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i - 국문요약 -
흰쥐 백질 뇌졸중 모델 및 희소돌기교세포 재생 분석 시스템
구축
사람은 다른 동물과 다르게 대뇌의 많은 부분을 백질이 차지하고 있다. 이러한 이유로 백질에서 뇌질환 발생빈도가 높다. 그 중에서도 피질하 백질 뇌졸중(subcortical white matter stroke)은 뇌졸중의 한 형태로 치료방법에 대하여 알려진 바가 매우 미미하다. 뇌졸중에 따라 현상과 치료방법에 대해 여러 가지의 동물 실험이 진행되고 있지만 대부분 회색질의 손상 모델을 이용하고 있다. 우리는 효과적으로 흰쥐에서의 피질하 백질 뇌졸중 모델을 재현하기 위해 endothelin-1(ET-1)이라는 혈관 수축제를 이용하였다. ET-1의 주입은 혈관수축에 따 른 혈류흐름의 장애를 일으킨다. 이러한 ET-1을 대뇌의 피질하 백질에 국소적인 주입을 통해 사람에게서 나타나는 피질하 백질 뇌졸중과 유사한 형태의 병변을 만들 수 있었고, 백질의 병변 발생의 주 원인으로 알려진 탈수초화의 진행에 대 한 특징도 MRI와 조직염색을 통해 확인하였다. 이렇게 형성된 병변에 GFP를 발현하는 레트로바이러스를 주입한 후, 조직염색 을 통해 GFP를 병변의 세포가 발현하고 있음을 확인할 수 있었다. 나아가 GFP 를 발현하는 일부 형질전환 된 세포에서 희소돌기 전구체 세포가 희소돌기 전구 체 세포의 표지자를 같이 나타내고 있음을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 향후 유전자치료를 통한 백질 뇌졸중에서 희소돌기교세포 재생 치료 효과를 검 증할 수 있는 시스템을 구축하였다. 핵심어: 백질 뇌졸중, Endothelin-1(ET-1), Olig1, Olig2, 희소돌기교세포,
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차 례
국문요약 ··· ⅰ 차례 ··· ⅱ 그림 차례 ··· ⅲ Ⅰ. 서론 ··· 1 Ⅱ. 재료 및 방법 (혹은 연구대상 및 방법) ··· 3 A. 연구대상과 수술방법 ··· 3 B. 조직공정과 염색 ··· 5 C. 레트로바이러스 구조와 생산 ··· 5 D. FACS를 이용한 레트로 바이러스 적정 ··· 6 E. 웨스턴 블롯 (Western blot) ··· 6 F. 통계 ··· 6 Ⅲ. 결과 ··· 8 A. Endothelin-1을 이용한 백질 탈수초화 병변의 생성 ··· 8 B. Olig 전사인자를 발현하는 레트로바이러스 ··· 12 C. pIRES-eGFP-CL 레트로바이러스 주입에 의한 변화 ··· 14 Ⅳ. 고찰 ··· 19 Ⅴ. 결론 ··· 21 참고문헌 ··· 22 ABSTRACT ··· 24iii
그림 차례
Fig.1. Experimental protocol ··· 4 Fig.2. Confirmation of lesion site induced by ET-1 in the right IC
··· 9
Fig.3. 3D images of lesion induced by ET-1 ··· 11 Fig.4. Retroviral vector construction and production of recombinant Olig
transcription factors ··· 13 Fig.5. Decision of pIRES3-eGFP-CL retrovirus injection time after ET-1 injection. ··· 15 Fig.6. Confirmation of GFP expression site after ET-1 injection. ··· 16 Fig.7. Injection of GFP expressed retrovirus solution into the
