어줬을 때는 카드뮴 처리군 이상으로 증가
A)
ICAM-1
GAPDH
CTL INDO INDO+PGE2 NS398 NS+PGE2
Cd(2uM) VE-cadherin E-cadherin IC AM -1 G APDH C TL P GE2 B) I C A M - 1 E - c a d h e r i n V E - c a d h e r i n m R /N A /C T L 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 C T L C d ( 2 u M ) I n d o m e t h a c i n ( 1 0 u M ) I N D O + P G E 2 ( 1 u g / m l ) N S 3 9 8 ( 1 0 u M ) N S 3 9 8 + P G E 2 * * * * * FFFiiiggg...444...EEEffffffeeeccctttsss ooofff CCCOOOXXX iiinnnhhhiiibbbiiitttooorrrsss ooonnn mmmRRRNNNAAA eeexxxppprrreeesssssisiiooonnn ooofff aaadddhhheeesssiiiooonnn mmmooollleeeccucuullleee iiinnn bbbEEEnnnddd...333 ccceeellllllsss tttrrreeeaaattteeeddd wwwiiitththh cccaaadddmmmiiiuuummm... bEnd.3 cells were preincubatedwithindomethacin(10μM),NS398(10μM)for30minbeforeCdCl2(2
μM)andPGE2(1ng/ml)treatment.Cellswereincubatedforfurther4handthe
levels ofICAM-1,E-cadherin and VE-cadherin mRNA were determined by RT-PCR(A)anddensitometry(B)asdescribedinMaterialsandMethod.Data areexpressedasmean±S.E.M.*p< 0.05vsCTL,**p< 0.05vsCd(n=3)
A) I C A M -1 H o e c h s t M e r g e E -c a d h e r in H o e c h s t M e r g e CTL Cd INDO INDO+PGE2 NS398 NS398+PGE2
B) ICAM-1 E-cadherin Im m u n o fl u o re s c e n c e % o f C T L 0 50 100 150 200 250 CTL Cd(2uM) Indomethacin(10uM) INDO+PGE2(1ng/ml) NS398(10uM) NS398+PGE2 * ** ** ** ** * ** ** ** ** FFFiiiggg...555...EEEffffffeeeccctttsss ooofffCCCOOOXXX iiinnnhhhiiibbbiiitttooorrrsss ooonnn ppprrrooottteeeiiinnn eeexxxppprrreeessssssiiiooonnn ooofffaaadddhhheeesssiiiooonnn mmmooollleeeccucuullleee iiinnn bbbEEEnnnddd...333 ccceeellllllsss tttrrreeeaaattteeeddd wwwiiitththh cccaaadddmmmiiiuuummm... bEnd.3 cells were preincubatedwithindomethacin(10μM),NS398(10μM)for30minbeforeCdCl2(2
μM)and PGE2(1ng/ml)treatment.Cells were incubated forfurther12h and thelevelsofICAM-1andE-cadherinproteinweredeterminedby fluorescent intensity under confocalmicroscope as described in Materials and Method. (A)Confocal microscopic image and (B)fluorescent intensity. Data are expressed asmean ±S.E.M (n=5).* p < 0.01 vs CTL,** p < 0.01 vs Cd
A) C T L I N D O + P G E2 N S 3 9 8 + P G E2 N S 3 9 8 I N D O C d B) C T L I N D O I N D O + P G E 2 N S 3 9 8 N S 3 9 8 + P G E 2 Im m u n o fl u o re s c e n c e 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 C d ( 2 u M ) * * * * * * * * * FFFiiiggg... 666... EEEffffffeeeccctttsss ooofff CCCOOOXXX iiinnnhhhiiibbbiiitttooorrrss os oonnn cccaaadddmmimiiuuummm---iiinnnddduuuccceeeddd llleeeuuukkokoocccyyyttteee---aaadddhhheeesssiiiooonnn tttooo bbbEEEnnnddd...333 ccceeellllllsss...(A)bEnd.3 cells were preincubated with Indomethacin(10μM),NS398(10μM) for 30min before CdCl2(2μM) and
PGE2(1ng/ml)treatment.Cellswereincubated forfurther12h and thelevels
of leukocyte-adhesion determined by fluorescent intensity under confocal microscope as described in Materials and Method.(A)Confocalmicroscopic image and (B)fluorescent intensity.Data are expressed as mean ±S.E.M (n=5).*P < 0.01vsCd.
