저작자표시-비영리-변경금지 2.0 대한민국 이용자는 아래의 조건을 따르는 경우에 한하여 자유롭게 l 이 저작물을 복제, 배포, 전송, 전시, 공연 및 방송할 수 있습니다. 다음과 같은 조건을 따라야 합니다: l 귀하는, 이 저작물의 재이용이나 배포의 경우, 이 저작물에 적용된 이용허락조건 을 명확하게 나타내어야 합니다. l 저작권자로부터 별도의 허가를 받으면 이러한 조건들은 적용되지 않습니다. 저작권법에 따른 이용자의 권리는 위의 내용에 의하여 영향을 받지 않습니다. 이것은 이용허락규약(Legal Code)을 이해하기 쉽게 요약한 것입니다. Disclaimer 저작자표시. 귀하는 원저작자를 표시하여야 합니다. 비영리. 귀하는 이 저작물을 영리 목적으로 이용할 수 없습니다. 변경금지. 귀하는 이 저작물을 개작, 변형 또는 가공할 수 없습니다.
이학 석사학위 논문
허혈성 백서모델에서 물리적장벽파괴와
에리트로포이에틴 투여방법에 따른
신생혈관생성과 신경보호
아 주 대 학 교 대 학 원
신 경 과 학 교 실
권 용 진
허혈성 백서모델에서 물리적장벽파괴와
에리트로포이에틴 투여방법에 따른
신생혈관생성과 신경보호
지도교수 홍 지 만
이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함.
2018 년 2 월
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/신경과학전공
권 용 진
권용진의 이학 석사학위 논문을 인준함.
심사위원장
홍 지 만 인
심 사 위 원 이 진 수 인
심 사 위 원 임 태 성 인
아 주 대 학 교 대 학 원
2017년 12 월 22 일
- 국문요약 -
허혈성 백서모델에서 물리적장벽파괴술와 에리트로포이에틴 투
여방법에 따른 신생혈관생성과 신경보호
연구배경 및 목적: 모야모야병은 아시아인에서 흔한 뇌 혈관 질환으로, 뇌 혈관의 내경 동맥 및 윌리스환 주변부의 진행성 협착으로 인한 (1) 두개강 내 저관류상태 와 (2) 두개강 내 측부혈관인 윌리스환 주변부의 혈관변화를 특징으로 한다. 따라 서 혈류가 부족한 두개 내, 외 지역의 혈관을 직접 연결하거나 간접적으로 혈관재 건을 촉진시키는 수술이 유일하다. 지금까지 개발된 본 질환의 실험 모델은 특징적 인 임상 양상을 충분히 표현하지 못했기 때문에 발병 메커니즘을 파악하거나 치료 방법을 개발하는 데 제한점이 많았다. 두개강 내 저관류 상태에 있는 모야모야병 환자의 혈액이나 뇌척수액에서 신경보호와 관련된 인자들이 증가되어 있어 새로운 뇌졸중이 발생했을 때 허혈이 줄어드는 ‘허혈 내성(ischemic tolerance) 혹은 허혈성 전조건화(ischemic preconditioning)’가 나타난다는 것이 잘 알려져 있다. 따라서 본 연 구의 첫째 목적은 제작한 동물 모델이 허혈성 전조건화가 있어 급성 허혈성 뇌졸 중에 대해 신경보호가 있으면서 위에서 언급한 두가지 특징을 가지는 실험동물을 제작하는 것이다. 둘째, 혈관재건을 촉진하는 최소 침습수술인 물리적장벽파괴술과 병행하여 신생혈관생성 촉진효과가 있는 에리트로포이에틴의 투여 방법에 따른 신 생혈관생성 및 신경보호 정도를 평가한다. 연구방법: 단계 1_허혈성 전 조건화된 모야모야 동물모델을 확립하기 위해 양측내 경동맥 폐색을 1-3주간 시행하고 이후 중대뇌동맥을 90분간 일시적으로 폐색하여 뇌경색 부위가 가장 적고 사망률이 낮아 적절한 허혈내성이 일어나는 조건을 확립 하기 위해 뇌혈류량, 행동실험, 뇌경색의 크기의 상관관계를 비교하였고 윌리스환 주변부의 혈관변화를 확인했다. 단계 2_제작된 동물모델에 우측 중대뇌동맥에 90분 간 일시적으로 폐색한 후 2시간에 에리트로포이에틴을 복강내 및 두피내에 국소적 으로 단회투여(5000U/kg)하여 투여 방법에 따른 기능적 회복과 신경보호, 신생혈관생성 정도를 비교 하였다. 연구결과: 단계 1_영구적 중대뇌동맥폐색 모델(370mm3)과 비교할 때, 양측 내경동 맥 폐색으로 허혈성 전 조건화를 1-3주간 시행한 개체에서 중대뇌동맥폐색을 시행 하였을 때 2주간 시행한 개체에서 뇌경색의 크기(167mm3) 가 줄어들었고, 생존률 (100%)도 가장 높아 적합한 개체로 간주되었다. 2주간 내경동맥 폐색 동물에 중대 뇌동맥을 폐색하여 내경동맥 폐색 전상태와 비교하여 혈류량이 60% 미만이고 신경 학적 행동점수가 10점 이상을 보이는 개체에서만 뇌경색이 나타나는 특성이 있었 기 때문에 허혈성 전 조건화가 발생한 것으로 간주되어 적합한 동물모델로 최종 선택되었다. 가짜 수술 모델과 비교하여, 선택된 최종모델에서 윌리스환 주변의 주 요혈관(내경 동맥, 후교통동맥, 중대뇌동맥, 뇌기저동맥)의 감소(p=0.05)가 있었다. 단계 2_우측 중대뇌동맥을 90분간 일시적으로 폐색한 모델의 경색주변부위(peri-infarct area) 혈관 밀도(79%)를 비교하여, 에리트로포이에틴 투여 그룹이 혈관밀도 (vessel density)가 증가(91%, p=0.005)하였지만 복강내 투여군과 두피내 국소적 투여 군간에는 차이가 없었다. 앞선 실험과 같이 동물모델의 뇌경색 크기(246mm3)를 비 교하여, 확립된 동물모델에서 에리트로포이에틴의 복강 내 투여 그룹이 뇌경색 크 기(142mm3)가 감소하여 신경보호효과가 있었지만 두피내 국소적 투여 군에서는 뇌 경색 크기(198mm3)가 비슷하여 신경보호효과를 입증하지 못했다. 결론: 저관류 상태를 유지하고 윌리스환 주변부 혈관의 변화가 있는 허혈성 전 조 건화 모야모야 동물모델을 확립하였다. 이 모델을 통해 물리적장벽파괴술과 에리트 로포이에틴의 단회투여와 투여방법에 따른 신생혈관생성에는 차이가 없었지만, 신 경보호에는 복강내 투여만이 효과가 있었으므로 에리트로포이에틴의 다수투여가 투여방법에 따른 효과가 있으리라 기대한다. 핵심어: 모야모야병; 허혈성 전조건화; 물리적장벽파괴술; 에리트로포이에틴;
차 례
국문요약 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ i 차례 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ iii 그림 차례 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ iv 표 차례 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ v I. 서론 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 1 II. 재료 및 방법 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 3 A. 실험동물 군 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 3 B. 허혈성 전조건화 백서모델 제작 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 3 C. 뇌혈류량 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 4 D. 에리트로포이에틴 투여 방법 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 4 E. 물리적장벽파괴술 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 4 F. 신경학적 동물행동 실험 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 4 G. 뇌 조직 준비와 뇌경색 크기 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 5 H. 면역형광법 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 5 I. 윌리스환 주변 혈관 변화 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 6 III. 연구결과 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 7 A. 실험 계획 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 7 B. 만성 허혈성 전 조건화 모야모야 동물모델 확립 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 9 C. 신경보호효과 비교: 조건화 모델 vs. 단순 허혈 모델 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 10 D. 적절한 손상 동물모델을 선별하기 위한 간접 지표 분석 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 12 E. 뇌 허혈 후 윌리스환 주변 혈관 변화 비교 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 14 F. 투여방법에 따른 신경학적 행동점수의 변화 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 15 G. 투여방법에 따른 신생혈관생성 효과 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 16 H. 투여방법에 따른 신경보호 효과 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 18 IV. 고찰 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 19 V. 한계점 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 23 VI. 결론 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 24 VII. 참고문헌 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 25그림 차례