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I. 서 론
사람의 대뇌는 다른 동물과는 다르게 백질이 회색질보다 높은 비율을 차지하
고 있다(Emma 등, 2009). 이러한 대뇌의 백질은 뇌졸중을 일으키데 있어 높은 부 분을 차지하며, 백질에서 발생하는 피질하 백질 뇌졸중(subcortical white matter stroke)은 전체 대뇌 허혈성 뇌졸중의 20-25%를 차지하고 있다(Arakawa 등, 2006). 이와 관련된 병변은 대뇌의 깊숙한 내부의 피질하 백질 부위에서 크기가 작은 형태로 나타난다(Norriving 등, 2003). 백질 뇌졸중의 주요 원인은 병변 부위의 축 삭이 탈수초화(demyelination)를 일으키는 것으로 알려져 있으며(Young 등, 2008), 이에 따라 대뇌 피질과 피질 내부 구조 사이의 신경계와 관련된 연결 구조의 이 상을 유발하며 이는 인지장애와 행동장애를 일으키게 된다. 백질 뇌졸중은 다른 뇌혈관질환과 마찬가지로 나이가 많아지면 발생빈도가 급증한다. 그러나 이전 실 험들은 사람에서 발생하는 백질 뇌졸중과는 다르게 백질 손상 모델을 갓 태어난 어린 흰쥐를 이용하거나(Hagberg 등, 2002), 시신경이나 척수 손상 모델 등을 이용 하여 실험을 진행하였다(Farkas 등, 2004). 대뇌를 이용한 실험에서도 주로 사용 되는 흰쥐는 사람과는 다르게 회색질이 대뇌에서 높은 비율을 차지하기 때문에 대부분의 실험이 회색질 관련 뇌졸중 모델을 이용한 실험에 집중되었다. 또한 사 람의 병변이 백질에서 국소적으로 형성되는 것과 다르게 동물 실험에는 병변이 크게 만들어지고 이에 따라 백질 이외에도 회색질까지 손상이 동반되어 실제적 으로 피질하 백질 뇌졸중을 재연하는데 어려움이 있다. 우리는 이 실험에서 최근에 백질 뇌졸중을 재현하는데 있어 주목 받고 있는 endothelin-1(ET-1)이라는 혈관수축제를 이용하였다. ET-1을 주입하게 되면 주입된 부분의 혈관 수축을 일으켜 혈류 흐름을 방해함에 따라 병변을 유도하게 된다 (Fuxe 등, 1992). 이러한 ET-1을 흰쥐의 내포에 국소적이면서 직접적으로 주입하 는 방법으로 실험을 진행하였으며 내포는 대뇌피질에서 중뇌로 연결되어 있으며 신경세포의 축삭 다발이 지나가는 부분으로 효과적인 병변 재현과 함께 행동장
2 애까지 재현이 가능할 것으로 생각되기 때문이다. 이러한 모델은 일반적으로 사 람에게 나타나는 피질하 허혈성 뇌졸중 모델과 유사한 병변의 탈수초화를 효과 적으로 재현할 수 있었다(Frost 등, 2006; Clotilde 등, 2008). 신경축삭의 수초화는 희소돌기세포에 의해 좌우되는 것으로 알려져 있다. 이러 한 희소돌기 세포는 전사단계에서의 조절이 중요한 것으로 알려져 있으며 (Dugas 등, 2006), 이중에서도 Olig1과 Olig2라는 전사인자가 희소돌기세포의 분화 와 성장에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Zhou. 등, 2002). 이러한 이유 로 탈수초화 관련된 질병의 치료방법의 하나로 희소돌기 세포의 재생에 관한 연 구가 진행되고 있으며 이전 실험에서 척수 손상 모델의 흰쥐를 이용하여 분화하 는 희소돌기 전구세포에 증식을 촉진하는 Olig 유전자를 레트로바이러스를 이용 하여 과발현시킬 때의 병변에서의 변화를 관찰하였다. 이 실험을 통해 희소돌기 전구 세포들의 분화능이 향상되는 것은 물론 희소돌기세포로 성장과 함께 기능 까지 회복되는 것을 알 수 있었다(Kim 등, 2011). 우리는 이러한 결과를 바탕으로 ET-1의 주입을 통해 만들어진 대뇌 백질 뇌졸 중 모델을 만들고, Olig 유전자의 과발현을 통해 탈수초화가 일어난 병변에서 희 소돌기세포의 재생이 일어나는지에 대한 실험을 진행할 수 있도록 시스템을 구 축하고자 하였다.