Ⅳ
Ⅳ
Ⅳ.
.
.고
고
고 찰
찰
찰
본 연구에서는 카드뮴이 뇌세포의 손상을 일으키는 작용기전을 세포간 결 합의 생성과 유지에 있어 중요한 역할을 하고 있는 세포부착분자 즉,ICAM-1, E-cadherin의 발현과 이에 대한 COX-PGE2pathway에 의한 조절 가능성을 중
심으로 알아보고자 하였다. 카드뮴에 노출 되었을 경우 세포간 결합 붕괴가 일어남은 물론 COX-2에 의한 PGE2의 생성이 증가(Fang등,2000)한다는 보고는 있으나 이 둘 간의 상호 연계성이나 세포부착분자와의 연관성은 밝혀진 바 없다.본 실험실에서도 이미 시행된 연구 결과에서 카드뮴이 COX-2발현을 증가시키고 PGE2생성을 증가시 키며,NF-κB 활성화를 통해 ICAM-1발현을 증가시키는 것을 확인하였으나 세 포부착분자와 COX-PGE2pathway와의 상호 연관성은 확인하지 못했다. 이번 연구로 카드뮴에 의해 생성된 PGE2가 COX 저해제에 의해 감소됨 (Fig.2)을 재확인 하였고,이 결과가 세포간 결합에 미치는 영향을 여러 세포부 착분자 (ICAM-1,VCAM-1,E-cadherin,VE-cadherin등)의 활성과 연관지어 살 펴보았다. 카드뮴은 산업적 부산물로 환경 중에 배출되어 다양한 병리증상을 유발하 는 대표적인 환경독성물질로서 폐(lung),간(liver),신장(kidney),뼈(bone),정소 (testis), 태반(placenta)을 포함하는 다양한 기관의 손상을 일으킨다(Fassett, 1975).카드뮴은 또한 노출시 뇌혈관 장벽에 축적되고(Couraud,1998)뇌신경 세 포사멸(Elliott등,2000)과 세포간 tightjunction의 붕괴를 유발하여(Zimmerhackl 등,1998)뇌기능 장애를 일으키는 것으로 알려져 있으며,특히 역학 조사 결과 뇌졸중의 발병율을 높일 수 있음이 보고된 바 있으나(Elliott등,2000)아직 자세 한 독성발현기전에 대해서는 알려진 바가 없다.
같은 염증 인자에 의해 세포 표면에서 발현되어지고,다양한 염증 인자가 뇌혈관 장벽으로의 투과와 세포부착분자의 발현에 영향을 줌으로써 뇌질환을 일으킬 수 있다고 보고된 바 있다(Dietrich,2002;ZhangF 등,2002).본 실험에서 카드뮴에 의해 ICAM-1의 발현이 증가하였는데(Fig.3),ICAM-1의 발현이 증가되었을 때 백혈구의 trans-migration이 증가된다는 것은 보고된 바가 있다(Inamasu 등, 2001;MacIntyre등,2003;Callahan 등,2004).이를 바탕으로 카드뮴이 뇌혈관 장벽을 통과하는지 알아보고자 백혈구-내피세포의 부착을 확인하였다(Fig.6).본 실험에서는 humanmonocytecellline인 U937을 사용하였으나 실험에 사용된 뇌 혈관 내피세포주인 bEnd.3는 mousecellline으로써 서로간의 유래가 다르다.하 지만 bEnd.3에 U937과 mousemonocytecellline인 WEHI78/24를 사용한 백혈 구-내피세포의 부착에 관한 실험에서 U937과 WEHI78/24를 각각 사용하여 내피 세포와의 부착 정도를 확인하였으나 차이가 거의 없었음이 보고된 바 있 다.(McEvoy등,1997)
E-cadherin은 catenin을 통한 actin cytoskeleton에 결합된 intracellular domain과 extracellulardomain사이에 분자의 부착 부위뿐만 아니라 칼슘이 결합 되는 지점을 갖고 있으므로,세포간 결합에 있어 칼슘의 역할은 매우 중요하다. 그러나 카드뮴의 노출로 인해 칼슘으로 결합이 되어야 할 자리에 같은 2가 양이 온을 갖는 카드뮴이 치환됨으로써 세포간 결합이 붕괴되어 뇌혈관장벽의 기능장 애를 수반하는 것으로 보고된 바가 있다(Geiger,1983).본 연구에서는 카드뮴 2μ M 처리 시 E-cadherin의 발현이 감소함을 확인하였으며(Fig.3),따라서 카드뮴 은 칼슘의 치환뿐만 아니라 세포부착분자의 발현 억제를 유도하여 뇌혈관 장벽 에서의 세포간 결합 붕괴를 초래하고 있음을 시사하고 있다.