Fig. 1. Experiment schedule ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 8 Fig. 2. Ischemic damage after sudden MCA occlusion according to ischemic preconditioning period
‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧10
Fig. 3. Cerebral blood flow, infarct volume, and survival rate in tMCAO and PreC-tMCAO models
‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧11
Fig. 4. Screening cut-off criteria in behaviors, cerebral blood flow, and infarct volume ‧‧‧‧‧‧‧‧ 13 Fig. 5. Analysis of the circle of Willis after cerebral ischemia ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 14 Fig. 6. Comparison of neurological behaviors in EPO administration groups ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 16 Fig. 7. Comparison of angoigenic effect in EPO administration groups ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 17 Fig. 8. Comparison of neuroprotective effect in EPO administration groups ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 18
표 차례
I. 서론
세계 보건학적으로 뇌졸중은 사망률이 가장 높은 질환 중 하나이고, 50% 이 상의 환자들에서 영구적인 신경학적 장애를 나타내기 때문에 사회-경제학적으 로 중요한 질환이다. 뇌졸중은 혈관이 터지는 출혈성 뇌졸중과 혈관이 막히는 허혈성 뇌졸중으로 분류되며 허혈성 뇌졸중이 보다 많이 발생하여 전체 뇌졸중 의 약 80% 정도를 차지하고 있다(Toni et al. 2014). 허혈성 뇌졸중은 뇌혈류가 일 시적이거나 영구적으로 떨어져 일정 뇌영역에 갑작스러운 기능저하가 발생하여 증상이 일어난다(Liu et al. 2017). 따라서 감소된 뇌혈류를 다시 회복시키는 재개 통치료는 12시간 이내 급성기에 가장 적극적으로 사용되고 있는 방법이고, 급 성기 환자의 예후는 혈류 재개통 시간이 짧을수록 좋기 때문에, 치료시간의 단 축은 급성 시기에 생리적 지표가 되기도 한다(Granger and Kvietys. 2017).모야모야병(Moyamoya disease)은 내경동맥(Internal carotid artery) 원위부 및 윌 리스환(Circle of Willis) 주변부 대형동맥 분지의 진행성 협착이 있고, 내경(<300 μm)이 작고 구불구불한 모먀모야 혈관의 존재가 특징인 질환이다(Blauwblomme and Lemaitre. 2016). 따라서 두개내혈관의 위축에 따른 두개강 내 뇌혈류감소 때 문에 이를 보상하기 위한 기존 혈류를 바탕으로 측부순환이 발생하기도, 또 완 전히 새로운 혈관이 생성되기도 한다(Scott and Smith. 2009). 또한, 모야모야병을 가진 환자의 표면측두동맥(Superficial temporal artery), 혈액 혹은 뇌척수액에서 신 경보호효과와 관련된 인자(basic fibrolast growh factor, TGF-beta1, IL-1, IL-2 등)들이 발현된다는 조사가 있었기 때문에 모야모야병과 유사한 동물 모델에 급성 허혈 성 뇌졸중에 대해 신경보호 효과가 있을 것이라 생각된다(Natori et al., 1997). 하 지만, 지금까지 모야모야병의 메커니즘을 정의하기 위해 다양한 연구자들에 의 해 시도되어 왔음에도 불구하고 크게 알려지지 않았다. 실험 모델의 부족은 약 물 개발과 모야모야병의 메커니즘을 이해를 저해했다(Ezura et al. 1992). 모야모야병 환자의 외과적 치료는 두개강의 외측의 정상혈관과 두개강 내의
비정상 혈관측의 연결을 시도하는 문합술 중 직접적인 문합술과 간접적인 문합 술을 사용한다(Li et al. 2015). 직접적인 문합술은 수술자에 의존적이며 전신마취 와 수술시간이 길다(Kapu et al. 2010). 간접 문합술의 경우에는 상대적으로 수술 시간이 짧지만 신생혈관생성이 전제되어야 하므로 소아환자에게만 적용할 수 있는 단점이 있다(Piao et al. 2015). 이에 반해 천공술의 일종인 물리적장벽파괴술 (mechnical barrier disruption)은 국소마취 하에 가능하며 수술시간이 짧은 가장 안 전한 방법이다. 이 수술은 모야모야병을 치료하기 위해 천공부위의 위치를 조 절하여 각 지역의 혈관 재개통 정도를 조정하여 치료할 수 있다. 하지만, 물리 적장벽파괴술을 통한 혈관 재개통의 정확한 메커니즘은 알려져 있지 않다 (McLaughlin and Martin. 2014).
Erytrhopoietin(EPO)는 적혈구 생산에 필수적인 호르몬으로 허혈성 뇌 손상에 대한 신생혈관생성 및 신경보호 효과가 있다. 신경보호 효과는 항산화 제, 글루 타메이트 억제제, 항 염증반응, 항 세포사멸 반응 및 줄기 세포 조절 등 다양한 효과를 지니고 있다(Aluclu et al. 2007). 또한, 허혈성 뇌졸중 모델 연구에서 EPO 투여 후 혈관 성정 인자를 증가시킴으로써 기능적 증진을 유도한다. 예를 들어, Angiopoietin-1, Vascular endothelial growth factor, stromal cell-drived factor 1과 같은 케 모카인은 혈관 신생에서 중요한 역할을 하는데, EPO가 이러한 요인들의 증가를 유도한다(Arcasoy et al. 2010).
이 연구에서 첫 번째 만성 저관류상태를 유지하고 윌리스환 주변부의 혈관 변화가 있는 허혈성 전 조건화 모야모야병 백서 모델(14 day bilateral internal carotid artery ligation and transient middle cerebral artery occlusion = ischemic preconditioned tMCAO = PreC-tMCAO)을 확립하고자 하였다. 두 번째 확립된 모 델을 통해 물리적장벽파괴술과 복강 내 및 두피내 국소 적으로 EPO를 투여방 법에 따라 신생혈관 효과와 신경보호 효과를 보고자 하였다.
II. 재료 및 방법
A. 실험 동물 군
모든 동물 실험은 아주대학교 의과대학 동물실험 및 사용위원회의 승인 하에 허용되었으며 실험실 동물의 보살핌과 사용에 관한 국립 보건원 지침에 따라 수행되었다. 중한 뇌허혈 백서모델을 만들기 위해, 수컷 Wistar rats (7-8 weeks old, 220 - 240 g weight, Orient Bio, Seongnam, Korea)을 사용하였다. 단계 1에선 pMCAO 그룹, (-7d, -14d, -21d)BICAL+pMCAO 각각의 총 4개의 그룹으로 이루어 져있다. 단계 2에선 BICAL그룹, tMCAO 그룹, 복강 내 주사 투여군인 PreC-tMCAO + MBD + Saline or EPO 그룹, 두피 내 주사 투여군인 PreC-tMCAO + MBD + Saline or EPO 그룹으로 총 6개의 그룹으로 이루어졌다.
B. 허혈성 전조건화 백서모델 제작
백서를 70% N2O 와 30% O2가 섞여 나오는 호흡마취기에 아이소플루렌(5%)을 사용하여 마취하고 수술 중에는 2%를 유지하여 마취한다. 직장 온도계(CMA)를 사용하여 37 ± 0.5°C를 유지시켜 준다. 일시적인 국소 뇌 허혈(90분)은 우측 중간 대뇌 동맥의 관내 폐쇄에 의해 유도 되었다. 목의 정중선 절개 후, 양쪽 총 경동맥, 외 경동맥 및 내 경동맥을 분리 하였다. 총 경동맥을 묶은 후 내 경동맥을 총 경동맥과의 분기점으로부터 1mm 부분에 4/0 검정실을 이용하여 묶어 둔다. 그로부터 14일 후, 우측 중간 대뇌 동맥으로 4.0 fine suture (403556PK10, Doccol Corp, Sharon, MA, USA)를 사용하여 약 1.8 – 2.0mm 지역까지 밀어 넣어 준다. 90분이 지나고 나면 suture를 빼내어 주고 절개가 된 목을 봉합시켜 준다.C. 뇌혈류량 측정
백서를 마취하여 머리를 sterotaxic으로 고정 시킨 후, 머리 피부를 수직으로 절개한다. 두개골의 전체 부위를 PIM3 (Perimed AB, Stockholm, Sweden)를 이용하여 수술 전과 후를 촬영한다. 촬영이 끝난 후, 머리를 봉합시켜 준다. 양측 중간 대뇌 동맥 지역에 ROI를 설정하여 수술 전과 후를 비교하였을 때, CBF가 60%미만으로 감소가 되지 않은 동물들은 실험에서 제외시켰다.