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Ⅱ. 연구대상 및 방법
A. 연구대상과 수술방법본 실험은 체중 200-250g의 Sprague-Dawley 수컷 쥐를 사용하였다. 동물은 chloral hydrate (400mg/kg)을 복부 주사를 통해 주입하여 마취시킨 후, stereotaxic frame에 동물을 올린 후, 드릴을 이용하여 두개골에 구멍을 만든다. 이 후, 28-gauge 바늘을 사용하여 오른 쪽 내포 (internal capsule, IC) (posterior, 1.8 mm to bregma; lateral to midline, 3.0 mm; ventral from brain surface, 8.0 mm, 각도 90°)에 혈관
수축제 ET-1을 0.5ug/ul 농도로 분당 0.5ul씩, 총 2ul을 주입한다(Fig. 1). 주입이 끝
난 후 15분 동안 바늘을 제자리에 둔 후 제거한다. 그리고 ET-1을 주입한 하루 후, 5ul의 TNE(50 mM Tris-HCl [pH 7.8], 130 mM NaCl, 1 mM EDTA) 용액에 녹여있
는 레트로바이러스 용액(1×106 TU/ml)을 25분 동안 주입한다. ET-1을 주입한 날을
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Fig.1. Experimental protocol. (A) The stereotaxic injection was performed to avoid tracking of ET-1 into the ventricle. (B) The sequence of the surgery.
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B. 조직공정과 면역형광 염색
동물은 chloral hydrate를 이용하여 마취를 한 후, PBS를 이용하여 피를 제거하고 4% paraformaldehyde를 이용하여 고정 후, 뇌를 분리한다. 분리한 뇌는 하루 동안 4% paraformaldehyde에서 다시 고정 과정을 거치고 30% sucrose에 담근다. 이 후, 20um의 두께로 조직의 절편을 만들고, SuperFrost Plus 슬라이드 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, U.S.A)위에 놓는다.
면역형광 염색을 위해 조직 절편이 놓여있는 슬라이드는 일차항체를 4°C에서
하루 동안 놓은 후, 이차 항체에 붙어있는 Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor 594
(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 실온에 놓는다.
GFP는 anti-GFP (chicken polyclonal; 1:500; Millipore #AB16901)를 통해 확인한다. GFP를 발현하는 세포의 특징은 이와 같은 일차 항체를 통해 확인한다: anti-NG2 (rabbit polyclonal; 1:500; Millipore #AB5320), anti-APC-CC1 (mouse monoclonal; 1:250; Calbiochem #OP80, La Jolla, CA), anti-PDGFRa, anti-MBP(rat monoclonal; 1:200; Abcam
#ab7349, Cambridge, UK). 이러한 항체들은 세포의 특징적인 모양을 통해 면역반
응과 조직 내에서의 분포 등을 알 수 있다. 또한 병변의 발생 위치와 정보를 확
인하기 위해 eriochrome cyanine(ECRC)과 cresyl violet(CV) 염색을 실시한다.
C. 레트로바이러스 구조와 생산
재조합 레트로바이러스의 벡터는 bicistronic 레트로바이러스성 벡터인 초록색
형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP)을 발현하도록 만들어진
pIRES-eGFP-CL를 이용하여 만든다(Park 등, 2006). 이러한 벡터를 이용하여 총 길이의 Olig2 cDNA(Dr. Takebayashi, Okazaki, Japan)를 이용하여 이를 발현하는 벡터 (pOlig2-IRES-eGFP)를 만든다. 이렇게 만든 벡터에 Olig1을 같이 발현시키기 위해 Olig1
을 IRES와 붙인 후, pOlig2-IRES-eGFP에 삽입하여 pOlig1/2-IRES-eGFP를 만든다.
