성 성 성 성 상 상 상 상 세 세 세 세 포 포 포 포 의 의 의 의 활 활 활 활 성 성 성 성 화 화 화 화 에 에 에 에 따 따 따 따 른 른 른 른 J J J J A A A A K K K K 2 2 2 2 저 저 저 저 해 해 해 해 제 제 제 제 인 인 인 인 A A A A G G G G 4 4 4 4 9 9 9 9 0 0 0 0 의 의 의 의 효 효 효 효 과 과 과 과 고 고고 고 기 기기 기 영 영영 영 2 2 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6 년 년 년 년 도 도 도 도
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의학 석사학위
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성상세포의
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-국문요약-성상세포의
성상세포의
성상세포의
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역할
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외상이나 뇌졸중 등과 같은 뇌손상이 일어난 부위에서 성상세포는 증식과
활성화가 되며,이것은 GFAP의 증가로 특징되어진다.이러한 astrogliosis과정에
서 활성화된 성상세포가 재생과정에 일부 보호작용을 보이고는 있지만,손상 후
나타나는 astrogliosis는 신경세포의 재생에 있어 방해 역할을 한다.활성화된 성
상세포는 여러 종류의 cytokine 과 염증물질들을 분비하며,이러한 성상세포의
활성화에 JAK2/STAT 경로가 관여한다고 알려져 있다.JAK2경로의 차단을 통 해 이러한 astrogliosis를 억제시킨다고 하나 아직까지 in vivo모델에서 확인된 바 없으며,특히 증식과정에 미치는 JAK2의 역할에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 연구에서는 in vivo cortical stab 손상모델을 이용하여 JAK2 억제제인
AG490을 전신 투여한 결과 손상 후 나타난 astrogliosis가 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.또한 성상세포의 증식작용에 미치는 JAK2역할을 알아보기
위하여,배양성상세포에서 thrombin으로 유도되는 증식과정에 나타나는 JAK2활
성화와 JAK2억제제 효과를 관찰하였다.
생후 1일된 ICR 생쥐를 사용하여 성상세포를 배양하였으며,뇌혈관장벽 손상 시 유입되어 mitogenicactivator로써 작용하는 thrombin(1U/ml)을 이용하
였다.Thrombin으로 유발되는 성상세포의 증식 지표로는 BrdU(+)세포를 측정
한 결과,AG490(3μM-30μM)은 농도 의존적으로 성상세포의 증식을 감소시켰
다.또한 다른 JAK2inhibitor인 J2I(25μM)를 처리한 경우도 성상세포의
있는 wound-healing model에서도 JAK2억제로 성상세포의 이동과 증식을 감 소되는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과들을 통해 본 연구는 뇌손상에 따른 astrogliosis는 성상세포의 증
식 조절을 통해 JAK2inhibitor를 이용하여 억제할 수 있음을 보여주고 있다.이
는 JAK2가 astrogliosis를 조절하는 데 있어 중요한 작용하는 것으로 생각된다.
차
차
차
례
례
례
국문요약․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ i 차 례․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ ii 그림 차례․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ v I. 서론 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 1 A.신경계에서 성상세포의 역할 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 1 B.신경계 손상 시 성상세포의 변화 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 2 C..연구목적 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 4 II.재료 및 방법․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 5 A.실험기기 및 시약 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 5 1.시약 및 재료 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․5 2.실험 기기 및 기구 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․6 B.연구 방법 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․6 1.실험동물모델-corticalstabwound․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․6 2.세포배양 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․6 3.Scrath-woundmodelinvitro․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 7 4.약물처리 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․7 5.형광면역조직화학검사법 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․7 6.proliferationassay․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․8 7.Westernblot․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․8 8.MTT assay를 이용하여 cellsurvival을 측정 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․8 9.통계처리 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․8 III.결 과․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․9A.대뇌피질의 in vivo stab wound injury 에서의 뇌혈관장벽의 파괴
․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 9 B.대뇌피질의 stab wound 손상으로 유도된 astrogliosis에 대한
JAK2저해제의 효과․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 10
C.배양 성상세포에서 serum 과 약물에 따른 viability영향․․․․․․․․12
D.성상세포의 증식에 있어 serum 이 미치는 효과․․․․․․․․․․․․․․․․14 E.Thrombin으로 유도된 성상세포의 증식 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․15 F.Thrombin으로 유도된 성상세포의 증식에 미치는 JAK2저해제들의 억제효과 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 15 G.Thrombin에 의해 유도된 성상세포 증식에 있어 JAK2활성화․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 19 H.invitro성상세포의 scratchwound모델에서 AG490의 효과․․․․․․․20 IV.고 찰 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․22 V.결 론 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 27 참고문헌 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 28 영문요약 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 34
