줄기세포 배양 관련 배양액, 성장인자, 소재 등의 국산 제품 개발 동향

줄기세포 배양 관련 배양액, 성장인자, 소재 등의 국산 제품 개발 동향 김상태 Page 1 / 8 BRIC View 2019-T19

줄기세포 배양 관련 배양액, 성장인자, 소재 등의

국산 제품 개발 동향

김 상 태

분당서울대학교병원 E-mail: hsvkst@empal.com 요약문 세포 치료제에 사용되는 줄기세포 배양의 주 소스인 소혈청의 여러 문제점을 보완하기 위한 노력이 시도되고 있다. 이종의 단백질인 소태아 혈청을 함유하는 기존 줄기세포 배양배지는 임상적으로 적용하는데 있어서는 안정성이 문제되는 것을 최소화하는 측면에서 사용되는 배지 성분을 대체되는 특정한 세포적 미세환경 혹 적소(niche)를 필요로 하는 기본 배지, 녹아웃 혈 청대체제가 포함한 배양배지 및 이를 포함한 배양소스에 관한 것에는 호르몬, 비타민, 고가의 성장인자 EGF, bFGF를 사용하지 않아도 줄기세포를 이종 단백질에 의한 오염 위험 없이, 대량 으로 배양하는 어려움을 탈피하려고 노력하고 있다. 특히 저비용으로 고순도의 줄기세포를 회 수하고, 자발적 분화능이 감소된 고순도 줄기세포를 획득하여 세포치료 효능을 획기적으로 증 진하는 BSA, PVA기법에 대한 소재 개발에 대하여 고찰하고자 한다. Key Words: 소혈청, 대체제, 적소, 기본 배지

목 차

1. 서론 2. 본론 3. 결론 4. 참고문헌 BRIC View 동향리포트

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1. 서론

배아줄기세포 확립을 위해서는 내세포괴의 크기가 작은 경우 혹 내세포괴의 존재를 확인할 수 없는 경우에는 내세포괴의 기능을 상실할 가능성이 높다. 여기에 사용되는 시약이 동물 유래에서 비롯된 유연 성분과 동물 유래 병원균에 의해 감염 위험성을 배제할 수 없다. 배아 전부를 배양하거 나 일부를 배양하는 방법이 개발되었다. 분리된 내세포괴가 배아줄기세포로 자라면서 미분화상태를 유지하기 위해서는 MEF feeder layer 위에서 배양을 한다. 이렇게 MEF feeder layer 위에서 배아줄기 세포를 증식하기 위해서는 cytokine의 일종인 leukemia inhibitory factor (LIF)를 사용하면 MEF feeder layer 위에서 키우지 않더라도 인간이나 생쥐의 배아줄기세포는 미분화상태를 유지한다는 것이 알려 지기까지 사용되어 왔다. 인간 배아줄기세포를 확립하기 위해서는 MEF feeder layer를 사용하고 배양 액은 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), supplemented with 20% FBS, 1 mM glutamine, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 1% nonessential amino acid로 구성되어 있다. 줄기세포를 미분화상태를 유 지하기 위한 조건으로 동물에서 유래된 혈청, feeder layer, 화학물질, 효소 등을 사용하여 배아줄기세 포를 확립하지만 이런 성분들은 치료용으로 사용할 수 없다. 현재 진행 중인 연구는 MEF feeder layer 없이 배양하거나, 인간 유래 세포를 feeder layer로 사용할 수 있는 조건을 확립하고, 가능하면 동물 혈청을 대체할 수 있는 조건을 확립하고 대체 성장인자를 첨가하는 방법을 연구 중에 있다. 이 런 연구의 목적은 궁극적으로 동물의 병원균이 배아줄기세포에 감염을 일으킬 수도 있다는 잠재적 인 위험성을 갖고 있기 때문이다. 또한 MEF feeder layer에서 유래한 silaic acid Neu5Gc가 면역학적 반응을 유발시킬 수도 있는 것이다. 동물 유래 소스를 배제하려는 연구가 진행한 사례로 Xu등 [1]은 feeder layer 없는 조건에서 인간 배아줄기세포를 배양하는 방법에 대하여 보고하였다. 비록 이 연구 에서는 MEF feeder layer를 사용하지 않고 배아줄기세포를 확립하였지만, conditional medium과 bFGF를 포함하는 배양액을 사용하여 동물 병원균이 인간세포를 감염시킬 수 있는 잠재적 위험성을 완전히 제거하지 못한다. 최근 Klimans kaya 등 [2]은 어떤 feeder layer도 사용하지 않고 인간의 배 아줄기세포를 확립할 수 있다고 보고하였다. Hovatta 등 [3]은 인간의 foreskin fibroblast를 생쥐 MEF layer 대신 사용하는 법을 보고하였다. Inzuna 등 [4]은 postnatal human fibroblasts를 feeder layer로 사용하고 소태아혈청을 사용하는 대신 serum replacement를 사용하여 인간 줄기세포를 확립하였다 고 보고하였다. 한국에서도 이 등 [5]은 uterine endometrial cell을 feeder layer로 사용하여 3개의 인 간배아줄기세포주를 확립하였다. 그러나 가능한 동물 유래 증식시키는 방법에는 각각의 문제점이 있 다. 그러므로 배아줄기세포의 부작용을 제거하고 효율성이 높은 미분화 줄기세포를 확보하는 조 건들을 알아보고자 한다.