레트로바이러스를 만들기 위해 human 293-derived retroviral packing cell line
(293GPG)를 사용하였다. 293GPG는 vesicular stomatitis virus G(VSV-G)를 발현하는 세포주로 VSV-G 단백질은 많은 포유동물은 물론 그렇지 않은 여러 가지 동물의
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in vivo 형질도입 실험에서 중요한 것으로 알려져 있으며 생리활성의 손실 없이
높은 농도의 레트로바이러스를 생산하는데 또한 중요한 역할을 하는 것으로 알
려져 있다(Daniel S.O. 등, 1996). 이러한 293 GPG 세포에 Lipofectamine 2000
(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 세포에 형질전환 도입을 실시한 후, 72시간 후부터 세포 배양액을 이틀에 한 번씩 모아 –70℃에 보관한다. 모아놓은 상층액 은 50,000 g for 90 min at 4°C에서 원심분리 후, 상층액은 제거하고 TNE 용액에 녹 여 역시 –70℃에 보관한다.
D. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)를 이용한 레트로바이러스 적정
0.2 x 105 HeLa 세포를 12well 세포배양용기에서 키운 후, 24시간 후, 1/3의 연속
적으로 희석한 바이러스 용액을 세포배양액과 희석한다. 72시간 후, PBS를 이용해
서스펜션 시켜 FACSVantage SE System (BD Bioscience, San Jose, CA)를 이용하여
GFP 발현 정도를 측정한다.
E. 웨스턴블롯 (Western blot)
형질전환 된 벡터의 Olig1과 Olig2의 발현을 확인하기 위해 HEK 293T 세포에
형질전환 후, 단백질을 T-Per 용액(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 분리한다. 같은
양의 단백질을 PAGE를 이용하여 분리한 후, PVDF membrane (Millipore)에 옮긴다. 5% 탈지유(skim milk)를 이용하여 블로킹을 진행한다. 일차 항체로 anti-Olig1(mouse polyclonal; 1:500; Santa cruz), anti-Olig2 (rabbit polyclonal; 1:2000; IBL #18953), anti-GFP (rabbit polyclonal; 1:3000; Millipore #AB3080)을 이용하여 4℃에서 하루 동안 보관 후, 항체를 씻어낸다. 이차 항체는 실온에서 1시간 30분 동안 보 관 후 chemiluminescence detection reagent (America Bioscience, Arlington Heights, IL)를 이용하여 확인한다. 이 후 β-actin을 이용하여 다시 단백질의 발현을 확인한다.
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모든 통계 분석은 PRISM 5.0 statistical software package (Graphpad, Inc., San Diego, CA)를 이용한다.
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Ⅲ. 결과
A. Endothelin-1(ET-1)을 이용한 백질 탈수초화 병변의 생성 ET-1을 오른쪽 내포에 주입하고 7일 후에9.7T MRI를 통해 내포 내의 변화를 확인해 보았다 (Fig. 2-A). 그 결과 왼쪽 내포와는 다르게 오른쪽 내포에 흰색의 병변이 나타난 것을 확인할 수 있었다. 발생된 병변에 대해 자세히 알아보기 위 해 먼저 ECRC와 CV 염색을 시행하였다 (Fig. 2-B,C). 염색결과 왼쪽 내포와는 다 르게 ET-1이 주입된 오른쪽 내포에서 수초를 염색하는 ECRC의 발현에 차이가 있는 것을 통해 백질의 탈수초화를 확인하였다. 신경세포의 수초를 형성하는데중요한 역할을 하는MBP(myelin basic protein)를 이용하여 탈수화를 다시 한번 더 시행하였다 (Fig. 2-B’-C’). 마찬가지로 ET-1의 주입을 통해 만들어진 오른쪽 내포
의 병변에서 왼쪽 내포와는 다르게 MBP의 발현 정도가 낮은 것을 확인할 수 있
었다. 이러한 결과를 통해 ET-1의 주입은 탈수초화된 병변을 만드는데 효과적인
역할을 하는 것을 알 수 있었다. 또한 이렇게 형성된 병변이 내포에서 어느 정도
크기로 존재하는지 Neurolucida (MBF Science, Willston,U.S.A)를 이용하여 3D 사진
을 만들어 확인해 보았다. ET-1에 의해 유도된 병변의 크기는 약 0.19mm3이며 전
체 내포의 4.5% 정도 차지하는 것을 알 수 있었다 (Fig. 3). 이러한 결과를 통해 ET-1의 주입은 이는 사람에게서 나타나는 피질하 백질 뇌졸중과 유사하게 흰쥐
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Fig.2. Confirmation of lesion site induced by ET-1 in the right IC. (A) Ischemic damage was performed by MRI 9.4 images (7days). (B-D) Representative images of
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eriochrome/cresyl violet stained sections. (C) Right IC formed demyelinating lesion by injecting ET-1. (D) left IC that was not injected using ET-1 did not form demyelinating lesion. Scale bars indicate 1mm. (C’-D’) Representative images of MBP stained section. (D’) Demyelinating lesion induced by ET-1 in the right IC was not stained with MBP. Scale bars indicate 100㎛. White line indicated lesion.