카드뮴에 의해 유도되는 ICAM-1과 E-cadherin의 발현에서 COX의 발현에 의해 생성되는 PGE2가 관여하고 있음을 확인 하였다(Fig.4,5).현재 보고된 바
에 의하면 말초의 혈구 세포(Takahashi등,2002)와 구강 상피 세포(Noguchi등, 2000)등 에서는 PGE2에 의해 ICAM-1의 발현이 감소되었다.그러나 중추신경계
인하였으며,이러한 발현 양상에 COX-PG pathway가 관여하는 것으로 보고된 바 있어(Kyrkanides 등,2002),이러한 결과들은 PGE2에 의한 ICAM-1의 발현
조절 양상이 조직마다 특이적일 수 있음을 시사하고 있다.
한편 ICAM-1과 같이 염증 인자에 의해 세포 표면에서 발현되어지는 VCAM-1,E-cadherin과 거의 같은 기능을 보이고 있는 혈관 세포에 특이적으로 발현한다는 VE-cadherin의 경우 카드뮴에 의한 발현에 있어 다른 세포부착분자 들과는 달리 카드뮴에 의해 영향을 받지 않았다(Fig.4).이전 보고에 따르면 VCAM-1이 ICAM-1,E-selectin은 내피세포의 장벽을 통해 백혈구 세포를 이동 시키고 염증 반응시에 발현되어지는 세포부착분자로 알려져 있다(Zhang 등, 2002).만성적인 RNA 종양 바이러스 뇌염(retroviralencephalitis)의 경우,CNS 에서 ICAM-1은 내피세포와 성상세포에서는 발현되지 않지만 대식세포에서는 발 현이 증가되나,VCAM-1의 경우에는 이 세 가지 모든 세포에서 발현의 변화가 없음을 보고했다(Dallasta등,2000).이 연구 결과는 ICAM-1과 VCAM-1의 발 현 양상이 항상 동일하게 일어나지 않을 수도 있음을 짐작케 한다. 한편 VE-cadherin은 모세관의 내피세포에서 발현되는 것으로 E-cadherin과 거의 같 은 기능을 가지며 이것의 손실은 곧 내피세포 장벽으로의 투과도가 그만큼 증가 된다는 것을 의미한다(Heimark 등,1990;Lampugnani등,1992;Fenyves 등, 1993;Dejana 등,1995;Caveda 등,1996;Hordijk 등,1999;Corada 등,1999; Corada등,2001).카드뮴은 생쥐의 폐에서 E-cadherin과 VE-cadherin의 발현 을 감소시킨다고 보고된 바 있으며(Pearson등,2003),VE-cadherin의 붕괴로 카 드뮴이 여러 조직에서 내피세포 장벽으로의 투과도가 증가됨이 보고된 바 있다 (Gabbiani등,1974;Nolan 등,2000).본 연구에서 카드뮴에 의해 E-cadherin만 이 영향을 받는 것으로 확인되었는데 본 결과가 세포간 결합분자의 발현이외에 E-cadherin 및 VE-cadherin의 결합에 미치는 영향을 나타내지는 못하고 있으므 로 이 결과와 혈관 투과성 변화와의 상관성에 대해서는 추후 더 연구가 되어야 할 것이다.