그
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Fig.1.Corticalstabwoundinvolvesbreakdownof
theblood-brainbarrier․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 9 Fig.2.EffectsofAG490oninvivostabwoundmodel․․․․․․․․․․․․․․․․․․․11 Fig.3.Effectsofdrugsandserum oncellviability
inprimaryastrocytes․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 13 Fig.4.Serum dependent-astrocyteproliferation․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 14 Fig.5.Thrombininduced-astrocyte proliferation․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 16 Fig.6.EffectsofAG490Thromininducedastrocyteproliferation․․․․․․․․․․17 Fig.7.EffectsofotherJAK2inhibitor(J2I)onastrocyteproliferation․․․․18 Fig.8.Effectof AG490onthrombin-inducedJAK2phosphorylation
inprimaryastrocytes․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․19 Fig.9.EffectsofAG490onastrocytemigrationinvitro․․․․․․․․․․․․․․․․․21
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성상세포는 대뇌피질의 총 세포량의 20%를 차지할 만큼 많은 비중을 차지 하며,신경계에서 여러 가지 다양한 기능을 한다.안정 시 성상세포는 중추신경 계에서 신경세포의 미세 환경을 monitering하는데 있어 중요한 작용을 하며,신 경계 정보를 진행 또는 전달한다.이러한 성상세포는 뇌혈관장벽을 이루어 뇌를 외부환경으로부터 보호하는 역할을 갖으며, 염증 반응 시 혈액 세포로부터 중요 한 운반자로 작용하며 뇌혈관장벽을 통해 영양분을 공급해주고 지방산을 혈장으 로부터 뇌로 운반하여준다.또한 성상세포는 이온 항상성에 있어 아주 중요한 작 용을 하는데 그 작용으로 세포외의 K+농도 조절을 하며 세포외의 pH 그리고 세포외 부피 공간을 조절한다(Vesec등,2001;Bohn,2004;Fellin과 Carmigonoto,
2004).그들은 Cl-을 전기 화학적 농도구배로 세포 안으로 이동시키며 신경세포
의 활동에 의해 생성된 CO2 를 전환시켜주며 Na+,Ca2+ 그리고 voltagegated
channels이 성상세포의 막에 있어 신경세포의 활동으로 인한 과도한 K+을 재분
배하는데 중요한 역할을 한다.성상세포는 신경세포의 생존과 세포사멸를 일으키 는 neurotropicfactors와 cytokines의 주요한 원천일 뿐만 아니라 또한 그들은
그들 자신이 이러한 신경전달물질과 신경조절물질인 vasopressin intestinal
peptide(VIP),noradrenaline(NA),adenosine,GABA,그리고 glutamat와 같은 수용체를 가지고 있다(Fantl등,1993;Martinez-Salgado 등,2000;Tacconi등,
1998).또한 뇌의 발생기간 중에 생장할 수 있는 길을 형성하고,neurotropic
factors를 생성하며 neurotransmitters인 glutmate를 glutamine로 합성 분해,혈 관신생에 관여하며,macrophages와 같이 면역 반응에 관여한다.이러한 성상세 포는 뇌 손상 시 활성화되고 증식하여 손상된 중추신경계를 복구에 중요하게 작 용하며 synapticplasticity에 강하게 참여한다(Abrous등,2005).
B
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성상세포는 뇌손상 시 증식되고 형태적 변화가 일어나며,성상세포의 활성화
표식인 GFAP가 증가하게 되는데 이를 일컬어 astrogliosis또는 활성화 성상세
포라고 한다(Raivich 등, 1999). 이러한 reactive astrogliosis는 AIDS치매, inflammatory demyelinating dieases,acutetraumaticbrain injury,퇴행성 신경 질환인 알츠하이머와과 같은 많은 뇌질환에서 보여 진다(McGraw 등,2001; Krishnan등,2004).
Reactive 성상세포가 형성되는 단계는 다음과 같은데 우선 구조단백질인
GFAP발현이 증가하고,손상부위로 성상세포의 이동이 일어난다.이러한 과정이
통합되어 astrogliosis가 일어나 성상세포의 벽이 만들어진다. 그 실례로
Traumainjury나 stab woundlesion시 성상세포는 중추신경계를 손상시키는 다
양한 진행과정에 관여하며,빠르게 glialscarring을 형성하고,손상된 신경조직으
로의 이동이 일어나게 된다. 이러한 손상된 부위의 glialscar형성의 의미는 손
상된 부위로부터의 격리를 유도,손상된 신경세포에서 생성된 독성물질을 제거하
고 neurotrophic factor를 분비함으로써 CNS 의항상성을 유지를 도와준다고는
하지만,많은 질병에서 gliascar가 형성됨은 중추신경계의 신경세포의 기능,신
경재생 그리고 axonal재생성을 방해한다고 알려져 있다.이러한 astrogliosis가
이로운지 해로운지는 아직까지 많은 논쟁 중이다. 뇌손상 시 뇌혈관장벽의 손상이 동반되며,이때 뇌가 외부환경에 노출되어 외부 여러 물질이 유입되는데 그중 thrombin 이 성상세포를 증식시키는 인자로 써 잘 알려져 있다.thrombin의 기능으로는 신호전달물질,혈액응고,조직회복에 관여한다고 알려져 있으며(Grand 등,1996),특히 뇌 손상 시에는 뇌혈관장벽을 통과하며 성상세포의 형태적 변화와 증식 그리고 endothelin분비를 유도한고 알
려져 있다(Grand 등,1996;Grabham 등,1995; Ehrenreich 등,1993).이렇게
thrombin으로 유도된 증식에 대한 신호전달계로는 Protease-activated
receptors(PAR)를 통해 MAPK pathway 와 연관이 있으며,그 중 ERK1/2 가
G-proteincoupledreceptor로써 JAK/STAT pathway를 활성화 시킨다 (Bhat등, 1994; Greene 등,2000; Rodriguez-Linares 등,1994).Cytoplasmic tyrosine kinase의 family 로써 초기에 인터페론감마 시그널 receptor로써 알려져 왔으며 (Ihle등,1995;Schindler등 1995),JAK 은Janus family tyrosinekinase로써
지금까지 알려진 바로는 Jak1,2,3andTYK2가 있고 STAT 은 신호전달자로 그
리고 Transcriptionactivators기능을 한다고 알려져 있다(Dell'Alban등 ,2001).