2. 본론

최근에 줄기세포 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 전개되고 있는데 이전의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었지만 면역거부, 공급장기 부족, 벡터개발이나

줄기세포 배양 관련 배양액, 성장인자, 소재 등의 국산 제품 개발 동향 김상태 Page 3 / 8 표 1. 인간배아줄기세포의 개발 사례 질환 유전자에 대한 지식 부족으로 효율적인 상용화가 미진하였다. 이에 줄기세포연구에 대한 관심 이 고조되어 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능줄기세포가 대부분의 질병치 료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 줄기세포는 자기 복제력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하고 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분 류할 수 있다. 많은 과학자는 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 불치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척추손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해 왔다. 따라 서 이런 세포 구축은 소혈청을 사용 시 환자에 적용으로 바이러스, 박테리아, 프리온 감염에 대한 우려와 면역 부작용 등의 위험성 등 및 윤리적인 문제로부터 자유롭고 환자 맞춤형 정밀의료의 세 포치료 및 기존 치료의 한계를 극복하는 대안으로 줄기세포의 대체제를 알아보고자 한다. 본 기고에 서는 줄기세포 배양에는 기본배지에, 고가의 성장인자, 이종 간의 단백질의 오염을 피할 수 있는 임 상적으로 적용이 가능한 세포배양 배지소스를 알아본다.

줄기세포 배양 관련 배양액, 성장인자, 소재 등의 국산 제품 개발 동향 김상태 Page 4 / 8 표 2. 인간배아줄기세포의 소혈청배지 대체제 개발 사례

2.1 혈청대체제

혈청대체제로는 아미노산(글리신, L-히스티딘, -이소루신, -메티오닌, -페닐알라니, -프롤린, -히 드록시프롤린, -세린, -트레오닌, -트립토판, -티로신, -발린), 비타민/항산화제(티아민, 환원형 글루타치 온, 아스코르빈산), 미량원소(Ag+_{, Al}3+_{, Ba}2+_{, Cd}2+_{, Co}2+_{, Cr}3+_{, Ge}4+_{, Se}4+_{, Br}-_{, I}-_{, F}-_{, Mn}2+_{, Si}4+_{, V}5+_{, Mo}6+_, Ni2+_{, Sn}2+_{, Zr}4+_{), 단백질, 인슐린, 지방과립 알부민 등을 포함한다.}