D.
에리트로포이에틴 투여 방법
EPO 투여 방법에 따라 기능 회복이 개선되는지 여부를 알아보기 위해 MCAO 후 2시간째에 rhEPO (Eporon® , DongA-ST, Seoul)를 단회투여하여 복강 내 또는 두피 내 국소적으로 5000 units/kg를 투여 하였다. PreC-tMCAO 군의 대조군은 동일한 양의 식염수를 투여 하였다.
E. 물리적장벽파괴술
MCA 수술 후 2시간 후에 EPO를 투여한 뒤 24시간 후에, 백서들을 마취 시키고 뇌 입체수술기구에 머리를 고정 시킨다. 두개골의 중간 피부를 수직으로 자르고 브레그마에서 후방으로 2mm, 우측으로 4mm 지역에 직경 2mm의 구멍을 만들어 주고, 뇌경막까지 제거하고 수술 부위를 봉합하여 준다.F. 신경학적 동물행동 실험
각 신경학적 동물행동 실험은 물리적장벽파괴술 이후 -2, -1, 0, 1, 7, 14, 28일에 실시하여 준다. 각 군들의 수술 후 mNSS를 실시하여 최대 18점 및 최소 0점의 신경 점수를 산출하였다. 신경 점수가 10점 미만이 되는 개체들은 실험에서 제외 시켰다. 동물 집단에 대해 관찰자는 무작위로실시하여 신경 기능을 평가 하였다(Chen et al. 2001). 로타로드 검사의 경우 MCAO 전 하루에 세 번씩 같은 조건으로 미리 훈련을 시켰다. 모든 쥐를 지구력의 시간을 측정하기 위하여 로타로드 바퀴에 배치하고, 속도는 4 – 40 rpm로 2분동안 점차적으로 증가되도록 설정하였다. 쥐들이 회전 바퀴에서 떨어지는 시간을 기록하고 총 3회를 실시하여 평균을 내어 계산하였다(Oh et al. 2015). 접착력 제거 검사는 쥐들의 앞다리 발바닥의 표면에 동일한 압력으로 1x1 cm 크기의 사각형 접착 테이프를 붙여 놓았다. 각 쥐들이 발에 붙은 접착 테이프를 뜯어내는 시간을 측정 하였으며, 테이프 제거 시간은 120초 안에 실시되도록 하여 총 3회를 실시하여 평균을 내어 계산하였다(Freret et al. 2006).
G. 뇌 조직 준비와 뇌경색 크기 측정
각 그룹의 동물들을 7일과 28일에 희생시켜 ketamine과 xylazine이 혼합된 약을 사용하여 마취 하였고, MCAO 후 7일에 희생시킨 동물은 뇌를 제거하여 관상단면으로 7개의 조각(두께 2mm)으로 자른다. 뇌의 조각들을 37도에서 2% Triphenyl tetrazolium chloride(TTC)용액에 20-30분 동안 즉시 담근 후, 염색된 조직을 4% paraformaldehyde(sigma)에 고정시켰다. 염색된 조직을 컬러로 사진 촬영하여 이미지 분석 시스템(ImageJ)을 사용하여 허혈성 손상부위를 측정하였다. 28일에 희생시킨 동물은 1xPBS와 4% PFA를 순차적으로 관류시키고, 추출 된 뇌조직을 4% PFA로 다시 한번 후고정 시켰다. 고정 된 뇌조직을 10%, 30% sucrose 용액에 순차적으로 옮겨 담은 후, 액체 질소에서 급속 냉동시킨 후, 조직을 30um 두께로 저온 유지 장치로 자른다. 우리는 간접경색측정법을 이용하여 측정하였다. mm3 = (대 측성 반구 – 남아있는 동측 반구) x 2로 측정하였다. 이미지의 크기는 image J software를 사용하여 측정되었고, 그 값은 cresyl violet으로 염색한 후 7개의 연속적인 관상면으로 분할 하였다.
H. 면역형광법
면역 형광 염색법은 실온에서 1시간 동안 blocking용액으로 고정시킨 다음 4 °C에서 24시간 동안 1차 항체와 반응 시켰다. 일차 항체는 alpha smooth muscle actin : a-SMA (1: 200, Rat, Sigma, A2547) and monoclonal Endothelial Cell : RECA-1 (1: 400, Mouse, serotec, MCA970GA)를 사용하였다. 실온에서 30분을 두고 난 후, 2차 형광 항체를 사용하여 반응 시켰다. 2차 항체로는 Alexa Fluor 488 (Anti-Ms lgG)를 사용하여 2시간 동안 반응 시켰다. DAPI를 사용하여 커버 유리를 덮었다. 형광 염색 후, 형광 현미경을 사용하여 두 반구의 대뇌 피질에서 경색 핵심지역, 경색 주변지역의 이미지를 가져와 혈관 수 및 데이터를 이미지 분석 프로그램을 사용하여 분석한다. 혈관의 밀도는(ipsilateral peri-infarct area / contralateral area) x 100 로 분석한다.
I. 윌리스환 주변 혈관 변화 측정
쥐의 윌리스환 주변 혈관 변화를 측정하기 위해, 14일 BICAL과 90분 tMCAO 후 7일 째에 마취 된 쥐를 생리 식염수와 4% PFA로 순차적으로 관류 시킨 뒤, 3ml 라텍스 용액을 관류시킨다. 관류 된 쥐를 1시간 이상 얼음에 두어 라텍스 경화를 시켜준다. 라텍스 경화가 확인되면 쥐의 뇌를 분리하여 완충된 포르말린에 담구어 둔다. 윌리스환 주변의 주요 혈관인 내경동맥(ICA), 중대뇌동맥(MCA), 후교통동맥(PcomA), 뇌기저동맥(BA)을 저배율 현미경(Nikon SMZ745T, Tokyo, Japan)으로 촬영한다. 혈관 직경을 이미지 분석 시스템(Image J)을 사용하여 측정 하였다.Abbreviation: BICAL, bilateral internal artery ligation; tMCAO, transient middle cerebral artery occlusion; PreC-tMCAO, ischemic preconditioning-tMCAO; MBD, mechanical barrier disruption; EPO, erythropoietin; CBF, cerebral blood flow; mNSS, modified neurological severity score; ICA, internal carotid artery; MCA, middle cerebral artery; PcomA, posterior communicating artery; BA, basilar artery;
III. 연구결과
A. 실험 계획
단계1은 허혈성 전 조건화 된 모야모야 동물 모델을 확인 하였다. 1 - 3주간 전 조건화가 된 동물을 통해 가장 효과적인 허혈성 전조건화 기간을 확인하 고자 했다. 허혈성 전조건화 후 영구적인 MCAO를 실시한 후 24시간에 조직 을 채취하여 TTC staining을 통하여 경색증을 확인하고, 각 군의 생존률을 확 인 하였다. 결정 된 2주 허혈성 전조건화 모야모야 동물과 일반 허혈성 뇌졸 중 동물과 비교하여 허혈 내성 효과를 확인 하였다. 허혈성 전조건화 동물에 90분 일시적인 MCAO를 실시 한 후 7일에 조직을 채취하여 뇌혈류량을 확인 하고, 뇌경색 크기를 확인 하였으며, 생존률과 신경학적 행동 실험을 확인 하 였다. 각각의 결과들을 비교하여 상관관계를 확인 하였다. 또한 윌리스환 주 변 주요혈관의 직경을 비교하였다. 단계2는 허혈성 전조건화 동물 모델과 물 리적장벽파괴술(MBD)과 에리트로포이에틴의 투여방법에 따른 신생혈관생성과 신경보호 효과를 알아보고자 하였다. 허혈성 전조건화 동물모델에 90분 일시 적인 MCAO를 주고 2시간후에 단회투여로 복강내 및 두피내 국소적 주사를 주고 24시간 뒤 물리적장벽파괴술을 실시 하였다. 그로부터 1-4주까지 주 1회 신경학적 행동 실험을 하고 조직을 채취하였다. 채취한 조직을 통해 RECA-1 염색을 통해 혈관밀도를 측정하여 신생혈관생성을 확인하였고, Cresyl-violet 염 색을 통해 신경보호 효과를 확인하였다.Fig. 1. Experiment schedule. Step 1 is to find time-dependent, chronic ischemic preconditioning
animal models. The preconditioning time was -7, -14, -21days before permanent MCAO sacrifice to confirm cerebral infarction and survival rate. Compared preconditioning animal models with non-preconditioned animal models. Cerebral blood flow measurement, cerebral infarction, survival rate, and modified neurological severity score were compared between preconditioning and non-conditioned model and in order to select a more accurate model, the correlation of each experiment was confirmed. The diameter of the peripheral vessels the circle of willis was measured. Step 2 confirmed the combination therapy effect of preconditioning and erythropoietin and mechanical barrier of disruption. We observed behavioral test until the fourth week and confirmed the angiogenesis and neuroprotective effects.