그 기능으로는 세포의 성장 과 생존 apoptosis,방어,그리고 세포증식과 분화에
영향을 준다고 알려져 있다(Jove등 2000).그러나 이러한 JAK/STAT pathway 와 성상세포의 증식과 연관성에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다.
본 연구에서는 이와 같은 내용을 토대로 성상세포의 증식조절에 신경계
에 매우 중요함 확인 하였으며, 성상세포의 변화를 vitro상에서 thrombin을 이
용하여 확인하고자 하며,vivo상에서는 뇌 손상 시 뇌혈관장벽이 깨짐으로써 일
어나는 성상세포의 변화를 관찰하고,또한 vitro에서 손상부위로의 성상세포의 이
동과 이러한 변화양상들에 JAK2inhibitor- AG490이 관여하는지에 대해 알아보
Ⅱ
Ⅱ
Ⅱ.
.
.실
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실험
험
험재
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재료
료
료 및
및
및 방
방
방법
법
법
AAA...실실실험험험기기기기기기 및및및 시시시약약약 1
11...시시시약약약 및및및 재재재료료료
Eaglesminimalessentialmedium (MEM,Gibco-BRL,GrandIsland,NY) Fetalbovineserum(FBS,Gibco-BRL,GrandIsland,NY)
Horseserum(HS,Gibco-BRL,GrandIsland,NY) Glutamine(Bio-Whittaker)
Epidermalgrowthfactor(EGF,Sigma)
0.25% Trypsin(Gibco-BRL,GrandIsland,NY) BrdU(Sigma)
Thromin(SigmaSt,Louis,MO)
GFAP antibody(SigmaSt,Louis,MO) BrdU antibody(SigmaSt,Louis,MO)
HRP anti-rabbitantibody(Cellsignalingtechnology,Beverly,MA) HRP anti-mouseantibody(Cellsignalingtechnology,Beverly,MA) Biotinylatedanti-rabbitantibody
FITC-labeledanti-rabbitIgG antibody(MolecularProbe,SanDiego,CA) Texred-labeledanti-rabbitIgG antibody(MolecularProbe,SanDiego,CA) Hoechest33258(Sigma,St,Louis,MO)
222...실실실험험험 기기기기기기 및및및 기기기구구구
Centrifuge(vision,seoul,korea) Cleanbench(Sam Ki,Seoul,Korea) Micropiptte(Gilson,France)
Microscope(Nikon,Japan)
ConfocallaserscanningmicroscopLSM LAS imageanalyzer(Kodak,Japan) BBB...연연연구구구 방방방법법법
111...세세세포포포배배배양양양
성상세포(astrocyte)배양 생후 1일-3일 ICR 신생쥐를 이용하여 ice로 10분 간 기절시킨 후 신생쥐의 뇌를 적출한다.뇌막을 제거한 대뇌피질부위를 해부하 여 trypsin용액에 넣은 후 10분간 배양하고 원심 분리한다.한 plate에 1.0대뇌반 구의 밀도로 10% fetalbovineserum (Hyclone)과 10% horseserum (Gibco)이 들어간 plating 배지를 준비한 후 세포 현탁액을 만들어 plating한다.7일째 배양 한 후 실험에 사용하였다.이때 실험에 들어가기 전 plate를 툭툭 쳐서 microglia 를 제거한다.
222...실실실험험험동동동물물물모모모델델델---cccooorrrtttiiicccaaalllssstttaaabbbwwwooouuunnnddd
수컷 ICR 30g~35g짜리를 실험에 사용하였으며 ,약물주사 및 마취주사는 복
강내 투입하였으며,마취제로는 pentobarbitalsoudium을 이용하여 마취 후 수술
을 시행하였다.쥐의 두개골을 중간에서 오른쪽 대뇌 반구쪽을 드릴로 뇌막의 손 상 없이 일정하게 열어 NC 삽입물을 넣었다.NC 는 nitrocellulose(3mm X
3mm)로 실험전 coating을 없애기 위해 끓인 후 멸균하여 건조 시킨 후 실험에
333...SSScccrrraaatttccchhh---wwowoouuunnndddmmmooodddeeellliiinnvnvviiitttrrrooo(((mmmiiigggrrraaatttiiiooonnnaaassssssaaayyy)))
배양한지 7일째 되는 성상세포에 10uM tip을 이용하여 흠집을 일정하게 주
어 wound를 만들어 시간별로(0,3,6,18,24시간)성상세포의 이동을 관찰하였으며, 성상세포의 marker인 GFAP로 염색하였다.