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Fig.3 3D images of lesion induced by ET-1. (A-A’’’)The blue color indicates total right internal capsule and the red color indicate demyelinating lesion. (B) Average of the lesion size is about 0.19mm3 (N=5).
12 B. Olig 전사인자를 발현하는 레트로바이러스 레트로바이러스의 형질도입을 쉽게 확인할 수 있는 GFP 리포터 유전자를 가지 고 있는 벡터를 사용하여 실험을 진행하였다. 이전 실험에서 Olig2 유전자만은 과발현하게 되면 신경교종(glioma)를 만드는 것을 확인할 수 있었으며, Olig1만을 발현하게 되면 Olig1과 Olig2를 같이 발현하는 것보다 희소돌기세포의 분화능과 재생의 향상 정도가 낮기 때문에(Kim 등, 2011) Olig1과 Olig2를 같이 발현하는 레 트로바이러스를 만들었다. Olig2를 갖고 있는 pOlig2-IRES-eGFP 벡터에 Olig1의
보다 효율적인 발현을 위한 IRES프로모터(promoter)를 연결하여 IRES-Olig1 유전
자를 만들어 넣어 두가지의 Olig 유전자와 함께 GFP를 발현할 수 있는 레트로바
이러스 벡터를 만들었다. 이렇게 만들어진 각각의 벡터에서 각각의 유전자가 제 대로 발현하고 있는지 웨스턴 블롯을 통해 확일 할 수 있었다(Fig. 4).
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Fig.4. Retroviral vector construction and production of recombinant Olig transcription factors. (A) Recombinant retroviral vector construction. (B) Expression of Olig proteins in HEK 293T cell by transduction of recombinant retroviral vector. (GFP: pIRES-eGFP-CL, Olig2: pOlig2-IRES-eGFP, Olig1/2: pOlig1/2-IRES-eGFP)
14 C. pIRES-eGFP-CL 레트로바이러스의 주입에 의한 변화 기본이 되는 pIRES-eGFP-CL 벡터를 이용하여 만든 레트로바이러스가 흰쥐에 서의 발현 여부와 효과적인 GFP 발현 시기를 결정하기 위한 실험을 진행하였다. 먼저 ET-1을 주입 하여 병변을 만든 후, ET-1을 주입한 시간을 기준으로 레트로 바이러스를 같은 날, 하루 후, 이틀 후의 세가지 조건을 가지고 각각 시간에 레 트로바이러스를 주입하였다. 이 후 ET-1을 주입하고 난 7일 후, 모든 동물에서 대뇌를 분리 후 GFP 발현 정도에 어떤 차이가 있는지를 확인하였다. 그 결과, ET-1과 동시에 레트로바이러스를 주입한 경우는 GFP 발현 정도가 매우 낮았다. 이에 반해 하루 후에 레트로바이러스를 주입했을 때는 GFP 발현 정도가 월등히 높아진 것을 확인할 수 있었으며, 이틀 후에 주입한 경우에서는 동시에 주입했을 때보다는 발현 정도가 높았으나, 하루 후에 주입한 경우보다는 발현 정도가 낮게 나타났다. 이러한 이유로 ET-1을 주입하고 하루 후에 레트로바이러스를 주입하는 실험조건을 설정하였다 (Fig. 5). 이를 토대로 ET-1을 주입을 통해 병변을 만들고 하루 후, pIRES-eGFP-CL 레트 로바이러스를 주입하게 되면 병변의 세포에서 GFP가 발현하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 6). 이렇게 GFP가 발현하는 세포에 어떠한 변화가 일어나는지를 확 인하기 위해 NG2와 APC-CC1을 같이 염색을 실시하였다. 그 결과 GFP를 발현하 는 세포의 약 40%가 NG2를 같이 발현하는 것을 확인할 수 있었다. APC-CC1 역 시 약 25%가 같이 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 희소돌기세포로 성장이 가능한 전구세포일 가능성이 있는 세포에 레트로바이러스가 형질 도입된 것을 알 수 있었다. 그러나 PDGFRa로 확인할 경우 GFP를 발현하는 세포와 같이 발현하는 것을 확인 할 수 없었다 (Fig. 6).