2.2 Chemically-defined medium (CDM) 기본 배지

기본배지에는 줄기세포 배양에서 사용되는 기본배지로는 줄기세포 배양에 적용되는 DMEM, MEM, K-SFM 배지 등을 사용하고 있는데 무혈청배지를 사용할 수 있다. DMEM:F12 media, B27 sup-plement 및 항생제를 혼합한 것을 사용하고 줄기세포의 분화를 억제하는 첨가제를 보충할 수 있다. 또한 등장액중의 중성 완충액 및 단백질 영양분을 함유하기도 한다. 나아가 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 혹 LDL 추출물) 및 이종류의 대부분의 보존액 배지에서 기타 성분(인슐린, 트렌스페린, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 혹 염인 당원 즉 글루코스, 셀레늄, 글 루코코르티코이드, 히드로코르티존 환원제, B27 supplement, N2 supplement 등이 포함된다. 배지 대 용으로 상업화된 것들은 KnockOut-Serum Replacement (ko-SR, Invitrogen), TeSR1 medium contained DMEM/F12 basal medium (Invitrogen), xeno-derived components [7] 및 인간혈장을 이용하는 기술 [8]이 보고된 바 있다.

2.3 환자유래 인간혈청

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혈액 유래 감염과 윤리적인 문제를 줄일 수 있다.

2.4 Transferrin 대체제

이온 대체제로는 착화합물인 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylene glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA), deferoxamine mesylate, dimercaptopropanol, di-ethylenetriamine-pentaacetic acid (DPTA), trans- l,2-diaminocyclohexane-N,N,N',N'-tetraacetic adic (CDTA), ferric citrate chelate 및 ferrous sulfate chelate 등이 있다.

2.5 지방조성 대체제

줄기세포의 만능능력을 유지하기 위해서는 지방분자는 재생에 있어서 필수역할을 담당하는 데 lysophosphatidylcholine (∼17% of all lipids), triacylglycerides (∼15%), phosphatidylcholine (∼8%), phosphatidic acid (∼3%), cholesterol 및 sphingomyelin (∼1% each)이 요구된다. 특히 불포화와 포화 지방산 (1/250 dilution), LPC (100 µM), LPA (10 µM), S1P (10 µM) 및 PGE2 (20 µM)이 요구되어진다.

표 3. 인간배아줄기세포의 지방조성 대체제

2.6 배지대체제

줄기세포의 배양배지에는 2i 배지 같은 LIF와 bFGF가 배제된 것에 JAK/STAT signaling (LIF, PI3K/AKT, ALK/SMADs)와 signaling inhibitors CHIR99021, SB431542, and PD0325901, three cytokines BMP4, SCF, IL-6, 인간 BMP4, EGF 및 human platelet lysates (PL)가 함유된 배지 대체제가 포함 시 줄기세포의 효율을 증가한 사례가 발표되기도 하였다 [6].

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그림 1. 2i 배지에서 iPS의 reprogramming 사례 [6]

2.7 소분자 유도제

일반적으로 BMP는 뼈형성에서 유래한 것으로 C2C12근아세포에 PD407824 + 3 ng/ml BMP4 를 처리하면 조골세포화되는 시도가 보고되고 isoliquiritigenin는 alkaline phosphatase (ALK)을 유도 한다라고 보고되고 있다. KY02111는 hPSCs를 cardiomyocytes으로 SB431542, dorsomorphine 및 CHIR99021는 hPSC는 chemically transitional embryoid-body-like state (CTraS)으로 유도한다라고 보 고하고 있다.

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그림 2. 배지에 줄기세포들을 배양시 세포 내 크로마틴 리모델링 효소와 활성제인 특정 소분자를 첨가시 iPS 유도모델 [7]

한편 iPS 유도에 관여하는 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC (OSKM)는 let-7, 200c와 miR-302에 의해 분화 유도된다라고 알려져 있다. miR-291-3p, miR-294 및 miR-295는 OSK칵테일이 MEFs에서 iPS세포로 재프로그램을 촉진시킨다 (그림 3) [10].