444...약약약물물물처처처리리리
본 실험에서 사용한 약물로는 Thrombin을 0.3U/ml,1U/ml,3U/ml의 농도 로 사용하였으며 JAK2inhibitor로 AG490을(3μM,10μM,30μM)로 30분 전 처리로 사용하였으며,배지는 serum이 없는 MS 와 1%serum,10%serum 을 사용하였다. 555...형형형광광광면면면역역역조조조직직직화화화학학학검검검사사사법법법 성상세포의 활성과 증식 변화양상을 확인하고자 형광면역조직화학검사법을 이용하여 측정하였다.PDL 로 코팅하 coverglass위에 성상세포를 배양하여 세 포에 약물 처리한 PBS로 세척한 후 4% PFA(paraformaldehyde 로 고정하며,
4% PFA 고정 후 PBS로 세척 denaturation과정으로 2N Hcl로 denaturation을
1시간동안 상온에서 반응시키며,그 다음 바로 netralization 과정으로 0.1M
Na2B4O7(Sigma)으로 교체하여 중화시켜준다. 3% BSA가 포함된 PBS로
GFAP (1:400),BrdU(1:400)항체를 희석하여 세포와 반응시킨다.PBS로 세척한 후 형광을 띤 이차 항체와 반응시키고 confocallasermicroscopy (LSM)으로 발현양상을 확인하였다.
666...ppprrrooollliiifffeeerraraatttiiiooonnanaassssssaaayyy
S기에 DNA합성시 새로운 DNA 에 BrdU(Sigma)가 끼어들어가
proliferation을 측정지표로써 쓰인다.BrdU경우는 1%serum들어간 배지로 약물처
일하나, 4% PFA고정후 2N Hcl로 denaturation과정이 더 있다. 나머지는 Immunocytochemistry와 동일한 방법으로 한다.
777...WWWeeesssttteererrnnnbbblllooottt
각 조합의 세포 배양을 준비한 후,phosphatebuffered saline로 세척하고 미 리 차게한 proteinaseinhibitors를 포함하는 RIPA buffer를 첨가하여 단백질 시 료를 준비하고 단백질을 정량하여 running하고 PVDF membrane에 transfer하 고 5% non-fat dry milk를 이용하여 blocking한다.각각의 항체를 이용하여 membrane에 transfer된 단백질에 결합시키고 alkalinephosphatase가 붙어 있는 이차 항체를 결합시켜 BCIP/NBT로 단백질의 발현 변화를 확인한다.GelDoc
system (Bio-Rad)을 이용하여 변화된 단백질을 정량한다.
888...MMMTTTTTT aaasssssasaayyy를를를 이이이용용용하하하여여여 ccceeellllllsssuuurrrvvviiivvvaaalll을을을 측측측정정정
Cell viability를 측정하기 위한 방법으로 살아있는 세포의 활성도를
mitochondrialdehydrogenase가 solubleMTT를 water-insolubleformazan으로
바뀌는 것을 측정하는 것이다.배양세포에 MTT용액(5mg/ml)을 첨가한 후,2시
간동안 37℃ incubation한다.그 다음 200mlsolubilizationbuffer(5% aceticacid, 5% 1N-HCl,DMF를 1:1 혼합하고 20% SDS buffer를 첨가)를 넣어 ELISA reader로 540nm 파장으로 측정하여 결과를 얻는다.
999...통통통계계계처처처리리리
모든 자료는 평균 ±S.E.M으로 나타내었고 student'st-test로 통계 처리하여 P<0.05수준에서 유의성을 검증하였다.
I
I
II
I
II
I
I.
.
. 결
결
결 과
과
과
AAA...SSSeeerrruuummm과과과 약약약물물물에에에 따따따른른른 성성성상상세상세세포포포의의의 vvviiiaaabbbiiillliiitttyyy영영영향향향...
Serum이 세포의 증식에 매우 중요하게 작용하며 생존력에도 큰 영향
을 줌으로 10% serum ,1% serum,MS 별로 viability를 확인해 본 결과
serum 증가함에 따라 viability도 증가함을 보였다.Thrombin 의 경우 저 농도에서는 증식을 유발하지만 고농에서는 세포의 사멸이 된다는 보고를 토대로 thrombin 농도별(0.3U/ml,1U/ml,3U/ml)로 처리하였고,3U/ml에 서 유의성있게 viability 떨어짐을 확인할 수 있었다.JAK2저해제로 알려 진 AG490농도별(3 μM,10 μM,30 μM)과 또 다른 JAK2 저해제로 J2I
(50 μM)을 처리한 결과 viability 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 보였 다(Fig.1). B. B. B. B. 성성성상상상세세세포포포의의 증의 증증식식식에에에 있있있어어어 ssseeerrruuummm이이이 미미미치치치는는는 효효효과과과 성상세포에서 증식을 BrdU uptake 로 보았다.이는 24간전 세포를 동 일화 시켜준 후 그 다음 24h동안 새로이 합성된 DNA만을 보았으며, 형광면역조직화학검사법으로 염색하여 변화양상을 보았다. 그 결과 serum 없는 MS 상태에서는 성상세포의 새로운 증식이 거의 일어나지 않 음을 확인할 수 있었고,1%serum 의 경우 약간의 증가가 보였으며,10% 경우 거의 대부분의 세포들이 증식하고 있었다(Fig.2). CCC...TTThhhrrrooommmbbbiiinnn으으로으로로 유유유도도도된된된 성성성상상상세세세포포포의의의 증증증식식식 성상세포의 증식을 유도하는 thrombin을 농도별로 처리시 증식을 확 인하고자 하였으며,그 결과 thrombin 1 U/ml에서 유의성있게 증가하였
으며,thrombin 3U/ml경우 thrombin 1U/ml과 비슷한 증식률을 보였 다(Fig.3).
