Multiplex-PCR Primer development for close diagnosis of root rot pathogens

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근부병 원인균 정밀진단을 위한 Multiplex-PCR Primer 개발 경기도농업기술원 : 황규현*_{, 김희동, 이해길, 정구현, 안영남, 이정혜}

경희대학교 : 양덕춘

Multiplex-PCR Primer development for close diagnosis of root rot pathogens Gyeonggi-do Agricultural Research & Extension Services

Kyu-Hyon Hwang* , Hee-Dong Kim, Hae-Gil Lee, Gu-Hyun Jung, Young-Nam An and Jung-Hye Lee

Kyung Hee University Deok-Chun Yang 실험목적 재작지내의 병원균의 유무를 신속, 정확, 효율적으로 판별하기 위한 Multiplex-PCR 기법에 활용가능한 Primer 및 PCR용 Primer 를 개발하고자 함. 재료 및 방법 ◦ 실험재료 - 시험재료 : 근부병 발병 토양에서 분리한 병원균

- 대상 병원균 : Cylindrocarpon destructans, Fusarium solani, Pythium ultimum, Rizoctonia solani

◦ 실험방법 - DNA 추출방법

∙ SolGent사의 Genomic DNA Prep Kit(For Animal tissue, Fungi) 사용 - Multiplex-PCR 반응조건

∙PCR mixture는 5pmol primer 2㎕+2㎕, 10ng DNA 1㎕, 2x premix 10㎕, distilled water 5㎕를 혼합하여 total volume 20㎕가 되도록 하였다. PCR 조건은 pre-denaturation 94℃에서 4분, denaturation 94℃에서 30초, annealing 56℃에서 30 초, extension 72℃에서 30초로 33cycle, final extension 72℃에서 7분으로 하였다. 실험결과

◦ 인삼경작지의 주요 병원균인 Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Pythium ultimum, Cylindrocarpon destructans 에 대한 primer set을 2종류씩 개발하였고, 이중 primer set2 (froward 2nd+ Reverse primer)가 좀더 specific하게 band가 형성되었음.

◦ Multiplex-PCR 반응을 위한 적합한 반응조건을 확립함.

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-Fig. 1. PCR amplification of ITS regions. C. destructans, F. solani, P. ultimum, and R. solani Table 1. Combination of primer set of ITS regions

Pathogen Forward Reverse

Rhizoctonia. solani Forward 1

5' -GAA TCA TCG AAT YTT TGA ACG -3'

Forward 2

5' -AAT GTG AAT TGC AGA ATT CAG T -3

5' GAA TGG ACT ATT AGA AGC GGT 3‘

283bp

304bp

Fusarium. solani 5' GCC TGA GGG TTG_{TAA TGA CG 3‘} 85bp

106bp

Pythium. ultimum 5' TTA GCG GGT AGT_{CTG TCT GC 3'} 549bp

570bp Cylindrocarpon. destructans 5' TGC GAG GTG TGC TAC TAC G 3' 190bp 211bp

Fig. 406. PCR amplification using specific primers. M is 1kb DNA ladder