B. 만성 허혈성 전 조건화 모야모야 동물모델 확립
만성 허혈 전조건화 모야모야 동물모델에서 전 조건화 기간에 따른 경색증과 생존률을 MCAO 수술 후 24 시간에 조직을 확보하여 측정 하였다. 전 조건화를 주지 않은 동물모델에서 경색증의 크기는 약 370mm3으로 나타났고, -7 일 전 조건화 동물모델은 약 235mm3, -14 일 전 조건화 동물모델은 약 166mm3, -21 일 전 조건화 동물모델은 약 204mm3 으로 나타났다(Fig. 2A and 2B). 전 조건화 되지 않은 동물모델에 비해 –14 일 전 조건화 된 동물모델의 경색증이 현저하게 감소 된 것을 확인하였다(p<0.0001). 또한, 생존률을 확인 하였을 때, 전 조건화 되지 않은 동물 모델은 13/15 수로 약 86%의 생존률을 나타내었고, -7 일 전 조건화 된 동물 모델에서는 16/29 수로 약 55%의 생존률을 나타내었다. 반면에, -14 일과 –21 일 전 조건화 된 동물에서는 각각 17/17 수와 10/10 수로 약 100%의 생존률을 나타내었다(Fig. 2C). 경색증의 크기와 생존률을 비교하였을 때, -14 일 동안 전 조건화를 준 동물모델이 만성 허혈성 전 조건화 된 모야모야 동물모델에 가장 적합하다는 것을 확인 하였다.
C. 신경보호효과 비교: 조건화 모델 vs. 단순 허혈 모델
우리는 허혈성 전조건화 동물 모델과 단순 허혈 모델을 비교하였다. 이전 데이터에서 전 조건화 기간을 –14일로 확정하고 -14일 전 조건화 된 동물모델 과 그렇지 않은 모델을 비교하여 전 조건화가 신경보호효과와 생존률에 더 효과가 있음을 확인하고자 하였다. 이 과정에서 pMCAO에서 tMCAO로 바꾸 었는데, pMCAO 모델이 장기간 살아있지 않으므로 이 보다 덜 심각한 tMCAO 모델로 바꾸었다. 먼저, PreC-tMCAO 모델은 –15일 전과 MCAO 수술 직전과Fig. 2.Ischemic damage after sudden MCA occlusion according to ischemic preconditioning period. (A) This figure TTC-stained coronal sections and infarct volumes assessed by TTC
staining. (B) All of the animal groups according to ischemic periods showed that the infarct volume was markedly reduced in comparison to the only pMCAO group. (C) The survival and mortality rate of the sudden cerebral infarction in this model according to ischemic periods. The animal groups were presented that the survival rate of (-14d) BICAL+pMCAO and (-21d) BICAL + pMCAO groups was one hundred percent. (p*<0.0001, vs. pMCAO)
후에 뇌혈류량을 측정하고 tMCAO 모델은 수술 직전과 후에 측정하였다 (Fig 3A). MCAO 직후에 뇌혈류량을 측정 하였을 때, PreC-tMCAO 모델은 약 55% 까지 감소가 되고 tMCAO 모델은 약 45%까지 감소가 되는 것을 확인 하였다 (Fig 3B). 우리의 허혈성 전조건화 모델이 만성 저관류 상태를 유지하는 것을 확인하였다. 또한, 뇌경색증 크기를 측정하였을 때, PreC-tMCAO 모델은 약 205mm3, tMCAO 모델은 약 376mm3으로 PreC-tMCAO 모델이 더 감소가 된 것 을 확인하였고(p<0.0158), 생존률 역시 PreC-tMCAO 모델은 약 79%, tMCAO 모델은 약 55%로 PreC-tMCAO 모델이 더 높은 것을 확인하였다(Fig 3C-3E). 이 결과로, 전 조건화가 신경보호효과가 있다는 것을 확인 할 수 있었다.
Fig. 3. Cerebral blood flow, infarct volume, and survival rate in tMCAO and PreC-tMCAO models. Sequential images of CBF and quantitative analysis (A-B) in ipsilateral
hemisphere. PreC-tMCAO model showed the reduction of infarct volume compare to tMCAO model (C, D). The survival rate of PreC-tMCAO model is about 79%, while tMCAO model is about 55%. We regarded PreC-tMCAO rat as a suitable model for long-term monitoring to investigate angiogenesis. (p*<0.05, vs. tMCAO)
D. 적절한 손상 동물모델을 선별하기 위한 간접 지표 분석
우리는 실제 모야모야 환자와 같이 대뇌반구의 급성 뇌졸중이 발생했을 때 허혈성 전조건화가 되어 최종 뇌경색의 부피가 감소되는 동물모델을 구축하고 싶었다. 하지만 뇌졸중이 발생하여 최종 뇌경색 부피는 사후 뇌조직을 얻기 전 까지 확인 할 수가 없다. 그러므로 모든 개체에서 수술을 시행한 후 어느 정도 의 허혈 중증도를 유지하면서도 따라서 적절한 뇌손상이 발생했는지를 확인하 기위해 간접지표인 뇌혈류량과 신경학적 행동점수 지표를 개체 생존 시에 측정 하였다. 최종적으로는 뇌손상의 직접지표인 사후 뇌경색 부피를 측정하여 생존 시에 측정된 간접지표와 사후에 측정된 직접지표사이의 연관관계를 조사하여 간접지표로 적절한 동물모델을 선별해 내는 방법을 확립하려 하였다. MCAO 직 후 뇌혈류량이 처음 혈류량보다 60%미만인 개체에서는 뇌경색이 생성되었고, 60%이상인 개체에서는 뇌경색이 생성되지 않는다는 것을 확인하였 다. 또한, 신경학적 행동점수가 MCAO 직 후 10점이상인 개체들에게서만 뇌경 색이 확인 되었다. 결론적으로 수술 후 뇌혈류량이 60% 미만으로 감소되고 신 경학적 행동점수가 10점 이상인 개체들만 선택하여 “허혈성 전조건화”된 모야 모야 동물모델로 확립하였다(Fig. 4).Fig. 4. Screening cut-off criteria in behaviors, cerebral blood flow (CBF), and infarct volume.(A) CBF and infarction, (B) mNSS and infarction, and (C) CBF and mNSS. Table 1 shows the values of CBF, mNSS and infarction, respectively.