DDD...TTThhhrrrooommmbbibiinnn으으으로로 유로 유유도도도된된된 성성성상상상세세세포포포의의의 증증증식식식에에에 있있있어어 A어 AAGGG444990900의의의 효효효과과과
Thrombin 1 U/ml에서 성상세포의 증식이 증가함을 보고 이러한 증
식에 JAK2 가 어떻게 작용하는지를 알아보고자 JAK2 저해제인 AG490 (3μM,10 μM,30 μM)을 30분 전처리 후,thrombin 1 U/ml을 24시간 동 안 처리 후 관찰한 결과 thrombin으로 유도된 성상세포의 증식이 AG490 농도 의존적으로 억제 효과를 보였으며, AG490 (10 μM,30 μM)에서 유 의성 있게 성상세포의 증식을 억제함을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과 thrombin으로 유도된 성상세포의 증식에 JAK2 이 관여하고 있음을 알 수 있었다(Fig.4). EEE...다다다른른른 JJJAAAKKK222저저저해해해제제제인인인 JJJ22211처1처처리리리 시시시 성성성상상상세세세포포포 증증증식식식에에에 미미미치치치는는는 영영영향향향 J21 (50 μM)을 30분 전처리 후 thrombin을 24시간동안 하여 성상세 포의 BrdU 증가 양상에 J2I가 별다른 영향을 주지 않음을 볼 수 있었다 (Fig.5).
(((AAA))) (((BBB)))
FFFiiiggg... 111... EEEffffffeeeccctttsss ooofff dddrrruuugggsss aaannnddd ssseeerrruuummm ooonnn ccceeellllll vvviiiaaabbbiiillliiitttyyy iiinnn ppprrriiimmmaaarrryyy aaassstttrrrooocccyyyttteee...(A)Primary astrocyte cells were incubated with MS,1%serum and 10%serum medium for24h.10% serum increased cellviability (B)Cells wereincubatedwiththrombin(0.3U/ml,1U/ml,3U/ml),andAG490(3 μM, 10 μM,30 μM)in a dosedependentmanner.Thrombin 3 U/mldecreased cellviability.Cellviability was determined by measuring MTT assay with microplate reader(absorbance=540 nm). The activity was expressed as percentage over control.Values are expressed as mean ±S.E.M of four samples.(*p<0.05vs.control)
FFFiiiggg...222...SSSeeerrruuummm dddeeepppeeennndddeeennnttt---aaassstttrrrooocccyyyttteee ppprrrooollliiifffeeerrraaatttiiiooonnn...Primary astrocyte cells were incubated with MS,1%serum and 10%serum medium for 24h.The levels ofBrdU,Hoechstand GFAP protein were determined by flourescent intensityunderconfocalmicroscopeasdescribedinMaterialsandMethod.
(((AAA))) (((BBB)))
FFFiiiggg...333...TTThhhrrrooommmbbibiinnn iiinnndduduuccceeeddd---aaassstttrrrooocccyyytteteeppprrrooollliiifffeeerrraaatttiiiooonnn...Primary astrocytecells were incubated with MS,1%serum and 10%serum medium for 24h.The levels ofBrdU,Hoechstand GFAP protein were determined by flourescent intensityunderconfocalmicroscopeasdescribedinMaterialsandMethod. (A)Confocalmicroscopeimageand(B)BrdU uptakecellscounting (%ofCTL). Valuesareexpressedasmean ±S.E.M offoursamples.(*p<0.05vs.control)
(((AAA))) (((BBB)))
FFFiiiggg... 444... EEfEfffffeeeccctttsss ooofff AAAGGG444999000 TTThhrhrrooommmiiinnn iiindnndduuuccceeeddd aaasststtrrrooocccyyyttteee ppprrrooollliiifffeeerrraaatttiiiooonnn... Primary astrocytecellswerepreincubated with AG490(3μM,10μM,30μM) for30minbeforethrombin(1U/ml)treatment.At24hafterthrombin,cellsthe levels ofBrdU,Hoechstand GFAP protein were determined by flourescent intensityunderconfocalmicroscopeasdescribedinMaterialsandMethod. (A)Confocalmicroscopeimageand(B)BrdU uptakecellscounting (%ofCTL). Valuesareexpressedasmean±S.E.M offoursamples.(*p<0.05vs.control)
FFFiiiggg...555...EEfEfffffeeeccctttsss oooff of oottthhheeerrr JJJAAAKKK222 iiinnnhhhiiibbbiiitttooorrr ooonnn aaassstttrrrooocccyyyttteee ppprrrooollliiifffeeerrraaaiiitttooonnn... primary astrocytecellswerepreincubated with J2I(50μM)for30min before thrombin (1U/ml)treatment.At24h afterthrombin,cellsthelevelsofBrdU, Hoechstand GFAP protein were determined by flourescentintensity under confocalmicroscopeasdescribedinMaterialsandMethod.