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Fig.5. Decision of pIRES3-eGFP-CL retrovirus injection time after ET-1 injection. These confocal images revealed GFP expression level. Retrovirus injected (A) at the same day, (B) at the 1 day and (C) at the 2 days after ET-1 injection. Scale bars indicate 100㎛.
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Fig.6. Confirmation of GFP expression site after ET-1 injection. Representative confocal images indicate (A) MBP, (B) GFP, (C) merge. (A,C) White line is standard of lesion. Box region in (C) are magnified in Fig.7. Scale bars indicate 100㎛.
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Fig.7. Injection of GFP expressed retrovirus into the demyelination lesion induced by ET-1. Representative images of GFP+ cells (B,E,H) in the sections from oligodendrocyte
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progenitor cell (OPC) marker NG2 (A). Others OPC markers PDGFRa(D). Mature oligodendrocyte marker APC-CC1 (G). (J) Quantification of the percentage GFP+ cells that expressed the cell-type specific markers at 7-day after ET-1 injection. Arrows indicate the GFP+ cells expressing corresponding cell-type specific markers. Scale bars indicate 50㎛.
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Ⅲ. 고찰
본 실험에서 혈관 수축제인 ET-1의 주입을 이용하여 흰쥐에서 뇌졸중 모델을 만들었다. 이러한 동물 모델은 MRI 사진 결과와 조직염색을 통해서 사람에게서 나타나는 허혈성 백질 뇌졸중 모델과 유사한 형태를 나타내는 것까지 확인할 수 있었다. 이렇게 만들어낸 병변을 3D rendering 하게 되면 내포 내의 병변의 위치 와 크기를 쉽게 알아볼 수 있었다. 그러나 백질 뇌졸중은 사람에게서 이차적으로 인지장애나 행동장애를 유발한다(Schmidt 등, 2007). 하지만 우리의 실험에서는 이 전(Frost 등, 2006) 과 다르게 ET-1을 주입 후 특이적인 행동장애를 관찰할 수 없 었으며 변화의 정도가 나타나더라도 하루나 이틀은 손가락 운동에 이상이 있는 것을 확인할 수 있는 정도였으며 시간이 지날수록 자연스럽게 치유되는 것을 볼 수 있었다. 