E. 뇌 허혈 후 윌리스환 주변 혈관 변화 비교
허혈로 인한 두개강 내 측부혈관인 윌리스환 주변부의 주요혈관인 내경동맥, 중대뇌동맥, 후교통동맥, 뇌기저동맥의 변화를 알아보기 위해 혈관의 직경을 측정하였다. 가짜 수술한 개체의 혈관 직경을 비교하여, BICAL 개체는 혈관확장에 의해 중대뇌동맥과 뇌기저동맥의 직경이 조금씩 증가되는 경향을 보였고, BICAL 후 MCAO 를 실시한 개체에서는 윌리스환을 구성하는 대부분의 혈관의 직경이 짧아진 것을 확인하였다. 그러므로, 허혈성 전조건화의 특징인 윌리스환 주변부 혈관의 변화가 있음을 확인하였다 (Fig. 5).Fig. 5. Analysis of the circle of Willis after cerebral ischemia. The major arteries (including
ICA, MCA, PcomA, BA) were markedly thin after occlusion of the middle cerebral artery following bilateral ICA ligation (*P < 0.05).
F. 투여방법에 따른 신경학적 행동점수의 변화
허혈성 전조건화 된 모야모야 동물모델(PREC-tMCO)에 MBD와 EPO의 투여 방법에 따른 기능적 회복 효과를 허혈은 유지되나 신경행동이 나오지 않는 양 측 내경동맥 결찰군(BICAL)과 비교하여 시간에 따라 확인하였다 (Fig. 5). mNSS 는 tMCAO 후 모든 개체가 약 12점을 기록하고 점점 회복되는 것을 확인하였 다. BICAL 그룹은 tMCAO 그룹에 비해 모든 날에 기능이 좋은 것을 확인하였 다. 복강 내 투여군과 두피내 국소적 투여 군에서 tMCAO 그룹보다 mNSS와 A.R.T에서 0일 MBD 시작일부터 28일 까지 꾸준히 기능이 회복되고 있는 것을 확인 하였다. tMCAO 그룹에 비해 각 투여군의 기능적 회복은 향상 되었지만 (p<0.001) 각각의 투여군에서 saline과 EPO 투여 간의 차이는 없었고, 복강 내 EPO 투여 군과 국소적 EPO 투여 군 간에도 차이가 나지 않았다(Fig. 5A and 5B). 로타로드검사는 7일 까지는 tMCAO 그룹과 유의성(p<0.001)을 띄며 증가하였지 만 14일부터 28일까지 tMCAO 그룹과 차이 없이 계속해서 감소하는 것을 확인 하였다. 로타로드 기록을 신뢰하기 어렵기 때문에 로타로드 기록을 뺀 나머지 mNSS와 A.R.T를 통해 기능적 회복을 확인하였다.G. 투여방법에 따른 신생혈관생성 효과
전 조건화 된 모야모야 동물모델에서 신생혈관생성 효과를 확인하기 위해 혈관의 밀도를 측정하였다. tMCAO 그룹은 수술 후 28일에 뇌조직을 얻었고, 나머지 그룹들은 MBD 후 28일에 뇌조직을 얻었다. 우리는 대뇌피질의 뇌경 색 주변부를 측정하였다. tMCAO 그룹과 비교하여 모든 전조건화 모델에서 혈 관의 밀도가 증가가 되었지만, EPO 투여방법에 따른 혈관의 밀도는 차이가 없 었다(Fig. 7).Fig. 6. Comparison of neurological behaviors in EPO administration groups. They were
sequentially carried out -2d, -1d, 0d, 1d, 7d, 2w, 3w, 4w after mechanical barrier of disruption procedure. (A) The modified neurological severity score (mNSS), (B) adhesive removal test (A.R.T), and (C) Rotarod treadmill test. (D) treatment status of each group. (p*<0.05, p**<0.001, p***<0.0001, vs. MCAO)
20x
Fig. 7. Comparison of angiogenic effect in EPO administration groups. Representative
immunoreactivite of brain vascular at 28 days after MBD. Representative photomicrographs demonstrating the density of blood vessels in the perilesional cortex region ((A)–(E)). Vascular density measurement (ipsilateral peri-infarct area/contralateral area) x 100.
A,a : tMCAO; B,b: PreC-tMCAO+MBD+Saline(i.p); C,c: PreC-tMCAO+MBD+EPO(i.p); D,d : PreC-tMCAO+MBD+Saline(local); E,e : PreC-tMCAO+MBD+EPO(local);
20x 20x
20x 20x
H.
투여방법에 따른 신경보호 효과
신경보호 효과를 확인하기 위해 뇌경색 크기를 측정하였다. tMCAO 그룹은 MCAO 수술 후 28일에 뇌조직을 얻었으며, 나머지 모든 그룹들은 MBD 후 28 일에 뇌조직을 얻었다. tMCAO 그룹과 뇌경색 크기를 비교하여, 복강 내 투여 군이 뇌경색의 크기가 감소가 되었지만, 두피내 국소적 투여 군에서는 뇌경색 의 크기가 차이가 없었다. 또한, 복강 내 투여와 두피내 국소적 투여 군간에는 뇌경색 크기의 차이가 없었다(Fig. 8).Fig. 8. Comparison of neuroprotective effect in EPO administration groups. Representative
pictures and quantification of brain tissue loss volume at 28 days after MBD. Brain tissue loss picture and infarct volume through cresyl violet staining (A, B). This staining was performed by cresyl violet and indirect volume measurement ((collateral hemisphere - ipsilateral hemisphere) x 2). (p*<0.05, p**<0.001, vs. tMCAO) a : tMCAO; b: PreC-tMCAO+MBD+Saline(i.p);
c: PreC-tMCAO+MBD+EPO(i.p); d : PreC-tMCAO+MBD+Saline(local); e : PreC-tMCAO+MBD+EPO(local)
IV. 고찰