FFF...대대대뇌뇌피뇌피피질질질의의의 ssstttaaabbb(((칼칼로칼로로찌찌찌른른른)))손손상손상상시시시 뇌뇌뇌혈혈관혈관관장장장벽벽벽의의의 파파괴파괴괴 iiinnnvviviivvvooo... 실험동물에서 뇌혈관 장벽이 파괴됨을 확인하기 위해 2% Evan'sblue -100ul를 손상주기 20분전 정맥에 처리하며,11짜리 blad 칼날을 사용하여 대뇌 피질에 손상을 준다.2시간 후 실험동물의 뇌를 꺼내어 관찰한 결과 손상을 준 부위의 뇌의 뇌혈관 장벽이 깨져 파란색으로 염색된 것을 확인 할 수 있었다 (Fig.6). GGG...대대대뇌뇌뇌피피피질질질의의 s의 sstttaaabbb손손손상상상 시시시 AAGAGG444999000의의의 효효효과과과 iiinnnvvviiivvvooo... 실험동물모델에서 뇌혈관 장벽이 파괴된 대뇌피질 손상 시 성상세포의 GFAP 변화양상과 AG490연관성을 보고자 하였다.본 모델에서 AG490은 손상 4시간 전 5mg/kg로 복강내로 주사하였으며,손상 후 3일 후 한번 더 주사 하였 다.뇌 손상 후 최종7일 후에 동물의 뇌를 꺼내어 면역화학조직검사를 수행 하였 다.그 결과 정상대조군과 복강내 AG490단독 처리한 경우 GFAP 염색이 되지 않았음을 볼 수 있었으며,뇌손상을 준군은 손상부위의 성상세포에 GFAP의 증 가와 형태변화를 관찰할 수 있었다.그러나 손상과 함께 AG490전처리 후처리한 군에서는 손상부위의 GFAP의 현저한감소와 형태변화를 확인 할 수 있었으며, 이러한 결과 JAK2가 AG490 이 성상세포의 증식과 활성에 중요하게 관여하고 있음을 알 수 있다(Fig.7). HHH...성성성상상상세세세포포포의의의 이이이동동동에에에 있있있어어어 AAAGGG444999000의의의 효효효과과과 iiinnnvvviiitttrrrooo... 손상 치유 모델로 성상세포의 이동변화를 vitro상에서 관찰하였다. 성상세포는 손상받은 부위로의 이동과 증식을 한다고 알려져 있으며,본 결과는 이를 토대로 평평하게 잘 자란 성상세포에 scrath작은 흠집을 내어 그 곳으로의 성상세포의 이동을 관찰하였다. 그 결과 시간이 지남에 따라 24시간뒤 immunohistochemistry을 한 결과 증식이 거의 일어나지 않았던 MS에서는 성상 세포의 이동이 일어나지 않음을 확인 하였고 1%serum 약간의 이동이 일어남을
볼 수 있었고,10%serum 경우는 손상부위가 대부분의 성상세포로 차있음을 보 았다.이에 더해 AG490이 이러한 성상세포이동에 어떠한 영향을 미치는지를 알 아 보기위해 AG490농도별(3μM, 10μM, 30μM)을 각각 MS, 1%serum ,10%serum 에 30분 전처리를 하여 24시간 뒤 염색을 한 결과 AG490(10μM,30 μM)의 높은 농도에서 성상세포의 이동이 억제됨을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과 뇌손상 시 AG490이 성상세포의 이동을 억제하며,또한 증식을 억제함을 앞의 결과와 함께 볼 수 있다(Fig.8).
FFFiiiggg...666...CCCooorrrtttiiicccaaalllsststtaaabbbwwwooouuunnnddidiinnnvvvooolllvvveeessbsbbrrreeeaakakkdddooowwwnnnooofffttthhhbbblllooooooddd---bbbrrraaaiiinnnbbbaaarrrrrriiieeerrr...
ICR micereceivedanintrajugularinjectionof100㎕ of2% Evan'sblue20min before receiving a cortical stab wound. Two hours later, animals were perfused,andthebrainwasremoved.
FFFiiiggg...77.7.. EEEffffffeeeccctttsss ooofff AAGAGG444999000 ooonnn ttthhheee wwwoououunnnddd mmmooodddeeellliiinnn vvviiivvvooo... GFAP immunohistochemistry was performed on brian sections from ICR mice 5d after.AG490(5mg/kg)pretreated 4h beforenitrocellulosefilterinsertion and postreated 3dafternitrocellulosefilterinsertion.Animalswerekilled 5dafter insertionandperfused,andbrainsweresectionedat20μm.
FFFiiiggg...888...EEEffffffeeecccttstssooofffAAAGGG449499000ooonnnaaasssttrtrrooocccyyyttteeemmmiiigggrrraaattitiiooonnniiinnvnvviiitttrrrooo...A monolayerof astrocytes was wounded by scratching. Before scratching, AG490 (30μ M)pretreated for 30min with MS,1% serum,10% serum.After24h,Cells were immunohistochemistry.Photos show the migration ofastrocyte to the woundareaat0hand24h.
I
I
IV
V
V.
.