이상의 연구 결과들은 카드뮴에 의해 유도되는 ICAM-1과 E-cadherin의 발현에 있어 COX-PGE2pathway에 의한 조절 가능성을 제시하고 있으며,이는
카드뮴에 의한 뇌질환 발현의 작용기전을 규명하는데 있어 새로운 방향성을 시 사해 주고 있다.
Ⅴ
Ⅴ
Ⅴ.
.
.결
결
결 론
론
론
카드뮴에 노출된 뇌혈관 세포의 세포부착분자 발현에 있어 COX-2의 역할 에 관한 연구를 수행한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 카드뮴에 의해 유도되는 세포부착분자의 발현을 시간별로 알아 본 결과 mRNA 수준에서는 4시간 그리고 단백질 수준에서는 12시간째에 가장 많이 발현 됨을 보였다.그리고 카드뮴에 의해 유도되는 PGE2의 생성은 COX 저해제에 의 해 유의적으로 감소함을 확인하였다.카드뮴에 의해 증가된 ICAM-1 발현은 COX 저해제에 의해 감소되었으고 PGE2에 의해 다시 증가됨을 확인하였으며,카 드뮴에 의해 유도된 백혈구-내피세포의 부착은 카드뮴에 의해 부착 정도가 증가 되었고 COX 저해제에 의해 감소되었으며 PGE2에 의해 다시 증가됨을 확인하였 다.한편 카드뮴에 의해 감소된 E-cadherin은 COX 저해제에 의해 증가됨을 확 인하였고 PGE2에 의해 다시 감소됨을 확인하였다. 따라서 카드뮴에 의해 유도되는 세포부착분자의 발현은 COX-PGE2 pathway에 관여하여 일어나고 있음을 확인 할 수 있었다.참
참
참고
고
고문
문
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-ABSTRACT-
Cyclooxygenase-2 is Associated with Cadmium-induced ICAM-1
Expression in Brain Endothelial Cell
Sun Mi Seok
Department of Medical Sciences The Graduate School, Ajou University
(Supervised by Associate Professor Soo Hwan Lee)
Exposure to cadmium (Cd) was reported to be related with the increased incidence of neurodegenerative diseases including stroke, though underlying mechanism is not clearly understood. In vivo studies showed that Cd accumulates out-side of blood brain barrier (BBB) and induces the leakage of BBB, suggesting brain endothelium as a putative target. Recently, we have reported that Cd stimulates ICAM-1 expression via NF-kB activation in bEnd.3 cerebrovascular endothelial cells. And also, we observed
Cd induces cyclooxygenase-2 (COX-2) expression, and thereby prostaglandin E2
(PGE2) production in bEnd.3. Based on the previous report that PGE2 is one of the key
regulators in the expression of cell adhesion molecule, in this study, we explored the possible role of COX-2 in Cd-induced ICAM-1 expression in bEnd.3. Cd upregulated ICAM-1 at the levels of mRNA and protein, but downregulated E-cadherin expression in bEnd.3. Other adhesion molecules such as VCAM-1 and VE-cadherin were not
affected by Cd treatment. Cd-induced ICAM-1 expression was attenuated by COX-2
inhibitors, and effects of COX-2 inhibitors were blocked by exogenous PGE2. COX-2
inhibitors recovered E-cadherin expression in bEnd.3 exposed to Cd. Cd increased leucocyte-adhesion to endothelial cells, which was mitigated by COX-2 inhibitors. These data strongly suggest that COX-2 is associated with Cd-induced ICAM-1 expression in bEnd.3. Pro-inflammatory cytokines such as TNFα and IL-1β increased ICAM-1 and COX-2 expression in bEnd.3, but COX-2 inhibitors minimally affected ICAM-1 expression, suggesting above results might be specific to Cd.
Keywords : cadmium (Cd), brain endothelial cells (bEnd.3), cyclooxygenase (COX-2),