우리는 이전 연구자들의 모야모야 동물모델의 한계점인 만성 저관류 상태를 유지하고 윌리스 환이 변형되는 모야모야 동물모델을 확립하였고, 확립된 모야 모야 동물모델을 통해 물리적장벽파괴술과 에리트로포이에틴의 투여방법에 따 라 기능적 회복이 향상 되는 것을 확인하였다. 하지만, 뇌경색 크기 확인을 통 해 복강 내 투여 군 만이 신경보호효과가 있는 것을 확인하였지만, 국소적 투 여 군에서는 확인 할 수 없었다. 또한, 신생혈관생성에서는 복강 내 투여 군과 국소적 투여 군에서 일반적인 허혈성 뇌졸중 모델에 비해 혈관의 밀도가 증가 되었지만, 투여 방법에 따른 차이는 없었다. 지금까지 보고되었던 여러가지 모야모야 동물모델이 있었지만 각각의 한계점 이 있었다. 첫째 염증 및 면역 복합체 관련 동물모델이 보고되어 있었다. 하지 만 본 모델은 내경동맥의 말단 부분에 심한 협착 병변을 재현하지 못하고 모야 모야병에서 특징적인 뇌의 만성 저관류 상태를 보여주지 못했다(Ezura et al. 1992). 또한, 혈관 병변이 항상 나타나는 것이 아니고 일시적으로 나타났기 때 문에 임상 상황과 일치하지 않아 적절하게 사용될 수 없었다(Ezura et al. 1992). 이러한 이유로, 또 다른 연구자들이 면역반응과 동맥 폐색을 조합하여 동물모 델을 만들고자 하였지만, 색전 전후에 윌리스 환의 변화가 관찰되지 않아 대뇌 혈류량의 감소나 윌리스환 주변부위에서 발생되는 모야모야 혈관 등에 대한 정 보가 없었다(Kamata et al. 2003). 최근 모야모야병 환자로부터 분리 된 평활근 전 구 세포를 이용하여 시험관 모델이 시도되었지만, 이는 세포연구이고 생체 동 물 모델이 아니었기 때문에 임상적용에 어려움이 있었다(Kang et al. 2014). 또한, 모야모야병 유전자라고 알려진 RNF213 유전자가 결핍 된 쥐를 통해 동물모델 을 만들었지만, 이 역시 핵심 병태생리적 문제점인 윌리스 환의 변화를 보여주 진 못했다(Ito et al. 2015). 모야모야병의 핵심적인 병태생리적 변화를 (1) 만성 두 개강 내 허혈상태로 인한 국소적 허혈성 전조건화 상태 및 (2) 병리학적 기저부위 측부혈관인 윌리스환 변형 발생상태 라고 가정하였다(Suzuki and Takaku, 1969). 따라서, 우리는 실제 임상상황에 가장 흡사한 모델을 만들기 위해 내경 동맥을 결찰하여 두개강 내 만성 저관류 상태를 유지한 후 이 부위에 뇌경색을 유도하여 허혈성 변화가 적게 일어나는 허혈성 전 조건화 상태를 구축하고 이 에 따른 윌리스 환의 변화를 관찰할 수 있는 모야모야 동물모델을 확립고자 하 였다. 먼저 허혈성 전조건화가 충분히 발현되어 있는 개체를 선별하기 위해 7 일, 14일, 21일 동안 만성 저관류를 유지한 뒤 MCAO를 실시하여 허혈성 변화 를 확인한 결과, 14일 동안 전 조건화 개체가 감소된 뇌경색과 및 높은 생존률 등 허혈성 변화가 현저히 줄어 드는 개체로 확인되었다(Khoury et al. 2016). 또한 이 개체의 윌리스 환의 변화를 확인한 결과, 가짜 수술 개체와 비교하여 허혈 성 전조건화 개체에서 윌리스환 주변부에 위치한 주요 혈관인 ICA, MCA, PcomA, BA의 직경이 현저하게 감소되는 것을 확인하였다(Ke.Lee). 즉, 14일 전조 건화 모델은 위에 가정한 2가지 모야모야병의 핵심적인 병태생리적 변화를 보 여주는 모델이다. 위 모델은 전 조건화 기간에 따른 신경보호 효과를 확인하기 위해 경색증의 크기 정도를 정확히 확인 할 수 있는 pMCAO를 실시하였으나, 혈관생성 및 발 달을 장기간 확인하기에 사망률이 높아 적절치 않기 때문에 tMCAO 모델을 택 하여 본 실험을 진행하였다(Wells et al. 2012). 우리는 약물의 효과를 확인하기 위 해선 적정수준의 손상 동물모델이 필요한데, 적정 수준의 손상을 가진 동물을 확인하기 위해선 쥐를 희생 시켜야만 확인 할 수 있었다. 그래서 우리는 간접 지표인 mNSS, CBF를 사용하여 직접지표인 뇌경색 크기 정도를 간접적으로 확 인 하여 적정 손상 동물을 선별하였다. 3가지 방법을 추합한 결과 mNSS는 10점 이상(Chen et al. 2014), CBF는 MCAO 후의 CBF가 기준점에 비해 60%이하가 되는 동물에게서만 적정수준의 손상이 있는 것을 확인 하여 간접지표에 부합하는 동 물들만 선별하였다. Wang 등의 논문에 의하면 MCAO 수술 후에 CBF가 약 60% 미만으로 감소하고 mNSS도 10점 이상이 되는 것이 부합하여 다음 단계의 실
험을 진행하였다(Wang et al. 2003). 두 번째 단계에서 우리는 확립된 모야모야 동물모델을 통해 물리적장벽파괴 술과 에리트로포이에틴의 투여방법에 따른 신경보호와 신생혈관생성 효과에 대 해 확인하고자 하였다. EPO의 투여 시간은 신경보호에 가장 효과적인 tMCAO 후 2시간째에 투여방법에 따라 각각 투여하였다(Jia et al. 2010). 두 개강 내-외의 혈관인 내경동맥의 분지와 외경동맥의 분지들은 머리뼈와 뇌막이라는 물리적 장벽에 의해 서로 연결이 될 수 없기 때문에 두개강 내-외의 환경을 이어주는 간단한 시술인 물리적장벽파괴술과 신생혈관유도제가 동반되어야만 원하는 부 위의 신생혈관생성이 유도 될 수 있다(McLaughlin and Martin, 2014). 많은 연구자 들에 의해 신생혈관생성 유도제인 EPO를 허혈성 뇌졸중 모델에서 많이 연구되 어 왔다(Li et al. 2007). EPO 투여 후 혈관 성정 인자를 증가시켜 신생혈관생성을 유도하고 여러 가지 긍정적인 효과들에 의해 신경보호효과도 있다고 보고 되어 있지만(Aluclu et al. 2007), 폐나 BBB의 통과가 어려워 여러 물리적 장벽에 의하 여 효과를 충분하게 나타내지 못했다(Banks et al. 2004). 이전 연구에서 태어난 지 7일된 백서모델에 허혈성 저산소증 상태에서 EPO를 국소적으로 투여하면 복강 내 투여에 비해 뇌척수액과 혈장에서 EPO의 적혈구 용적률의 수치와 이 온 농도가 훨씬 더 오래 지속되었다(Johnson et al. 1999). EPO를 조직적으로 복강 내 투여를 하였을 때, 기능적 회복이 향상되고 뇌 조직 손실을 막고 뉴런과 신 경아교세포의 생존률을 높이는 신경보호 효과뿐만 아니라(Wang et al. 2017), 신경 혈관 손상도 회복시켜 신생혈관생성 역할도 한다(Zhou et al. 2015). 이와 유사하 게 EPO를 국소적으로 피하 투여를 하였을 때, 피질충격손상 백서모델에서 뇌 손상의 크기도 감소시키고 뇌혈관 기능을 회복시킬 뿐만 아니라(Cherian et al. 2011), 뇌에서 시간에 따라 허혈성 저산소증 상태에 신생혈관생성 입자들의 발 현으로 미세혈관의 밀도를 증가시키는 역할도 한다(Yu et al. 2014). 또한 혈액투 석환자에서 빈혈을 치료하기 위해 EPO가 사용 되는데 헤모글로빈 의 수치와 적혈구 용적률의 수치의 증가량이 비슷한 효과를 낼 때, 조직적으로 투여 보다
국소적 투여에서 사용되는 EPO의 농도가 감소되어, 이는 곧 임상환자들의 약 처방비용이 감소되는 장점이 있다(Besarab et al. 2002). 그렇기 때문에, 우리는 조 직적 투여인 복강내 투여보다 국소적 투여인 두피내 투여에서 더 효과적일 것 이라 판단했다. 하지만, 우리는 투여방법에 따른 신경보호 효과와 신생혈관 생성효과를 확인하였고 PreC-tMCAO 복강 내 투여 군 만이 뇌 손실이 감소 되었고 국소적 투여 그룹에서는 큰 차이가 나지 않았다. 신생혈관생성 효과를 확인 하였을 때, EPO의 각 투여 그룹간에는 차이는 없었다. 또한, 우리는 EPO를 단회용량으로 투여하였는데 많은 EPO의 연구에서 단회용량으로 투여하여도 신경보호와 신생혈관생성에 많은 효과가 있다고 알려져 있다(Chi et al. 2008, Aluclu et al. 2007). 하지만, 또 다른 실험에서 단회용량이 아닌 다수의 용량으로 투여하게 되면 신경보호뿐만 아니라 신생혈관생성에도 효과가 있다고 보고되어 있다(Ning et al. 2011, Pellegrini et al. 2013). 이 뿐만 아니라, 단회용량과 다수 용량 투여를 비교하였을 때도 단회 투여보다 다수 투여가 더 신경보호와 신생혈관생성 더 효과적이라고 보고되어 있다(Xiong et al. 2010). 우리의 실험이 단회투여이고 투여방법에 따라 효과의 차이가 없었다. 그렇기 때문에, EPO의 투여방법뿐만 아니라 투여 횟수에 있어서도 많은 연구가 필요 할 것이다.