.고
고
고 찰
찰
찰
본 연구는 뇌 손상 시 성상세포의 과도한 증가가 신경계복구를 방해하는
glia scar 형성한다는 것에 초점을 맞추어 이를 억제하는 신호전달경로가
JAK/STAT통해서 일어나는지를 관찰 하였다.본 실험에서는 다양한 신경 손상
시 유발되는 성상세포의 증식과 활성화 변화를 vivo와 vitro상에서 GFAP 와
BrdU 통해 확인하였고,또한 성상세포가 손상부위로의 이동을 vitro에서 wound
healing model(손상 치유 모델)에서 관찰하였다.그 결과 성상세포의 이동과 증 식에 AG490이 관여함을 볼 수 있었다. 성상세포는 신경계 환경을 조성하는 중요한 역할을 하며,뇌 손상 시 성상세 포의 증식과 활성화는 된다는 것은 이미 많은 뇌질환에서 보고 된 바 있다.그러 나 이러한 성상세포의 변화가 신경계를 보호(Faulkner등,Bush등 1999)하는지 반대로 신경계의 복구를 방해하는지(Di,Giovanni등,2005:Raghupathi등,2004: McGraw 등,2001)에 대해서는 아직까지 의견이 분분하다. 신경계 손상 시 활성 화된 성상세포는 그 숫자와 크기가 늘어나는데 이때 GFAP 발현 또한 증가한다 (Eng LF 등 1994). Vivo 상에서 GFAP 증가를 가진 성상세포의 경우 일반 성상세포보다 이동과 증기에 있어 변화를 가져오게 되며,이렇게 활성화된 성상 세포가 여러 가지 큰분자들을 발현이 증가한다는 보고가 있다.이러한 활성화를 좋은 면에서 보면 증가된 proteases와 proteaseinhibitors들이 세포외의 matrix
를 복구하는데 도움이 될 수 있으며,또한 성상세포에서 분비되는 cytokine이
면역반응과 염증반응에 중요한 조절자로 작용할 수 있으며,Blood brain barrier
를 형성하는데 중요한 작용을 한다.Neurotropicfactors,transporter분자와 효 소는 excitotoxicaminoacids의 대사 또는 antioxidant경로에 있어 도움을 주어 신경세포를 보호한다(TacconiMT 등 1998).그럼으로 이러한 성상세포의 손상은 신경계 기능이상을 악화시킬 수 있다는 견해도 있다.그러나 이러한 가설들은 좀 더 정확한 분석이 필요하며,성상세포의 손상측면이 아니라 정상상태와 비교하였
을 경우,과도하게 증가된 성상세포의 경우 gliascar가 형성함으로 신경세포의 기능,신경재생 그리고 axonal재생성을 방해한다는 보고는 많이 알려져 있으
며,또한 성상세포가 활성화될 때 염증반응을 일으키는 물질인 prostagliadin 분
비하며,활성산소와 cytokine을 분비하여 neurotoxic하게 작용하여 신경세포사
멸을 유도한다.
뇌 손상 시 뇌혈관장벽이 깨져 외부환경으로부터 여러 물질들이 유입되는데
이때 다량으로 유입되는 thrombin이 성상세포의 증식을 현저히 증가시킨다는 보
고(Sorensen 등,2003;Wang 등 2002)가 있었으며,본 연구 또한 이와 같은 결 과를 vivo와 vitro상에서 얻을 수 있었다.Thrombin 의 경우 안정 시 뇌 안에
소량 존재하며,낮은 농도에서는 성상세포의 증식을 자극하지만,고농도(10U/ml)
경우 오히려 세포사를 유도한다는 보고가 되어있다(Danovan 과 Cunningham,
1998;Nishino등 1993).그 농도가 뇌에 있어 중요함을 알 수 있다.그럼으로 본
연구에서 또한 이러한 농도를 고려하여 성상세포를 적절하게 증식시키는 조건에
서 실험하였다.이렇게 thrombin 에 의한 성상세포의 증가 경로로는 thrombin
receptor로 G-protein-coupledreceptor인 PAR-1이 작용하며,주된 경로로 ERK 1/2가 활성화되어 성상세포의 증식이 일어난다는 보고가 되어있으며(Wang 등, 2002:Nicole등,2005),JAK 은 minor하게 작용한다고 보고가 있다.또한 평활 근 세포에서 thrombin에 의해 G-protein-coupledreceptor가 활성화 되며 이는 JAK과STAT을 인산화시키고 STAT이 DNA에 붙어 gene를 조절한다(Bhat등 , 1994;Rodriguez-Linares등,1994)는 보고를 토대로 본 연구에서는 성상세포의 증식이 JAK pathway를 경유하는지를 확인하기 위해 JAK2저해제로 잘 알려진 AG490을 통해 성상세포의 증식양상을 확인하였다.AG490의 경우 성상세포에서
H2O2의한 세포사를 강하게 막는다는 보고가 최근에 보고 되었으며,ROS 가 세
포의 증식을 증가시킨다는 연구가 알려진바 있다(Madamanchi등,2005).또한
더불어 성상세포에서 Thrombin에 의해 ROS 증가에 한다는 보고를 토대로 본
할 것으로 유추하여,실험을 수행하였다.결과 실지는 않았지만,성상세포에서
AG490이 antioxidant로써 작용하여 ROS를 감소시킴을 볼 수 있었다.또한 성
상세포의 증식을 조절함으로써,성상세포의 활성화와 증식을 감소시킴을 관찰할 수 있었다.