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miR-130/301/721와 miR-148는 homeobox transcription factor Meox2 (Mesenchyme Home-obox 2)의 표적으로 p21와 p16의 G1/S 체크포인터에 관여하고 miR-200 페밀리(miR-141, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-429)와 miR-205는 mouse embryonic fibroblasts를 표적인 중간엽-상피 이 동(mesenchymal to epithelial transition;MET)으로 재프로그래밍을 촉진한다. 따라서 miRNA는 Snail (Snai1), Slug (Snai2)와 Zinc finger E-box-binding homeobox pro-mesenchymal genes (Zeb1/2)의 중 간엽을 억제하고 OSKM reprogramming의 초기단계를 촉진하고 morphogenetic protein (BMP) 경로 를 병용 작용시킨다 (그림 4) [10].

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그림 4. MiRNA는 만능인자를 표적으로 줄기세포 불화화와 자가증식력 억제개요

표 4. 줄기세포의 미분화유지와 성장에 요구되는 무혈청배지 조성들

3. 결론

상기 표 4처럼 줄기세포 배양에는 serum replacement (SR; 10, 15, 20%), FCS, 및 human se-ruminsulin–transferrin–selenium (ITS) 혼합액, 그리고 basic fibroblast growth factor (bFGF), 소분자, miRNA가 함유한 무혈청 배지조성에 의해 TRA-1–60, TRA-1–81, SSEA-4 및 Oct-4을 분석하여 미분화 된 줄기세포를 고수율로 확보하는 방법들이 고안되고 있어서 인간 배아줄기세포를 이종 단백질에 의한 오염 위험 없이, 대량으로 배양하는 어려움을 탈피하고 저비용으로 고순도의 줄기세포를 회수 하고, 자발적 분화능이 감소된 고순도 줄기세포를 획득하여 세포치료 효능을 획기적으로 증진할 수

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있는 기술이 점점 개발되고 있다는 것은 불치병의 난제를 극복하는 아주 고무적인 시점에 도달하고 있다는 점에 있어서 매우 다행이고 여러 환자에게 맞춤형 정밀의료기술에 한층 기대되는 기술발전 이라 사료된다.

4. 참고문헌

[1] Xu C, et al. Feeder－free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2001; 19: 971–4.

[2] Klimanskaya I, Chung Y, Meisner L, Johnson J, Wes MD, Lanza R. Human embryonic stem cells derived without feeder cells. Lancet 2005; 365: 1636–41.

[3] Hovatta O, et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod 2003; 18: 1404–9.

[4] Inzunza J, et al. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells 2005; 23: 544–9.

[5] Lee JB, et al. Establishment and maintenance of human embryonic stem cell lines on human feeder cells de-rived from uterine endometrium under serum－free condition. Biol Reprod 2005; 72: 42–9.

[6] Yangyang et al. Preserving self-renewal of porcine pluripotent stem cells in serum-free 3i culture condition and independent of LIF and b-FGF cytokines. Cell Death Discovery 2018. 4. 2–14.

[7] Asuka Eguchi, Garrett O. Lee, Fang Wan, Graham S. Erwin, Aseem Z. Ansari.(2014) Controlling gene networks and cell fate with precision-targeted DNA. Biochemical Journal, 462,397-413.

[8] Price P, Goldsborough M and Tilkins M (1998) Embryonic stem cell serum replacement. International Patent Application WO98/30679

[9] Ellerstro¨m C, Strehl R, Moya K, Andersson K, Bergh C, Lundin K, Hyllner J and Semb H (2006) Derivation of a xeno-free human ES cell line. Stem Cells 24, 2170–2176.

[10] Beh-Pajooh A, Cantz T.(2018) The Role of microRNAs in Embryonic and Induced Pluripotency, J Stem Cells Regen Med, 14,3-9.

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김상태(2019). 줄기세포 배양 관련 배양액, 성장인자, 소재 등의 국산 제품 개발 동향. BRIC View 2019-T19 Available from http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3265 (Jul 02, 2019)