V. 한계점
첫 번째, 허혈성 전조건화 동물모델을 확립하고자 할 때, 모야모야병의 특징 인 모야모야 혈관을 확인하지 못했기 때문에(Baltsavias et al. 2015) 이를 확인하 기 위해 CT, MRI, MR 등을 이용한 혈관 조영술을 통해 확인이 필요하다. 두 번 째, 허혈성 전조건화 모델에서 외적 기준만으로 판단하기보다 더 정확한 신생 혈관지표(Vascular endothelial growth factor)와 염증지표(Interleukin, Tumor necrosis factor)와 혈관확장지표(Nitric oxide)등 분자지표를 확인해야 한다(Koch et al. 2014). 세 번째, 뇌경색 지역이 완전히 수축되어 없어져 반음영반구에 효과가 없었는데, 이를 개선하기 위해 뇌경색의 크기를 줄이는 MCA 폐색 시간을 줄여 반음영반구에 MBD의 효과가 나타날 수 있게 한다(Wells et al. 2012). 네 번째, 뇌와 혈액에서 EPO의 잔존량과 조혈 검사를 통해 EPO가 정확히 투여가 되었 는지 확인해야 한다(Statler et al. 2007).
VI. 결론
우리는 만성 저관류 상태를 유지하고 윌리스 환의 변화가 있는 허혈성 전조건화 모야모야 동물모델을 확립하였다. 비록 EPO 의 투여방법에 따른 신경보호와 신생혈관생성은 차이가 없었지만 이를 개선하기 위한 동물모델의 수정과 EPO 의 투여횟수의 변화를 준다면 투여방법에 따른 효과가 있을 것으로 기대한다.VII. 참고문헌
1. Aluclu, M. U., Acar, A., Guzel, A., Bahceci, S. & Yaldiz, M. 2007. Evaluation of Erythropoietin Effects on Cerebral Ischemia in Rats. Neuro Endocrinol Lett, 28, 170-4.
2. Arcasoy, M. O. 2010. Non-Erythroid Effects of Erythropoietin. Haematologica, 95, 1803-5.
3. Baltsavias, G., Khan, N., Valavanis, A., 2015. The collateral circulation in pediatric moyamoya disease. Childs Nerv Syst, 31, 0256-7040.
4. Besarab, A., Reyes, C. M. & Hornberger, J. 2002. Meta-Analysis of Subcutaneous Versus Intravenous Epoetin in Maintenance Treatment of Anemia in Hemodialysis Patients. Am J Kidney Dis, 40, 439-46.
5. Blauwblomme, T. & Lemaitre, H. 2016. Cerebral Blood Flow Improvement after Indirect Revascularization for Pediatric Moyamoya Disease: A Statistical Analysis of Arterial Spin-Labeling Mri. 37, 706-12.
6. Chen, C. C., Chang, M. W., Chang, C. P., Chan, S. C., Chang, W. Y., Yang, C. L. & Lin, M. T. 2014. A Forced Running Wheel System with a Microcontroller That Provides High-Intensity Exercise Training in an Animal Ischemic Stroke Model. Braz J Med Biol Res, 47, 858-68.
7. Chen, J., Li, Y., Wang, L., Zhang, Z., Lu, D., Lu, M. & Chopp, M. 2001.
Therapeutic Benefit of Intravenous Administration of Bone Marrow Stromal Cells after Cerebral Ischemia in Rats. Stroke, 32, 1005-11.
8. Cherian, L., Goodman, J. C. & Robertson, C. 2011. Improved Cerebrovascular Function And Reduced Histological Damage With Darbepoietin Alfa
Administration After Cortical Impact Injury In Rats. J Pharmacol Exp Ther, 337, 451-6.
9. Chi, O. Z., Hunter, C., Liu, X. & Weiss, H. R. 2008. Effects of Erythropoietin on Blood-Brain Barrier Disruption in Focal Cerebral Ischemia. Pharmacology, 82, 38-42.
to Induce Immune-Mediated Cerebral Arterial Injury for an Experimental Model Of Moyamoya Disease. Childs Nerv Syst, 8, 263-7.
11. Freret, T., Valable, S., Chazalviel, L., Saulnier, R., Mackenzie, E. T., Petit, E., Bernaudin, M., Boulouard, M. & Schumann-Bard, P. 2006. Delayed
Administration of Deferoxamine Reduces Brain Damage and Promotes Functional Recovery after Transient Focal Cerebral Ischemia in the Rat. Eur J Neurosci, 23, 1757-65.
12. Granger, D. N. & Kvietys, P. R. 2017. Reperfusion Therapy-What'S With the Obstructed, Leaky and Broken Capillaries? Pathophysiology.
13. Ito, A., Fujimura, M., Niizuma, K., Kanoke, A., Sakata, H., Morita-Fujimura, Y., Kikuchi, A., Kure, S. & Tominaga, T. 2015. Enhanced Post-Ischemic
Angiogenesis in Mice Lacking Rnf213; A Susceptibility Gene For Moyamoya Disease. Brain Res, 1594, 310-20.
14. Jia, L., Chopp, M., Zhang, L., Lu, M., Zhang, Z. 2010. Erythropoietin in
combination of tissue plasminogen activator exacerbates brain hemorrhage when treatment is initiated 6 hours after stroke. Stroke, 0039-2499.
15. Johnson, C. A., Wakeen, M., Taylor, C. A., 3Rd, Zimmerman, S. W., Burkart, J., Bhattacharya, A. & Kosorok, M. R. 1999. Comparison of Intraperitoneal and Subcutaneous Epoetin Alfa in Peritoneal Dialysis Patients. Perit Dial Int, 19, 578-82.
16. Kamata, I., Terai, Y. & Ohmoto, T. 2003. Attempt To Establish An Experimental Animal Model Of Moyamoya Disease Using Immuno-Embolic
Material--Histological Changes Of The Arterial Wall Resulting From Immunological Reaction In Cats. Acta Med Okayama, 57, 143-50.
17. Kang, H. S., Moon, Y. J., Kim, Y. Y., Park, W. Y., Park, A. K., Wang, K. C., Kim, J. E., Phi, J. H., Lee, J. Y. & Kim, S. K. 2014. Smooth-Muscle Progenitor Cells Isolated From Patients With Moyamoya Disease: Novel Experimental Cell Model. J Neurosurg, 120, 415-25.
18. Kapu, R., Symss, N. P., Cugati, G., Pande, A., Vasudevan, C. M. & Ramamurthi, R. 2010. Multiple Burr Hole Surgery As A Treatment Modality For Pediatric
Moyamoya Disease. J Pediatr Neurosci, 5, 115-20.
19. Koch, S., Della-Morte, D., Dave, K. R., Sacco, R., L. Perez-Pinzon, M. A. 2014. Biomarkers for ischemic preconditioning: finding the responders. J Cereb Blood Flow Metab, 34, 933-41.
20. Li, Y., Lu, Z., Keogh, C. L., Yu, S. P. & Wei, L. 2007. Erythropoietin-Induced Neurovascular Protection, Angiogenesis, and Cerebral Blood Flow Restoration after Focal Ischemia in Mice. J Cereb Blood Flow Metab, 27, 1043-54.
21. Li, Z., Kong, L., Han, G., Li, G., Feng, S., Liu, Y. & Jin, F. 2015. [Treatment of Moyamoya Disease by Superficial Temporal Artery-Middle Cerebral Artery Anastomosis]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 95, 3501-4.
22. Liu, C. H., Lin, J. R., Liou, C. W., Lee, J. D., Peng, T. I., Lee, M. & Lee, T. H. 2017. Causes of Death in Different Subtypes of Ischemic and Hemorrhagic Stroke. Angiology, 3319717738687.
23. Mclaughlin, N. & Martin, N. A. 2014. Effectiveness of Burr Holes for Indirect Revascularization in Patients with Moyamoya Disease-A Review of the Literature. World Neurosurg, 81, 91-8.
24. Natori, Y., Ikezaki, K., Matsushima, T. & Fukui, M. 1997. 'Angiographic
Moyamoya' Its Definition, Classification, and Therapy. Clin Neurol Neurosurg, 99 Suppl 2, S168-72.
25. Ning, R., Xiong, Y., Mahmood, A., Zhang, Y., Meng, Y., Qu, C. & Chopp, M. 2011. Erythropoietin Promotes Neurovascular Remodeling And Long-Term Functional Recovery In Rats Following Traumatic Brain Injury. Brain Res, 1384, 140-50.