실험동물모델을 이용한 corticalstabwound에서 성상세포의 증식과 활성화가
thrombin 수용체인 PAR-1 의해 일어난다는 보고가 있었으며(Nicole 등,2005) PAR-1이 억제되었을 경우 이러한 성상세포의 활성과 증식이 감소됨을 보고하였 다.본 실험에서는 앞에서 언급한 corticalstabwound모델을 이용하여 성상세 포의 활성화에 JAK2 저해제인 AG490 이 미치는 영향을 관찰하였다.그 결과 wound를 준 경우 GFAP 의 증가가 확연하게 나타났으며,그러한 성상세포의 활 성이 AG490의해 현저히 감소됨을 볼 수 있었다.성상세포는 또한 손상부위로 이 동하여 손상부위의 치료와 영양공급을 해주는 것으로 알려져 있지만,과도하게 활성화된 성상세포의 손상부위로의 이동은 오히려 염증반응을 초래 또한 세포사 를 유발하며 신경세포독성으로 작용한다. 성상세포는 손상부위로의 이동률이 밀 도의존적인 성상세포의 특징을 고려하였을 때 별 다른 의의를 갖지 못함과,증식 의 경우 손상부위(scratching)의 성상세포가 유의성 있게 증가함이 보고 된 바 있다(Kornyei등 2000). 본 실험에서 또한 scratching성상세포에 이동에 있어 AG490이 관여하는지를 보 고자 하였으며,그 결과 AG490이 앞서 결과와 더불어 성상세포의 이동을 억제 함을 볼 수 있었다.이렇게 성상세포는 뇌 손상 시 이동과 증식을 하며 신경계 의 환경을 중요하게 조절하고 있음을 알 수 있다. 본 연구는 신경계 손상과 재생에 있어 매우 중요하게 작용을 할 것으로 생각되 어지는 성상세포의 증식과 활성에 영향을 주는 인자를 밝힘으로써 이러한 신경 계의 기능과 역할을 알아보고 이를 바탕으로 신경계의 손상을 감소시키며,재생 방안을 찾고자 하는데 의의가 있다.특히 AG490이 매우 다양하게 신경계 보호적 으로 작용한다는 것을 토대로 이를 사용하여 실험을 하였다.성상세포의 활성화
의 명확한 기능을 파악하고 이러한 기능을 조절하는 기전을 밝힘으로써 신경계 의 손상과 재생에 있어 성상세포가 어떠한 연관이 있는지를 알아 보아야 할 것 이다.
Ⅴ
Ⅴ
Ⅴ.
.
.결
결
결 론
론
론
본 실험에서는 다양한 신경 손상 시 유발되는 성상세포의 증식과 활성화
변화를 vivo와 vitro상에서 GFAP 와 BrdU 통해 확인하였고,또한 성상세포가
손상부위로의 이동을 vitro에서 woundhealing model(손상 치유 모델)에서 관찰 하였다.
성상세포에 증식에 실험결과 vitro 상에서 성상세포는 serum 의존적이게 증
식이 증가하는 양상을 볼 수 있었으며,serum 없는 상태에서는 증식이 멈춘 상 태를 보였으며,또한 이러한 serum 에 의한 증식을 배제한 MS 상태에서 thrombin 농도별(0.3U/ml,1U/ml,3U/ml)로 처리시 thrombin(1U/ml)부터 유의성있게 성상세포의 증식이 일어남을 확인하였다.이렇게 증가된 성상 세포의 증식이 JAK2 저해제인 AG490처리시(3μM,10μM,30μM)농도의 존적으로 증식이 감소함을 볼 수 있었다.
Cortical stab wound model에서 또한 손상으로 인한 성상세포의
GFAP의 증가를 AG490이 현저하게 감소시킴을 확인함으로써,성상세포 의 증식과 활성에 AG490이 관여한다는 것을 알 수 있었다.
Scratching 으로 wound를 준 in vitro 에서도 성상세포의 이동성과 증 식을 볼 수 있었는데,이 결과 역시 성상세포의 이동에 있어 AG490이 억 제적 역할을 함을 관찰 할 수 있었다. 이를 통해 성상세포의 활성과 증식 그리고 이동에 AG490이 억제적 역할을 하고 있음을 알 수 있었다.이렇게 신경계의 손상의 일으키는 조 건에서 성상세포의 억제는 염증반응을 억제하며,신경계 재생 하는데 있 어 중요한 역할을 할 것이라 생각되어 진다.
참
참
참 고
고
고 문
문
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-ABSTRACT-Effect
Effect
Effect
Effect of
of
of
of AG490,
AG490,
AG490,
AG490, Known
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Known
Known as
as A
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as
A
A
A JAK2
JAK2
JAK2 inhibitor
JAK2
inhibitor
inhibitor
inhibitor
on
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on
on Astrogliosis
Astrogliosis
Astrogliosis
Astrogliosis
Ki-Young Ko
Departmentofmedicalsciences TheGraduateSchool,Ajou University
(Supervised by ProfessorEun-Joo Baik)
After brain injury such as trauma or stroke, astrocytes undergo proliferation and activation which ischaracterized by increased expression of GFAP.Although reactive astrocytes have some regenerative properties,the astrogliosisisthoughttobeabarriertorepair.Theactivation ofastrocytes which secrete many types of cytokines and inflammatory mediators is inhibited by AG490,and JAK2 pathway mightbeassociated with activation ofastrocytes. In presentstudy,itis investigated thateffectofthe JAK2 inhibitiononthrombin-inducedastrocyteproliferation.
In primary astrocyteculturesobtained from postnatal1 day mice,the proliferation wasinduced by thrombin (1U/ml)asmitogenicactivator,which can be in-flowed in the brain through the breakdown ofthe blood-brain barrier. AG490 (3-30 uM) significantly reduced the proliferation in dose-dependentmanner.However,otherJAK2 inhibitoris notshowed like this.Inwound-healingmodel,theproliferationofastrocytesandmigrationare reduced by AG490.In corticalstab wound vivo model,AG490 dramatically reduced astrogliosisand astrocyteactivation.Taken together,itissuggested thatAG490canmitigatetheastrogliosisJAK2-independently.