이를 위해서는 ET-1의 증가시키는 등의 변화나 내포의 주입 깊이나 주입의 정확성을 높이는 등의 변화를 통해 주입함으로써 사람의 백질 뇌졸중과 보다 유사한 형태의 모델을 만든 후, 실험을 진행하게 되면 뇌졸중 치료방법 연 구에 보다 효과적인 결과를 얻을 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 ET-1의 농도 를 무조건 높이는 것은 한정적인 흰쥐의 대뇌에서 병변의 크기만 커지면서 백질 이외의 주변 조직에 영향을 미칠 수 있기 때문에 이에 대한 대안에 대한 지속적 인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 레트로바이러스는 더 이상 분화할 수 없는 세포에 형질 도입되는 렌티바이러 스와는 다르게 세포 분화 능력을 가지고 있는 세포에 형질 도입이 가능하다 (Masayoshi 등, 2013). 이에 따라 희소돌기세포로 분열하는 세포에만 원하는 유전 자는 형질 도입시키기 위해 우리 실험에서는 레트로바이러스를 이용하였다. ET-1 을 이용하여 병변을 만든 후 GFP를 발현하는 레트로바이러스를 주입하였다. 그 결과 병변의 세포가 GFP를 발현하는 것을 확인할 수 있었고, GFP(+) 세포는 희 소돌기 전구 세포의 특징을 갖고 있는 표지자와 같이 발현하는 것 또한 확인할 수 있었다. 그러나 희소돌기세포의 표지자인 NG2와 APC-CC1과는 GFP(+) 세포20 와 같이 발현되는 것을 볼 수 있었으나, PDGFRa와는 같이 발현되는 것을 확인할 수 없었다. NG2 는 일반적으로 희소돌기 전구세포의 표지자로 알려져 있으나, 최 근 실험에서 성상세포(astrocyte)에서도 발현하는 것으로 알려져 있다(Xiaoqin 등, 2008). 그렇기 때문에 희소돌기세포의 성장에 관여하는 것으로 알려져 있는 다른 표지자인 PDGFRa로 조직 염색을 추가 진행하였다(Rechardson 등, 1988). 그러나 PDGFRa는 병변 주변에서는 RDGFRa(+)/GFP(-) 세포를 확인할 수 있는 조직과 병 변은 물론 주변에서도 발현을 확인할 수 없는 조직의 경우가 있었으나 GFP와 같 이 발현하는 세포를 볼 수 없었다. 이에 대해 레트로바이러스가 희소돌기세포로 의 분화능을 가지고 세포일 가능성이 있는 세포에 형질 도입된 것을 확인할 수 있었으나, 희소돌기 전구세포일 것이라고 확신하는 데는 어려움이 있을 것으로 생각된다. 이에 재 실험을 통해 RDGFRa의 발현에 차이가 있는지에 대해 여러 가지 가능성을 두고 지속적으로 확인할 필요가 있으며 이외의 다른 표지자로 계 속 확인해야 할 필요가 있다고 생각한다. 마찬가지로 희소돌기세포의 표지자인 APC-CC1는 GFP(+) 세포에서 발현을 통해 역시 희소돌기 관련 세포에 레트로바 이러스가 형질 도입이 되는 경우가 높은 것을 알 수 있었다. 그러나 더 정확한 결론을 위해 다른 교세포 표지자를 이용한 조직 염색을 통한 비교 실험을 계속 진행해야 할 것으로 생각된다. 우리는 이 실험을 통해 레트로바이러스가 병변 부위의 세포로 도입되어 GFP를 성공적으로 발현하는 것을 확인할 수 있었으며 또한 이러한 발현이 희소돌기세 포로의 분화능을 가지고 있을 것으로 예상되는 세포에서도 이루어 지는 것을 확 인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 ET-1을 사용하여 만든 병변에 희소돌기 세 포 재생에 관한 실험을 진행하기 위한 준비를 끝낼 수 있었다.