26. Oh, S. H., Choi, C., Chang, D. J., Shin, D. A., Lee, N., Jeon, I., Sung, J. H., Lee, H., Hong, K. S., Ko, J. J. & Song, J. 2015. Early Neuroprotective Effect with Lack of Long-Term Cell Replacement Effect on Experimental Stroke after Intra-Arterial Transplantation of Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells. Cytotherapy, 17, 1090-103.
27. Pellegrini, L., Bennis, Y., Guillet, B., Velly, L., Garrigue, P., Sabatier, F., Dignat-George, F., Bruder, N. & Pisano, P. 2013. Therapeutic Benefit of a Combined
Strategy Using Erythropoietin and Endothelial Progenitor Cells after Transient Focal Cerebral Ischemia in Rats. Neurol Res, 35, 937-47.
28. Piao, J., Wu, W., Yang, Z. & Yu, J. 2015. Research Progress of Moyamoya Disease in Children. Int J Med Sci, 12, 566-75.
29. Rozas, G., Guerra, M. J. & Labandeira-Garcia, J. L. 1997. An Automated Rotarod Method for Quantitative Drug-Free Evaluation of Overall Motor Deficits in Rat Models of Parkinsonism. Brain Res Brain Res Protoc, 2, 75-84.
30. Scott, R. M. & Smith, E. R. 2009. Moyamoya Disease and Moyamoya Syndrome. N Engl J Med, 360, 1226-37.
31. Suzuki, J. & Takaku, A. 1969. Cerebrovascular "Moyamoya" Disease. Disease Showing Abnormal Net-Like Vessels in Base of Brain. Arch Neurol, 20, 288-99. 32. Statler, P. A. McPherson, R. J. Bauer, L. A. Kellert, B. A. Juul, S. E. 2007.
Pharmacokinetics of high-dose recombinant erythropoietin in plasma and brain of neonatal rats. Pediatr Res, 6, 671-5
33. Toni, D., Di Angelantonio, E., Di Mascio, M. T., Vinisko, R. & Bath, P. M. 2014. Types of Stroke Recurrence in Patients with Ischemic Stroke: A Substudy From the Profess Trial. Int J Stroke, 9, 873-8.
34. Wang, R., Li, J., Duan, Y., Tao, Z., Zhao, H. & Luo, Y. 2017. Effects Of
Erythropoietin on Gliogenesis during Cerebral Ischemic/Reperfusion Recovery in Adult Mice. Aging Dis, 8, 410-419.
35. Wang, X., Xu, L., Wang, H., Grzanna, R., Zhan, Y., Knabb, R. M., Luettgen, J. M., Bozarth, T. A., Galemmo, R. A., Wong, P. C., Bernard, R., Vargas, H., Chopp, M., Friedman, S. M. & Feuerstein, G. Z. 2003. Inhibition Of Factor Xa Reduces Ischemic Brain Damage After Thromboembolic Stroke In Rats. Stroke, 34, 468-74. 36. Wells, A. J., Vink, R., Blumbergs, P. C., Brophy, B. P., Helps, S. C., Knox, S. J. & Turner, R. J. 2012. A Surgical Model of Permanent and Transient Middle Cerebral Artery Stroke in the Sheep. Plos One, 7, E42157.
37. Xiong, Y., Mahmood, A., Meng, Y., Zhang, Y., Qu, C., Schallert, T. & Chopp, M. 2010. Delayed Administration Of Erythropoietin Reduces Hippocampal Cell Loss, Enhances Angiogenesis And Neurogenesis, And Improves Functional Outcome
Following Traumatic Brain Injury In Rats: Comparison Of Treatment With Single Dose And Triple Dose. J Neurosurg, 113, 598-608.
38. Yu, J. H., Seo, J. H., Lee, J. E., Heo, J. H. & Cho, S. R. 2014. Time-Dependent Effect of Combination Therapy with Erythropoietin and Granulocyte Colony-Stimulating Factor in a Mouse Model of Hypoxic-Ischemic Brain Injury. Neurosci Bull, 30, 107-17.
39. Zhou, Z., Wei, X., Xiang, J., Gao, J., Wang, L., You, J., Cai, Y. & Cai, D. 2015. Protection of Erythropoietin against Ischemic Neurovascular Unit Injuries through the Effects of Connexin43. Biochem Biophys Res Commun, 458, 656-62.
VIII. ABSTRACT
Angiogenesis and neuroprotection according to the administration
methods of erythropoietin and Mechanical Barrier Disruption on
ischemic rat model
Yong Jin Kwon
Department of Neurosciences
The Graduate School, Ajou University
(Supervised by Professor Ji Man Hong)
Background and Purpose: Moyamoya disease is a common cerebrovascular disease in Asian populations. It caused progressive stenosis of willisian circle and the internal carotid artery of the cerebral vessels, (1) chronic hypoperfusion intracranial state and (2) vascular changes in the periphery circle of Willis which is an intracranial collateral vessel. Therefore, it is known that the only treatment is to directly connect blood vessels in the intracranial region and the extracranial region, or indirectly to facilitate the revascularization of the blood vessels. Since the experimental model of the disease developed so far fails to sufficiently express the characteristic clinical features, there are many limitations in understanding the mechanism of onset to the disease or developing therapeutic methods. It is well known that the factors related to the neuroprotective effect in the blood or cerebrospinal fluid of patients with Moyamoya disease, resulting in 'ischemic tolerance' in which ischemia is reduced when a new stroke occurs.Therefore, the first objective of this study is to establish an experimental animal with the above two characteristics, with neuroprotective effect on acute ischemic stroke and ischemic preconditioning. In addition, we evaluated angiogenesis and neuroprotection according to the administration methods of erythropoietin, which has the
effect of promoting angiogenesis, in mechanical barrier disruption, which is the minimally invasive surgery to promote revascularization
Methods: Step 1_To establishment of an ischemic preconditioned animal model, bilateral internal carotid occlusion was performed for 1-3 weeks and then the middle cerebral artery temporarily occluded for 90 minutes to find the cerebral infarction area was the smallest and the highest survival rate. We also compared the cerebral blood flow, behavioral tests, and cerebral infarct size correlations to select the suitable animal model and detected blood vessel change in the circle of willis. Step 2_ The establish animal model was temporarily occluded in the right middle cerebral artery for 90 minutes and then erythropoietin was administered single dose(5000 U / kg) intraperitoneally and locally to the scalps 2 hours after the occlusion. The functional recovery, neuroprotective and angiogenesis effect were compared according to the site of administration methods.
Results: Step 1_When comparing the duration of preconditioning, 2 week ischemic condition animals with the lowest cerebral infarct size (167mm3) and the highest survival rate (100%). We selected as the final model in subjects who underwent bilateral internal carotid occlusion for 2 weeks. The suitable animal model was considered to be preconditioned and selected as the final model because of its characteristic that cerebral infarction occurs only animal whose blood flow is less than 60% and neurological behavior score is over 10 points. There was a decrease (p = 0.05) in the major vessels around the Willis circle (internal carotid artery, posterior communicating artery, middle cerebral artery, and basilar artery) in the selected final model compared to the sham model. Step 2_Comparing the vascular density of the model with occlusion of the right middle cerebral artery for 90 minutes (79%), the vascular density was increased (91%, p=0.005) in all the administration groups of erythropoietin, but there was no difference between the intraperitoneal administration and the local administration in the scalp. Comparing the size of cerebral infarcts in the animal model as in the previous experiment (246mm3), it was shown that the ischemic preconditioning model had a neuroprotective effect in the intraperitoneal administration group of erythropoietin with a decrease in cerebral infarct size
(142mm3). However, in the local administration in the scalp group (198mm3), the size of the cerebral infarction was similar and the neuroprotective effect was not proved.
Conclusion: We established an ischemic preconditioned animal model with hypoperfusion status and changes in the peripheral vessels of the Willisian Circle. In this model, there was no difference in anigogenic effect according to the mechanical barrier disruption and erythropoietin single dose administration and methods. However, since the intraperitoneal administration was effective only for the neuroprotection, multi dose administration of erythropoietin I expect it will work.