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Ⅳ. 결론
선행의 연구결과는 척수손상 모델에서 희소돌기세포의 재생이 어떻게 일어나 는지에 대한 것을 알아보았다. 이에 본 실험에서는 사람들에게서 많이 발견되는 백질에서의 허혈성 뇌졸중 모델을 흰쥐를 이용하여 혈관수축제인 ET-1을 통해 효과적으로 재현할 수 있음을 확인할 수 있다. 또한 GFP 리포터 유전자만을 지 닌 바이러스가 일부 희소돌기 전구체 세포일 가능성이 있는 세포에서 발현함을 통해 Olig1과 Olig2 유전자를 지닌 레트로바이러스를 이용한 희소돌기세포의 재 생에 관한 실험에 긍정적인 영향을 미칠 것임을 확인 할 수 있었다.22
참고문헌
1. Arakawa S et al. Ischemic thresholds for gray and white matter: a diffusion and perfusion magnetic resonance study. Stroke 37:1211–1216, 2006
2. Clotilde L et al. Effects of magnesium treatment in a model of internal capsule lesion in spontaneously hypertensive rats. Stroke 39:448-454, 2008 3. Daniel S. Ory et al. A stable human-derived packing cell line for production of
high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:11400-11406, 1996
4. Dugas JC et al. Funtional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J
Neurosci 26(43):10967-83, 2006
5. Emma L. et al. Potential Animal Models of Lacunar Stroke : A Systematic Review, Stroke 40:451-458, 2009
6. Farkas E et al. Experimental cerebral hypoperfusion induces white matter injury and microglial activation in the rat brain. Acta Neuropathol (Berl) 08:57–64, 2004 7. Frost SB et al. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the
rat. Behav Brain Res.169:206–211, 2006
8. Hagberg H et al. Models of white matter injury: comparison of infectious, hypoxic-ischemic, and excitotoxic insults. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 8:30–38, 2002
9. K. Fuxe et al., Involvement of local ischemia in endothelin-1 induced lesions of the neostriatum of the anaesthetized rat. Exp Brain Res. 88:131–139, 1992
10. Kim HK et al. Differential and cooperative actions of Olig1 and Olig2
transcription factors on proliferating glial progenitor cells after contusive spinal cord injury. GLIA 59(7):1094-1106, 2011
11. Masayoshi O et al. Lentiviral and moloney retroviral expression of green fluorescent protein in somatotrophs in vivo. PLoS ONE 8(1):52237-48, 2013 12. Norrving B et al. Long-term prognosis after lacunar infarction. Lancet Neurol.
23
13. Park CH et al. Differential actions of the proneural genes encoding Mash1 and neurogenins in Nurr1-induced dopamine neuron differentiation. J Cell Sci. 119(11):2310-20, 2006
14. Richardson WD et al. A role for platelet-derived growth factor in normal gliogenesis in the central nerve system. Cell 53(2):309-19
15. Schmidt R et al. Progression of leukoarasis and cognition. Stroke 38(9):2619-25, 2007
16. Young VG et al. Neuropathologic correlates of white matter hyperintensities.
Neurology. 71(11):804-11, 2008
17. Xiaoqin et al. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocyte. Development 135:145-157, 2008
18. Zhou et al. The bHLH transcription factors OLIG2 and OLIG1 couple neuronal and glial subtype specification. Cell 109(1):61-73, 2002
24
- ABSTRACT –
Establishment of the white matter stroke model in rats to study
oligodendrogenesis
Jinha Kim
Department of Neuroscience The Graduate School, Ajou University (Supervised by Associate Professor Byung G. Kim)
Subcortical ischemic stroke is a common cause of cognitive dysfunction in the elderly. In this stroke, ischemic injuries to the white matter result in demyelination leading to defective neural connection between the cerebral cortex and subcortical structures. Therefore, repair of the ischemic demyelination by enhancing endogenous oligodendrogenesis would be a plausible therapeutic approach for ischemic stroke. We previously showed that overexpression of both Olig1 and Olig2 transcription factors enhances proliferation of oligodendrocyte progenitor cells and promotes differentiation into mature oligodendrocytes in the injured spinal cord. The present study aims to test a hypothesis that the same approach would improve oligodendrogensis in the white matter stroke model. We have developed endothelin-1 induced white matter stroke model where a localized demyelinative lesion is created in the internal capsule in rats. The ischemic demyelinative lesions were visible animals in 9.4T MR images, allowing us to determine the therapeutic effects in live animals. We have prepared recombinant retroviral vectors containing either Olig1 or Olig2, or both of Olig1 and Olig2 transcription factors. We have confirmed effective in vivo transduction in the endothelin-1 induced white matter stroke model by examining GFP expression as a reporter gene.
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Keyword: White matter ischmic stroke, Olig1, Olig2, Endothelin-1, Oliggodendrocyte, Oligdendrogenesis
